Bioinženierijas ceļā modificētu šūnu ultraskaņas līze rūpnieciskajā ražošanā

Bioinženierijas ceļā modificētas baktēriju sugas, piemēram, E. coli, kā arī ģenētiski modificētus zīdītāju un augu šūnu tipus plaši izmanto biotehnoloģijā molekulu ekspresijai. Lai atbrīvotu šīs sintezētās biomolekulas, ir nepieciešama uzticama šūnu sagraušanas metode. Augstas veiktspējas apstrāde ar ultraskaņu ir pārbaudīta metode efektīvai un uzticamai šūnu līzei – to var viegli mērogot lielai apstrādes ražībai. Hielscher Ultrasonics piedāvā augstas veiktspējas ultraskaņas iekārtas efektīvai šūnu līzei, lai iegūtu lielu daudzumu augstas kvalitātes biomolekulu.

Molekulu ekstrakcija no šūnu fabrikām

Daudzveidīgu biomolekulu ražošanai par mikrobiālām šūnu fabrikām var izmantot dažādus modificētus mikroorganismus un augu šūnas, tostarp Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, cianobaktērijas, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana un aļģes, kā arī daudzus citus. Šīs šūnu fabrikas var ražot olbaltumvielas, lipīdus, bioķīmiskās vielas, polimērus, biodegvielu un oleoķīmiskās vielas, ko izmanto pārtikā vai kā izejvielas rūpniecībā. Šūnas, ko izmanto par šūnu fabrikām, kultivē slēgtos bioreaktoros, kur tās var nodrošināt augstu efektivitāti, specifiskumu un zemu enerģijas patēriņu.
Lai no bioinženierijas ceļā modificētu šūnu kultūrām izolētu mērķmolekulas, šūnas ir jāsagrauj, atbrīvojot to iekšējo saturu. Ultraskaņas šūnu sagrāvēju izmantošana ir plaši atzīta par ļoti uzticamu un efektīvu metodi šūnu dezintegrācijai un savienojumu atbrīvošanai.

Mikrobiālās šūnu fabrikas ir šūnas, kuru vielmaiņa ir modificēta dažādu vērtīgu savienojumu sintēzei. Šūnu sagraušana ar ultraskaņu ir efektīva un uzticama metode vērtīgo savienojumu atbrīvošanai no šūnu iekšienes.
pētījums un attēls: ©Villaverde, 2010.

Ultraskaņas šūnu sagrāvēju priekšrocības

Ultraskaņas šūnu sagrāvējus izmanto laboratorijās un rūpniecībā kā netermisku, saudzīgu, tomēr ļoti efektīvu tehnoloģiju šūnu līzei un augstas kvalitātes ekstraktu iegūšanai, piemēram, molekulu izolēšanai no šūnu fabrikām.

Lielas jaudas ultraskaņa efektīvai mikrobiālo šūnu fabriku sagraušanai

Ultraskaņas šūnu sagrāvēju darbības mehānisms un iedarbība:
Šūnu sagraušanā ar ultraskaņu izmanto ultraskaņas viļņu enerģiju. Ultraskaņas homogenizators / šūnu sagrāvējs ir aprīkots ar titāna sakausējuma zondi (sauktu arī par sonotrodi), kas svārstās ar augstu frekvenci – aptuveni 20 kHz. Tas nozīmē, ka ultraskaņas zonde apstrādājamajā šķidrumā ievada 20 000 svārstību sekundē. Šķidrumā ievadītajiem ultraskaņas viļņiem raksturīgi mainīgi augsta spiediena / zema spiediena cikli. Zema spiediena cikla laikā šķidrums izplešas un veidojas sīki vakuuma burbulīši. Šie ļoti mazie burbulīši aug vairāku mainīga spiediena ciklu laikā, līdz vairs nespēj absorbēt papildu enerģiju. Šajā brīdī kavitācijas burbulīši strauji sabrūk uz iekšu un lokāli rada vidi ar ārkārtīgi augstu enerģijas blīvumu. Šo parādību sauc par akustisko kavitāciju, un tai raksturīga lokāli ļoti augsta temperatūra, ļoti augsts spiediens un bīdes spēki. Šie bīdes spriegumi efektīvi sagrauj šūnu sieniņas un palielina masas pārnesi starp šūnas iekšieni un apkārtējo šķīdinātāju. Ar ultraskaņu radītu bīdes spēku izmantošana ir pilnībā mehāniska metode, ko plaši lieto un iesaka baktēriju šūnu sagraušanai, kā arī olbaltumvielu izdalīšanai. Apstrāde ar ultraskaņu ir vienkārša un ātra šūnu sagraušanas metode, kas ir ideāli piemērota vielu izdalīšanai no maza, vidēja un liela tilpuma paraugiem. Hielscher digitālās ultraskaņas iekārtas ir aprīkotas ar pārskatāmu iestatījumu izvēlni precīzai apstrādes ar ultraskaņu vadībai. Visi dati par apstrādi ar ultraskaņu tiek automātiski saglabāti iebūvētā SD kartē un ir viegli pieejami. Pilnveidotas siltuma novadīšanas iespējas, piemēram, ārējā dzesēšana, apstrāde ar ultraskaņu impulsu režīmā u. c., ultraskaņas dezintegrācijas procesā nodrošina ideālās procesa temperatūras uzturēšanu un tādējādi arī ekstrahēto siltumjutīgo savienojumu neskartību.

Pētījumi izceļ šūnu sagraušanas un ekstrakcijas ar ultraskaņu priekšrocības

Prof. Chemat un līdzautori (2017) savā pētījumā secina, ka “ekstrakcija ar ultraskaņas palīdzību ir videi draudzīga un ekonomiski dzīvotspējīga alternatīva tradicionālajām pārtikas un dabīgo produktu apstrādes metodēm. Galvenie ieguvumi ir ekstrakcijas un apstrādes laika, izmantotās enerģijas un šķīdinātāju daudzuma, tehnoloģisko operāciju skaita un CO₂ emisiju samazināšanās.”
Gabig-Ciminska un līdzautori (2014) savā pētījumā izmantoja augstspiediena homogenizatoru un ultraskaņas šūnu dezintegratoru sporu lizēšanai, lai atbrīvotu DNS. Salīdzinot abas šūnu sagraušanas metodes, pētnieku grupa attiecībā uz šūnu lizēšanu sporu DNS iegūšanai secina: “Analīze tika veikta, izmantojot augstspiediena homogenizācijā iegūtus šūnu lizātus. Pēc tam mēs sapratām, ka šūnu sagraušanai ar ultraskaņu šajā nolūkā ir izcilas priekšrocības. Tā ir diezgan ātra, un to var veikt ar maza tilpuma paraugiem.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekulas no šūnu fabrikām pārtikas ražošanai

Mikrobu šūnu fabrikas ir dzīvotspējīga un efektīva ražošanas metode, kurā mikroorganismus izmanto, lai ar tādu mikroorganismu kā baktēriju, raugu, sēņu u. c. metaboliskās bioinženierijas palīdzību iegūtu lielu daudzumu tiem raksturīgu un neraksturīgu metabolītu. Piemēram, lielos apjomos ražotus fermentus iegūst, izmantojot tādus mikroorganismus kā Aspergillus oryzae, sēnes un baktērijas. Šos lielos apjomos ražotos fermentus izmanto pārtikas un dzērienu ražošanā, kā arī lauksaimniecībā, bioenerģētikā un mājsaimniecības kopšanas līdzekļos.
Dažas baktērijas, piemēram, Acetobacter xylinum un Gluconacetobacter xylinus, fermentācijas procesā ražo celulozi, kuras nanošķiedras tiek sintezētas augšupējā procesā. Baktēriju celuloze (pazīstama arī kā mikrobiālā celuloze) ķīmiski ir līdzvērtīga augu celulozei, taču tai ir augsta kristāliskuma pakāpe un augsta tīrības pakāpe (tā nesatur lignīnu, hemicelulozi, pektīnu un citus biogēnus komponentus), kā arī unikāla struktūra – no celulozes nanošķiedrām veidots trīsdimensiju (3D) tīklojums. (sk. Zhong, 2020) Salīdzinājumā ar augu izcelsmes celulozi baktēriju celuloze ir ilgtspējīgāka, un iegūtā celuloze ir tīra, tāpēc tai nav nepieciešami sarežģīti attīrīšanas posmi. Apstrāde ar ultraskaņu un ekstrakcija ar šķīdinātāju, izmantojot NaOH vai SDS (nātrija dodecilsulfātu), ir ļoti efektīvas metodes baktēriju celulozes izolēšanai no baktēriju šūnām.

Biomolekulas no šūnu fabrikām farmaceitisko produktu un vakcīnu ražošanai

Viens no ievērojamākajiem farmaceitiskajiem produktiem, ko iegūst no šūnu fabrikām, ir cilvēka insulīns. Insulīna ražošanai ar bioinženierijas metodēm galvenokārt izmanto E. coli un Saccharomyces cerevisiae. Tā kā biosintezētām nanoizmēra molekulām piemīt augsta biosaderība, bioloģiskas nanodaļiņas, piemēram, feritīns, ir izdevīgas daudzos bioražošanas lietojumos. Turklāt ražošana metaboliski modificētos mikrobos bieži vien ir ievērojami efektīvāka iegūtā iznākuma ziņā. Piemēram, artemizīnskābes, resveratrola un likopēna ražošanas apjoms ir palielinājies no desmit līdz vairākiem simtiem reižu, un to rūpnieciska mēroga ražošana jau ir ieviesta vai tiek izstrādāta. (sk. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Piemēram, uz olbaltumvielām balstītas nanoizmēra biomolekulas ar pašorganizēšanās īpašībām, piemēram, feritīns un vīrusiem līdzīgas daļiņas, ir īpaši interesantas vakcīnu izstrādē, jo tās atdarina gan patogēnu izmēru, gan struktūru un to virsmai var konjugēt antigēnus, lai veicinātu mijiedarbību ar imūnšūnām. Šādas molekulas tiek ekspresētas tā dēvētajās šūnu fabrikās (piemēram, modificētos E. coli celmos), kas ražo noteiktu mērķa molekulu.

E. coli BL21 ultraskaņas līzes protokols feritīna atbrīvošanai

Feritīns ir olbaltumviela, kuras galvenā funkcija ir dzelzs uzglabāšana. Feritīnam piemīt daudzsološas iespējas veidot pašorganizējošas nanodaļiņas vakcīnās, kur to izmanto kā vakcīnas piegādes nesēju (piemēram, SARS-Cov-2 pīķa olbaltumvielām). Sun et. al. (2016) zinātniskais pētījums liecina, ka rekombinanto feritīnu var atbrīvot no Escherichia coli šķīstošā formā pie zemas NaCl koncentrācijas (≤50 mmol/L). Lai ekspresētu feritīnu E. coli BL21 un to atbrīvotu, tika veiksmīgi izmantots šāds protokols. Rekombinantā pET-28a/ferritin plazmīda tika ievadīta E coli BL21 (DE3) celmā ar transformācijas metodi. Feritīnu producējošās E coli BL21 (DE3) šūnas tika kultivētas LB augšanas barotnē ar 0,5% kanamicīna 37°C temperatūrā, un, sasniedzot OD600 vērtību 0,6, ekspresija tika inducēta ar 0,4% izopropil-β-D-tiogalaktopiranozīda 3 stundas 37°C temperatūrā. Pēc tam iegūtā kultūra tika centrifugēta pie 8000g 10 minūtes 4°C temperatūrā, un nogulsnes tika savāktas. Tad nogulsnes tika atkārtoti suspendētas attiecīgi LB barotnē (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% rauga ekstrakta)/līzes buferšķīdumā (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) un dažādas koncentrācijas NaCl šķīdumos (0, 50, 100, 170 un 300 mmol/L). Baktēriju šūnu līzei tika izmantota apstrāde ar ultraskaņu impulsu režīmā: piemēram, izmantojot ultraskaņas ierīci UP400St ar 100% amplitūdu un darba ciklu: 5 sekundes IESLĒGTS, 10 sekundes IZSLĒGTS, kopā 40 ciklus), un pēc tam centrifugēja pie 10 000g 15 minūtes 4°C temperatūrā. Supernatantu un nogulsnes analizēja ar nātrija dodecilsulfāta poliakrilamīda gēla elektroforēzi (SDS-PAGE). Visus ar nātrija dodecilsulfātu iekrāsotos gēlus skenēja ar augstas izšķirtspējas skeneri. Gēlu attēlus analizēja, izmantojot Magic Chemi 1D programmatūru. Lai nodrošinātu optimālu skaidrību, olbaltumvielu joslas noteica, pielāgojot parametrus. Joslu datus ieguva no trim tehniskajiem atkārtojumiem. (sal. Sun et al., 2016)

Ultraskaņas šūnu sagrāvēji šūnu fabriku rūpnieciskai līzei

Ultraskaņas līze un ekstrakcija ir uzticama un ērta metode metabolītu atbrīvošanai no šūnu fabrikām, tādējādi veicinot efektīvu mērķa molekulu ražošanu. Ultraskaņas šūnu sagrāvēji ir pieejami no laboratorijas līdz rūpnieciskā mēroga iekārtām, un procesus var mērogot pilnīgi lineāri.
Hielscher Ultrasonics ir jūsu kompetentais partneris augstas veiktspējas ultraskaņas sagrāvēju jomā ar ilggadēju pieredzi ultraskaņas sistēmu ieviešanā gan galda iekārtu, gan rūpnieciskā mērogā.
Hielscher Ultrasonics šūnu sagraušanas sistēmas ar to moderno aparatūru un programmatūru atbilst visām prasībām attiecībā uz optimālu procesa vadību, vienkāršu ekspluatāciju un lietošanas ērtumu. Hielscher ultraskaņas iekārtu klienti un lietotāji augstu vērtē priekšrocību, ko sniedz Hielscher ultraskaņas šūnu sagrāvēji un ekstraktori: tie ļauj precīzi uzraudzīt un vadīt procesu – ar digitālu skārienekrānu un attālinātu vadību pārlūkprogrammā. Visi svarīgie apstrādes ar ultraskaņu dati (piemēram, neto enerģija, kopējā enerģija, amplitūda, ilgums, temperatūra, spiediens) tiek automātiski saglabāti CSV failā integrētā SD kartē. Tas palīdz iegūt reproducējamus un atkārtojamus rezultātus un atvieglo procesa standartizāciju, kā arī labas ražošanas prakses (cGMP) prasību izpildi.
Protams, Hielscher ultraskaņas procesori ir paredzēti darbībai 24/7 ar pilnu slodzi, tāpēc tos var uzticami izmantot rūpnieciskajā ražošanā. Pateicoties augstajai izturībai un nelielajām apkopes prasībām, ultraskaņas iekārtu dīkstāve ir ļoti īsa. CIP (tīrīšana uz vietas) un SIP (sterilizācija uz vietas) funkcijas samazina darbietilpīgu tīrīšanu, jo īpaši tādēļ, ka visām ar šķidrumu saskarē esošajām daļām ir gludas metāla virsmas (bez slēptām atverēm vai sprauslām).

Tālāk sniegtā tabula sniedz priekšstatu par mūsu ultraskaņas iekārtu aptuveno apstrādes jaudu: