Ultraskaņas DNS fragmentācija nākamajai gen sekvencēšanai
Nākamās paaudzes sekvencēšana (NGS) prasa uzticamu genoma DNS nobīdes un fragmentācijas, lai sekvencētu genoma DNS pavedienus un izveidotu genoma bibliotēkas. Kontrolēta DNS fragmentācija DNS fragmentos ir būtisks paraugu sagatavošanas posms, kas nepieciešams pirms DNS sekvencācijas. Ultrasonication ir pierādīts kā efektīva un uzticama metode noteikta garuma DNS fragmentācijai. Ultraskaņas DNS fragmentācijas protokoli sasniedz reproducējamus fragmentācijas rezultātus. Hielscher ultrasonicators spēj radīt plašu genomisko DNS fragmentu izmēru sadalījumu, kas ir precīzi kontrolējams, izmantojot darbības parametrus. Tā kā Hielscher ultraskaņas DNS bīdes sistēmas ir pieejamas atsevišķiem un vairākiem flakoniem, kā arī mikroplatēm, paraugu sagatavošana kļūst ļoti efektīva.
Ar E. coli EDL933-15 min. ultrasonikācijas palīdzību veikta elektrofohoretisko analīžu analīze. L norāda DNS kāpnes. (Basselet et al. 2008)
- atkārtojami/reproducējami rezultāti
- precīzi regulējams , lai iegūtu noteiktu fragmenta garumu
- ātra apstrāde
- konsekventi DNS fragmentācijas rezultāti
- ierīces jebkādiem paraugu tilpumiem (piemēram, vairāki flakoni vai mikroplates);
- augsta caurlaidspēja
- precīza temperatūras kontrole
- vienkārša, lietotājam draudzīga darbība
Next-Gen Sequencing: Ultraskaņas DNS fragmentācija bibliotēkas sagatavošanai
Lai veiktu nākamās paaudzes sekvencēšanu, jāveic trīs galvenie soļi: 1) bibliotēkas sagatavošana, (2) secība un (3) datu analīze. Bibliotēkas sagatavošanas laikā DNS tiek sadrumstalota, tad fragmenta gali tiek salaboti (pulēti), pievienojot vienu adenīna bāzi, un mērķa fragmenti tiek pārvērsti par dubultslīpju DNS. Visbeidzot, tā sauktie adapteri ir pievienoti ar ligāciju, PCR vai tagmentāciju, lai galīgo bibliotēkas DNS produktu varētu kvantitēt sekvencēšanai.
DNS fragmentācija, izmantojot ultraskaņu: Jo īpaši, ja īsas lasīšanas sekvencēšanas tehnoloģijas, piemēram, Illumina, kas nevar viegli nolasīt garākus DNS fragmentus, DNS stendiem jābūt sadrumstalotiem līdz noteiktam izmēram, ko var droši sasniegt ar ultrasonication.
Ultrasonication var droši izmantot DNS, RNS un hromatīna fragmentācijai.
Kā darbojas ultraskaņas DNS fragmentācija?
Ultraskaņas apstrāde, kas pazīstama arī kā akustiskā paraugu apstrāde, ir plaši izmantota DNS fragmentēšanas metode. Ultraskaņas DNS cirpšanai paraugi tiek pakļauti ultraskaņas viļņiem kontrolētā stāvoklī. Ultraskaņas DNS fragmentācijas darba princips ir balstīts uz ultraskaņas viļņu radītajām vibrācijām un kavitāciju. Bīdes spēki, kas rodas ultraskaņas (akustiskās) KAVITĀCIJAS rezultātā, salauž lielmolekulārās DNS molekulas. Ultraskaņas apstrādes iestatījums, piemēram, intensitāte (amplitūda, ilgums), pulsācijas režīms un temperatūra, ļauj precīzi sadalīt DNS līdz noteiktam vēlamajam DNS fragmentu garumam. Lai gan DNS bieži tiek samazināts līdz 100 līdz 600 bp, izmantojot ultrasonication, garākus DNS fragmentus līdz 1300 bp var iegūt, ja tiek piemēroti maigāki ultraskaņas apstākļi.
Ultraskaņas DNS cirpšana ChIP laikā – Hromatin imunopreciprācija
Pielāgots no Jkwchui cc-BY-SA.03
Temperatūras kontrole DNS degradācijas novēršanai
DNS divvirzienu molekulārā forma ir ļoti jutīga pret paaugstinātu temperatūru, tāpēc precīza temperatūras kontrole paraugu sagatavošanas posmos ir būtisks faktors ticamiem analīžu rezultātiem.
Neatkarīgi no tā, vai izmantojat Hielscher zondes ultrasonikatorus, VialTweeter vai UIP400MTP – nepārtraukta temperatūras kontrole un kontrole tiek nodrošināta, pateicoties spraudnējamam temperatūras sensoram un viedierīces programmatūrai. Lai uzturētu temperatūru noteiktā diapazonā, varat iestatīt augšējo un apakšējo temperatūras ierobežojumu. Līdz ar to ultrasonikators pauze, tiklīdz šī temperatūras robeža ir pārsniegta, un automātiski turpinās sonicate, kad temperatūra ir pazemināta ar iestatīto ∆T.
Hielscher ultrasonikatoru izsmalcinātā programmatūra nodrošina ideālu paraugu apstrādes apstākļu uzticamu uzturēšanu.
Masas parauga DNS fragmentācija ar UIP400MTP multi-well plate ultrasonicator
Paraugu skaits dzīvības zinātnē pēdējo desmit gadu laikā ir ievērojami palielinājies. Tas nozīmē, ka paraugu sagatavošanas un analīzes laikā paraugu sagatavošanas un analīzes laikā jāapstrādā ļoti liels skaits paraugu (piemēram, 384, 1536 vai 3456 ienes mikroplatē), lai iegūtu salīdzināmus un derīgus rezultātus. Ar UIP400MTP Hielscher Ultrasonics seko masveida paraugu apstrādes tendencei. UIP400MTP ir ultrasonikators paraugu sagatavošanai, izmantojot mikroplates. UIP400MTP var apstrādāt plāksnes ar 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 vai 3456 urbumiem. Atkarībā no mikroplates tipa katra aka parasti var saturēt paraugu tilpumus no desmitiem nanolitru līdz vairākiem mililitriem. Plaši izmanto dzīvības zinātnes pētniecībā, UIP400MTP ļoti bieži izmanto paraugu sagatavošanai pirms tādām lietām kā ELISA (fermentu imūnsorbenta noteikšana) vai PCR, pirms olbaltumvielu analīzes, kā arī hromatīna sagatavošanai pirms CHiP un CHiP-seq, histone modifikācijas identifikācijai un citām analītiskām procedūrām (piemēram, gēla elektroforēze, masspektrometrija).
VialTweeter parauga praparācijai līdz 10 flakoniem
VialTweeter ir plaši izmantots laboratorijas ultrasonicator VialTweeter, kas ļauj efektīvi un ērti apstrādāt ar ultraskaņu līdz 10 flakoniem vienlaicīgi. Tā kā flakoni un mēģenes (piemēram, Eppendorf flakoni, krio flakoni, centrifūgas mēģenes) tiek socinātas ar skaņas cinājumu, tiek novērsta jebkāda savstarpēja piesārņošanās. Tā kā katram paraugam tiek piegādāta vienāda ultraskaņas intensitāte, visi ultraskaņas apstrādes rezultāti ir viendabīgi un reproducējami. VialTweeter piedāvā visas viedās funkcijas, piemēram, citas mūsu digitālās ierīces (piemēram, viedā izvēlne, programmējami iestatījumi, temperatūras kontrole, tālvadības pults utt.), lai nodrošinātu visaugstāko lietotāja komfortu.
Vairāku pirkstu zondes Microwell plāksnēm
Pieejams ultraskaņas zondes homogenizatoriem UP200Ht un UP200St, vairāku pirkstu zondes ar 4 vai 8 pirkstiem ir ērta iespēja vienlaikus apstrādāt vairākus paraugus vienā un tajā pašā laikā. Piemēram, sonotrode MTP-24-8-96 ir astoņu pirkstu zonde, kas ir ideāli piemērota integrācijai automatizētās sistēmās vai efektīvai vairāku urbuma plākšņu aku manuālai paraugu sagatavošanai. Vairāku pirkstu sonotrode ir ideāli piemērots automatizētām laboratorijām, kur galvenokārt tiek apstrādātas knābji un mēģenes, izmantojot standarta ultraskaņas sonotrode. Vairāku pirkstu un standarta zondes var ātri mainīt dažu minūšu laikā, pārveidojot vienas zondes ultrasonikatoru par vairāku zondi ultraskaņas traucētāju.
Hielscher ultrasonicators DNS fragmentācijai
Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādas ultraskaņas platformas DNS, RNS un hromatīna fragmentācijai. Šīs dažādās platformas ietver ultraskaņas zondes (sonotrodes), netiešus ultraskaņas šķīdumus vairāku cauruļu vai daudzaizdevumu plākšņu (piemēram, 96 urbumu plākšņu, mikrotitru plākšņu), sonoreaktoru un ultraskaņas kušeronu vienlaicīgai paraugu sagatavošanai. Visas DNS bīdes platformas darbina ar frekvencē noregulētiem augstas veiktspējas ultraskaņas procesoriem, kas ir precīzi kontrolējami un nodrošina reproducējamus rezultātus.
Ultraskaņas procesori jebkuram parauga numuram un izmēram
Ar Hielscher daudzparaugu ultrasonikatoriem VialTweeter (līdz 10 mēģenēm) un UIP400MTP (mikroplatēm / daudzwell plāksnēm) kļūst viegli iespējams samazināt parauga apstrādes laiku intensīvas un precīzi kontrolējamas ultrasonication dēļ, vienlaikus iegūstot vēlamo DNS fragmenta izmēru sadalījumu un ražu. Ultraskaņas DNS fragmentācija padara paraugu sagatavošanu efektīvu, uzticamu un mērogojamu. Protokolus var lineāri mērogot no viena līdz daudziem paraugiem, izmantojot pastāvīgi kontrolētu ultraskaņu.
Zondes ultrasonikatori ar vienu līdz pieciem pirkstiem ir ideāli piemēroti mazāku paraugu skaita sagatavošanai. Hielscher laboratorijas ultrasonikatori ir pieejami dažādos izmēros, lai mēs varētu ieteikt jums ideālu ierīci jūsu pieteikumam un prasībām.
precīza procesa kontrole
Precīzi kontrolējami ultraskaņas apstrādes iestatījumi ir izšķiroši, jo izsmeļoša ultraskaņas apstrāde var iznīcināt DNS, RNS un hromatīnu, bet nepietiekama ultraskaņas cirpšana rada pārāk garus DNS un hromatīna fragmentus. Hielscher digitālos ultrasonikatorus var viegli iestatīt uz precīzu ultraskaņas parametru. Īpašus ultraskaņas apstrādes iestatījumus var saglabāt arī kā ieprogrammētu iestatījumu, lai ātri atkārtotu to pašu procedūru.
Visa ultraskaņas apstrāde tiek automātiski protokolēta un saglabāta kā CSV fails iebūvētajā SD kartē. Tas ļauj precīzi dokumentēt veiktos izmēģinājumus un ļauj viegli pārskatīt ultraskaņas apstrādes.
Izmantojot pārlūkprogrammas tālvadības pulti, visus digitālos ultrasonikatorus var darbināt un uzraudzīt, izmantojot jebkuru standarta pārlūkprogrammu. Papildu programmatūras instalēšana nav nepieciešama, jo LAN savienojums ļauj izveidot ļoti vienkāršu plug-n-play iestatīšanu.
Augstākā lietotājdraudzīgums ultraskaņas paraugu sagatavošanā
Visi Hielscher ultraskaņas aparāti ir paredzēti, lai nodrošinātu augstas veiktspējas ultraskaņu, vienlaikus vienmēr ir ļoti lietotājam draudzīgi un viegli lietojami. Visi iestatījumi ir labi strukturēti skaidrā izvēlnē, kurai var viegli piekļūt, izmantojot krāsainu skārienjutīgu displeju vai pārlūkprogrammas tālvadības pulti. Viedā programmatūra ar programmējamiem iestatījumiem un automātisku datu ierakstīšanu nodrošina optimālus ultraskaņas apstrādes iestatījumus, lai iegūtu uzticamus un reproducējamus rezultātus. Tīrais un viegli lietojamais izvēlnes interfeiss pārvērš Hielscher ultrasonikatorus lietotājam draudzīgās un efektīvās ierīcēs.
Zemāk redzamajā tabulā ir sniegta norāde par mūsu laboratorijas ultrasonikatoru aptuveno apstrādes spēju, kas ir ideāli piemērota paraugu sagatavošanas uzdevumiem, piemēram, DNS un RNS fragmentācijai, šūnu līzei, kā arī olbaltumvielu ekstrakcijai:
| Ierīci | Jauda [W] | Tipa | Tilpums [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP UIP400MTP | 400. | mikroplatēm | 6 – 3456 akas | VialTweeter | 200. | līdz 10 flakoniem plus skavas iespēja | 0.5. – 1,5. |
| UP50H | 50. | Zondes tips | 0.01. – 250. |
| UP100H | 100. | Zondes tips | 0.01. – 500. |
| UP200Ht | 200. | Zondes tips | 0.1. – 1000. |
| UP200St | 200. | Zondes tips | 0.1. – 1000. |
| UP400St | 400. | Zondes tips | 5,0. – 2000. |
| Cuphorns | 200. | Taure, sonoreactor | 10 – 200. |
| GDmini2 | 200. | piesārņojuma plūsmas šūna |
Sazinies ar mums! / Uzdot mums!
Ultraskaņas vairāku paraugu sagatavošanas vienība VialTweeter ļauj vienlaicīgi apstrādāt līdz 10 flakoniem. Ar iespīlēšanas ierīci VialPress, līdz 4 papildu caurulēm var nospiest uz priekšu intensīvai apstrādei ar ultraskaņu.
Sonotrode MTP-24-8-96 ir astoņas ultraskaņas zondes mikrotitrēšanas plākšņu akmeņu apstrādei.
Literatūra/atsauces
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Fakti ir vērts zināt
Kas ir nākamās paaudzes sekvencēšana?
Nākamās paaudzes sekvencēšana, arī Next Gen Sequencing (NGS), augstas caurlaidspējas secība vai otrās paaudzes sekvencēšana, attiecas uz masveida paralēlās sekvencēšanas pieeju, kur ļoti liels (masīvs) DNS daudzums miljoniem fragmentu tiek sekvencēti vienlaicīgi paralēli vienā braucienā.
Lai veiktu nākamās paaudzes sekvencēšanu, jāveic trīs galvenie soļi: 1) bibliotēkas sagatavošana, (2) secība un (3) datu analīze. Bibliotēkas sagatavošanas laikā DNS dzīslas ir jāsastādās noteikta garuma DNS fragmentos. Ultraskaņas apstrāde ir viena no vēlamajām DNS fragmentēšanas tehnikai.
DNS sekvencēšanas procesā nukleotīdu secība DNS – pazīstams kā nukleīnskābes sekvence – tiek noteikts. Nukleīnskābes sekvence sastāv no četrām nukleotīdu bāzēm – adenīna, citozīna, guanīna, timīna – kurš kods informācijai.
Nākamās paaudzes sekvencēšana veicina pētījumus dzīvības zinātnē un personalizētajā medicīnā, jo DNS un RNS sekvencēšana tiek plaši izmantota genoma pētniecībā, vēža pētniecībā, reto un sarežģīto slimību pētniecībā, mikrobu pētniecībā, agrogenomikā un daudzās citās pētniecības jomās.
Nākamās paaudzes sekvencēšana pret Sangeru Sekvencēšana
Lai gan ar nākamās paaudzes sekvencēšanu (NGS) ir iespējams sekvencēt milzīgu skaitu genomu paraugu, Sanger Sequencing (pazīstams arī kā ķēdes pārtraukšanas metode vai pirmās paaudzes sekvencēšana) spēj sekvencēt nelielus paraugu numurus. Sanger sekvencēšana vienlaikus sekvencē tikai vienu DNS fragmentu, un to var paveikt vienā dienā. Pateicoties tās uzkrāšanai, Sanger sekvencēšana tiek uzskatīta arī par zelta standarta tehnoloģiju, ko izmanto, lai pārbaudītu nākamās paaudzes sekvencēšanas iegūtos rezultātus.
Sanger sekvencēšana sasniedz lasīšanas garumu aptuveni 800bp (parasti 500-600bp ar nebagātinātu DNS). Garāki lasīšanas garumi Sanger sekvencēšanas laikā parāda ievērojamas priekšrocības salīdzinājumā ar citām secības metodēm, jo īpaši attiecībā uz genoma atkārtoto reģionu secību. Īsas lasīšanas secības datu problēma ir īpaši jaunu genomu sekvencēšana (de novo) un ļoti pārkārtotu genoma segmentu sekvencēšana, parasti tie, kas novēroti no vēža genomiem vai hromosomu reģionos, kuriem ir strukturālas variācijas. [cp. Morozova un Marra, 2008]
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus no Laboratorija lai rūpnieciskais izmērs.