Bioinženierētu šūnu ultraskaņas līze rūpnieciskajā ražošanā

Bioinženierijas baktēriju sugas, piemēram, E. coli, kā arī ģenētiski modificēti zīdītāju un augu šūnu tipi tiek plaši izmantoti biotehnoloģijās, lai izteiktu molekulas. Lai atbrīvotu šīs sintezētās biomolekulas, ir nepieciešama uzticama šūnu darbības traucējumu tehnika. Augstas veiktspējas ultrasonication ir pierādīta metode efektīvai un uzticamai šūnu līzei – viegli mērogojams līdz lielām caurlaides spējām. Hielscher Ultrasonics piedāvā jums augstas veiktspējas ultraskaņas iekārtas efektīvai šūnu līzei, lai ražotu lielus daudzumus augstas kvalitātes bio-molekulu.

Molekulu ekstrakcija no šūnu rūpnīcām

Plaša spektra biomolekulu ražošanai kā mikrobu šūnu rūpnīcas var izmantot dažādus inženierijas mikrobus un augu šūnas, tostarp Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana un aļģes, kā arī daudzus citus. Šīs šūnu rūpnīcas var ražot olbaltumvielas, lipīdus, bioķīmiskās vielas, polimērus, biodegvielu un tauku pārstrādes vielas, ko izmanto kā pārtiku vai izejvielas rūpnieciskiem lietojumiem. Šūnas, ko izmanto kā šūnu rūpnīcas, tiek kultivētas slēgtos bioreaktoros, kur tās var sasniegt augstu efektivitāti, specifiskumu un zemas enerģijas prasības.
Lai izolētu mērķa molekulas no bioinženierētajām šūnu kultūrām, šūnas jāizjauc tā, lai atbrīvotos intracelulārais materiāls. Ultraskaņas šūnu traucētāji ir labi izveidoti kā ļoti uzticama un efektīva metode šūnu sadalīšanai un savienojumu atbrīvošanai.

Mikrobu šūnu rūpnīcas ir metaboliski modificētas šūnas, ko izmanto dažādu vērtīgu savienojumu sintēzei. Ultraskaņas šūnu darbības traucējumi ir efektīva un uzticama metode, lai atbrīvotu vērtīgos savienojumus no šūnu iekšpuses.
pētījums un grafika: ©Villaverde, 2010.

Ultraskaņas šūnu traucētāju priekšrocības

Kā netermiska, viegla, bet ļoti efektīva tehnoloģija, ultraskaņas traucējumi tiek izmantoti laboratorijā un rūpniecībā, lai lizētu šūnas un ražotu augstas kvalitātes ekstraktus, piemēram, izmanto molekulu izolēšanai no šūnu rūpnīcām.

Jaudas ultraskaņa, lai efektīvi traucētu mikrobu šūnu rūpnīcas

Ultraskaņas šūnu traucējumu mehānisms un ietekme:
Ultraskaņas šūnu traucējumi izmantoja ultraskaņas viļņu jaudu. Ultraskaņas homogenizators / šūnu traucētājs ir aprīkots ar zondi (pazīstams arī kā sonotrode), kas izgatavots no titāna sakausējuma, kas svārstās augstā frekvencē aptuveni 20 kHz. Tas nozīmē, ka ultraskaņas zonde savieno 20 000 vibrācijas sekundē ultraskaņas šķidrumā. Ultraskaņas viļņus, kas savienoti šķidrumā, raksturo mainīgi augstspiediena / zema spiediena cikli. Zema spiediena cikla laikā šķidrums izplešas un rodas minūtes vakuuma burbuļi. Šie ļoti mazie burbuļi aug vairākos mainīgos spiediena ciklos, līdz tie nespēj absorbēt papildu enerģiju. Šajā brīdī kavitācijas burbuļi vardarbīgi implodē un rada lokāli neparastu enerģētiski blīvu vidi. Šī parādība ir pazīstama kā akustiskā kavitācija, un to raksturo lokāli ļoti augstas temperatūras, ļoti augsts spiediens un bīdes spēki. Šie bīdes spriegumi efektīvi izjauc šūnu sienas un palielina masas pārnesi starp šūnas iekšpusi un apkārtējo šķīdinātāju. Kā tīri mehāniska tehnika tiek plaši izmantoti ultrasoniski radīti bīdes spēki un ieteicamā procedūra baktēriju šūnu darbības traucējumiem, kā arī olbaltumvielu izolācijai. Kā vienkārša un ātra šūnu darbības traucējumu metode, ultraskaņas apstrāde ir ideāli piemērota mazu, vidēju un lielu apjomu izolācijai. Hielscher digitālie ultrasonikatori ir aprīkoti ar skaidru iestatījumu izvēlni precīzai ultraskaņas kontrolei. Visi ultraskaņas dati tiek automātiski saglabāti iebūvētajā SD kartē un ir vienkārši pieejami. Izsmalcinātas siltuma izkliedes iespējas, piemēram, ārējā dzesēšana, ultraskaņas apstrāde pulsa režīmā utt., Ultraskaņas sadalīšanās procesa laikā nodrošina ideālas procesa temperatūras uzturēšanu un tādējādi ekstrahēto karstumjutīgo savienojumu neskartību.

Pētījumi uzsver ultraskaņas šūnu darbības traucējumu un ekstrakcijas stiprās puses

(2017) savā pētījumā atsāk, ka "ekstrakcija ar ultraskaņu ir zaļa un ekonomiski dzīvotspējīga alternatīva tradicionālajām pārtikas un dabisko produktu metodēm. Galvenie ieguvumi ir ekstrakcijas un apstrādes laika samazināšanās, izmantotās enerģijas un šķīdinātāju daudzums, vienības darbības un CO₂ emisijas."
(2014) savā pētījumā izmantoja augstspiediena homogenizatoru un ultraskaņas šūnu dsintegratoru sporu līzei, lai atbrīvotu DNS. Salīdzinot abas šūnu darbības traucējumu metodes, pētnieku komanda secina, ka attiecībā uz sporu DNS šūnu līzi "analīze ir veikta, izmantojot šūnu lizātus no augstspiediena homogenizācijas. Pēc tam mēs sapratām, ka ultraskaņas šūnu darbības traucējumiem šim nolūkam ir izcilas priekšrocības. Tas ir diezgan ātrs un to var apstrādāt nelielos paraugu apjomos." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomolekulas no šūnu rūpnīcām pārtikas ražošanai

Mikrobu šūnu rūpnīcas ir dzīvotspējīga un efektīva ražošanas metodika, izmantojot mikrobu organismus, lai iegūtu augstu vietējo un svešo metabolītu ražu, metaboliski bioinženierijas ceļā izmantojot mikrobu mikroorganismus, piemēram, baktērijas, raugus, sēnītes utt. Lielapjoma fermentus, piemēram, ražo, izmantojot mikroorganismus, piemēram, Aspergillus oryzae, sēnītes un baktērijas. Šie beztaras fermenti tiek izmantoti pārtikas un dzērienu ražošanā, kā arī lauksaimniecībā, bioenerģijā un mājsaimniecības aprūpē.
Dažas baktērijas, piemēram, Acetobacter xylinum un Gluconacetobacter xylinus, fermentācijas procesā ražo celulozi, kur nanošķiedras tiek sintezētas augšupējā procesā. Baktēriju celuloze (pazīstama arī kā mikrobioloģiskā celuloze) ir ķīmiski līdzvērtīga augu celulozei, taču tai ir augsta kristāliskuma pakāpe un augsta tīrība (bez lignīna, hemicelulozes, pektīna un citiem biogēniem komponentiem), kā arī unikāla celulozes nanošķiedras austa trīsdimensiju (3D) retikulēta tīkla struktūra. (sal. ar Zhong, 2020) Salīdzinot ar augu izcelsmes celulozi, baktēriju celuloze ir ilgtspējīgāka, un saražotā celuloze ir tīra, un tai nav nepieciešami sarežģīti attīrīšanas posmi. Ultrasonication un šķīdinātāja ekstrakcija, izmantojot NaOH vai SDS (nātrija dodecilsulfātu), ir ļoti efektīva baktēriju celulozes izolēšanai no baktēriju šūnām.

Biomolekulas no šūnu rūpnīcām farmācijas un vakcīnu ražošanai

Viens no ievērojamākajiem farmaceitiskajiem produktiem, kas iegūti no šūnu rūpnīcām, ir cilvēka insulīns. Bioinženierijas insulīna ražošanai galvenokārt izmanto E. coli un Saccharomyces cerevisiae. Tā kā bioloģiski sintezētas nano izmēra molekulas piedāvā augstu bioloģisko saderību, bioloģiskās nanodaļiņas, piemēram, feritīns, ir izdevīgas daudziem bioražošanas lietojumiem. Turklāt metaboliski konstruētu mikrobu ražošana bieži vien ir ievērojami efektīvāka iegūtajā ražā. Piemēram, artemizīnskābes, resveratrola un likopēna ražošana ir palielinājusies desmitkārtīgi līdz vairākiem simtiem, un tā jau ir izveidota vai tiek izstrādāta rūpnieciska mēroga ražošanai. (sal. ar Liu et al.; Mikrobs. Šūnu fakts. 2017)
Piemēram, uz proteīniem balstītas nano izmēra biomolekulas ar paškomplektējošām īpašībām, piemēram, feritīns un vīrusiem līdzīgas daļiņas, ir īpaši interesantas vakcīnu izstrādei, jo tās atdarina gan patogēnu lielumu, gan struktūru un ir pakļautas antigēnu virsmas konjugācijai, lai veicinātu mijiedarbību ar imūnšūnām. Šādas molekulas ir izteiktas tā sauktajās šūnu rūpnīcās (piemēram, inženierijas E. coli celmos), kas ražo noteiktu mērķa molekulu.

Protokols ultraskaņas līzei un E. coli BL21 feritīna izdalīšanai

Feritīns ir proteīns, kura primārā funkcija ir dzelzs uzglabāšana. Feritīns uzrāda daudzsološas spējas kā paškomplektējošas nanodaļiņas vakcīnās, kur to izmanto kā vakcīnas piegādes līdzekli (piemēram, SARS-Cov-2 smailes proteīni). Sun et zinātniskie pētījumi. (2016) liecina, ka rekombinanto feritīnu var izdalīt kā šķīstošu formu no Escherichia coli zemā NaCl koncentrācijā (≤50 mmol/l). Lai izteiktu feritīnu E. coli BL21 un atbrīvotu fertīnu, tika veiksmīgi piemērots šāds protokols. Rekombinantais pET-28a/feritīna plazmīds tika pārveidots par E coli BL21 (DE3) celmu. Feritīna E coli BL21 (DE3) šūnas tika kultivētas LB augšanas vidē ar 0,5% kanamicīnu 37°C temperatūrā un inducētas pie OD600 0,6 ar 0,4% izopropil-β-D-tiogalaktopiranozīdu 3 stundas 37°C temperatūrā. Pēc tam gala kultūru novāca, centrifugējot 8000 g 10 minūtes 4 °C temperatūrā, un savāca granulas. Pēc tam granulas tika atkārtoti suspendētas LB barotnē (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% rauga ekstrakts)/līzes buferšķīdumā (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) un dažādās NaCl šķīduma koncentrācijās (0, 50, 100, 170 un 300 mmol/L). Baktēriju šūnu līzei ultraskaņas apstrāde tika veikta impulsa režīmā: piemēram, izmantojot Ultrasonicator UP400St 100% amplitūdā ar darba ciklu 5 sekundes IESLĒGTS, 10 sekundes IZSLĒGTS, 40 cikli) un pēc tam centrifugēts pie 10 000 g 15 minūtes 4 °C temperatūrā. Supernatants un nogulsnes tika analizētas ar nātrija dodecilsulfātu, poliakrilamīda gēla elektroforēzi (SDS-PAGE). Visi nātrija dodecilsulfāta iekrāsotie gēli tika skenēti ar augstas izšķirtspējas skeneri. Gēla attēli tika analizēti, izmantojot Magic Chemi 1D programmatūru. Lai iegūtu optimālu skaidrību, olbaltumvielu joslas tika noteiktas, pielāgojot parametrus. Dati par joslām tika iegūti no tehniskiem trijiem eksemplāriem. (sal.: Sun et al., 2016)

Ultraskaņas šūnu traucētāji šūnu rūpnīcu rūpnieciskajai līzei

Ultraskaņas līze un ekstrakcija ir uzticama un ērta metode metabolītu atbrīvošanai no šūnu rūpnīcām, tādējādi palīdzot efektīvi ražot mērķa molekulas. Ultraskaņas šūnu traucētāji ir pieejami no laboratorijas līdz rūpnieciskajam izmēram, un procesus var mērogot pilnīgi lineāri.
Hielscher Ultrasonics ir jūsu kompetentais partneris augstas veiktspējas ultraskaņas traucētājiem, un tam ir ilgstoša pieredze ultraskaņas sistēmu implantēšanas jomā stenda un rūpniecības apstākļos.
Runājot par sarežģītu aparatūru un programmatūru, Hielscher Ultrasonics šūnu traucējumu sistēmas atbilst visām prasībām optimālai procesa kontrolei, ērtai darbībai un lietotājdraudzīgumam. Hielscher ultrasonikatoru klienti un lietotājs novērtē labumu, ko Hielscher ultraskaņas šūnu traucētāji un nosūcēji ļauj precīzi uzraudzīt un kontrolēt procesu – izmantojot digitālo skārienekrānu un pārlūka tālvadības pulti. Visi svarīgie ultraskaņas dati (piemēram, neto enerģija, kopējā enerģija, amplitūda, ilgums, temperatūra, spiediens) tiek automātiski saglabāti kā CSV fails integrētā SD kartē. Tas palīdz iegūt reproducējamus un atkārtojamus rezultātus un atvieglo procesu standartizāciju, kā arī labas ražošanas prakses (cGMP) izpildi.
Protams, Hielscher ultraskaņas procesori ir būvēti 24/7 darbībai ar pilnu slodzi, un tāpēc tos var droši darbināt rūpnieciskās ražošanas apstākļos. Sakarā ar augstu izturību un zemu apkopi, ultraskaņas iekārtu dīkstāves laiks ir patiešām zems. CIP (clean-in-place) un SIP (sterilizējiet vietā) funkcijas samazina darbietilpīgu tīrīšanu, jo īpaši tāpēc, ka visas mitrās daļas ir gludas metāla virsmas (bez slēptām atverēm vai sprauslām).

Zemāk redzamajā tabulā ir sniegta norāde par mūsu ultrasonikatoru aptuveno apstrādes jaudu: