Plazmīdu sagatavošana, izmantojot apstrādi ar ultraskaņu

Apstrāde ar ultraskaņu ir uzticama metode plazmīdu DNS fragmentēšanai. Precīzi regulējama amplitūda, impulsu režīms un temperatūras kontrole ir vissvarīgākās ultraskaņas ierīces īpašības plazmīdu fragmentēšanai bez bojājumiem. Turklāt noteiktu vielu izmantošana palīdz aizsargāt plazmīdas pret degradāciju. Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus risinājumus kontrolētai plazmīdu fragmentēšanai gan atsevišķos flakonos, gan vienlaikus daudzos paraugos, gan daudziedobju platēs. Uzziniet vairāk par veiksmīgu plazmīdu fragmentēšanu ar ultraskaņu!

Plazmīdu fragmentēšana ar ultraskaņas radītiem bīdes spēkiem

Pakļaujot DNS paraugus ultraskaņas viļņiem, ultraskaņas radītās svārstības šķidrumā izraisa akustisko kavitāciju, kas mehānisko spēku iedarbībā sašķeļ vai pārrauj lielas molekulmasas DNS molekulas. Apstrāde ar ultraskaņu ir visplašāk izmantotā metode liela DNS daudzuma fragmentēšanas eksperimentos, kuros izmanto bīdes spēkus, tostarp tādos lietojumos kā hromatīna imūnprecipitācija (ChIP), kur mazi fragmentu izmēri ir absolūti nepieciešami augstas izšķirtspējas iegūšanai. (sal. Tseng et al., 2012)
Plazmīdu DNS (pDNA) ir īpaša DNS forma, kam raksturīga gredzenveida struktūra un kas sastopama baktērijās un dažos eikariotos.
Superspiralizēta pDNA ir vēlamā plazmīdu DNS forma, jo tā nodrošina vislabākos rezultātus turpmākajos procesos, piemēram, automatizētā sekvenēšanā un transfekcijā. Apstrāde ar ultraskaņu ir piemērota veiksmīgai pDNA, tostarp superspiralizētas pDNA, fragmentēšanai.
Thompson et al. (2008) pierādīja, ka plazmīdu apstrāde ar ultraskaņu, kas, kā zināms, fragmentē superspiralizētu DNS, ir efektīvs veids, kā palielināt sekvences phred20 nolasījumu garumu līdz tādam līmenim, ka tas būtiski neatšķiras no Beckman Coulter kontroles matrices vai enzimātiski linearizētu plazmīdu nolasījumu garuma.

Plazmīdu vektoru izmantošana

Plazmīdas bieži izmanto kā rīkus gēnu klonēšanai, pārnesei un manipulācijām ar tiem. Ja plazmīdas eksperimentāli izmanto šiem mērķiem, tās sauc par vektoriem. DNS fragmentus vai gēnus var ievietot plazmīdas vektorā, izveidojot tā saukto rekombinanto plazmīdu. Plazmīdu vektorus izmanto kā nesējus rekombinantās DNS ievadīšanai saimniekšūnā, un tie ir būtiska molekulārās klonēšanas sastāvdaļa.
“Nevīrusu vektori tiek plaši pētīti saistībā ar to iespējamo izmantošanu gēnu terapijā dažādu sarežģītu slimību ārstēšanai. Nevīrusu vektori aizsargā plazmīdu DNS pret fizikālu, ķīmisku un enzimātisku degradāciju un nogādā DNS molekulu mērķa vietā. Piemēram, katjonu liposomas, hitozāns un citas pozitīvi lādētas nanodaļiņas elektrostatiskas mijiedarbības rezultātā veido kompleksus ar plazmīdu DNS. Tomēr viegli veidojošies katjonu liposomu/plazmīdu DNS kompleksi ir samērā lieli (t. i., 300–400 nm) un neviendabīgi, tāpēc tos ir grūti izmantot farmācijā. Lielos un neviendabīgos plazmīdu DNS/liposomu, plazmīdu DNS/aerosolu un plazmīdu DNS/peptīdu kompleksus, izmantojot apstrādi ar ultraskaņu, var samazināt līdz mazākām un viendabīgām daļiņām.” (Sarker et al., 2019)
Ievērojams plazmīdu vektoru izmantošanas piemērs ir CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9 sistēmu šūnās parasti ievada kā vienu lielu plazmīdu vai vairākas mazākas plazmīdas, kas kodē mērķa sekvenci, CRISPR vadītāju un Cas9.

Ar DNS pildītu PLGA nanodaļiņu sagatavošana ar ultraskaņu, izmantojot nanoprecipitāciju

Jo et al. (2020) izmantoja poli(pienskābes-ko-glikolskābes) polimēru (PLGA), lai izveidotu nanodaļiņu nesēju CRISPR–Cas9 modeļplazmīdas ievadīšanai primārajos no kaulu smadzenēm iegūtos makrofāgos. PLGA nanodaļiņu nanoprecipitācijai izmantoja PLGA ar divām dažādām gala grupām (estera un amīna grupām), lai pozitīvi lādētās amīna gala grupas palielinātu iekapsulēšanas efektivitāti un ievietotās DNS daudzumu, pateicoties lādiņu mijiedarbībai starp šīm grupām un negatīvi lādēto DNS pamatķēdi. 50 mL polipropilēna koniskā centrifūgas stobriņā 100 mg Pluronic F127 izšķīdināja 20 mL autoklavēta dejonizēta ūdens, maisot ar virpuļmaisītāju un pēc tam 30 min saudzīgi apstrādājot ar ultraskaņu ultraskaņas vannā (skatīt CupHorn). Pievienoja autoklavētu magnētiskā maisītāja stienīti un šķīdumu maisīja ar 600 RPM 30 min, kamēr gatavoja pārējos šķīdumus. Visā procesā stikla laboratorijas trauku vietā izmantoja plastmasas traukus, lai līdz minimumam samazinātu DNS nespecifisko adsorbciju. Atsevišķi sagatavoja DMF izšķīdināta PLGA (44,48 mg/ ml) un THF izšķīdināta TIPS pentacēna (0,667 mg/ml) šķīdumus. PLGA atstāja DMF miera stāvoklī 30 min, lai tas samitrinātos, un pēc tam 30 min apstrādāja ar ultraskaņu. (Pilnu protokolu skatīt Jo et al., 2020)

Plazmīdu DNS aizsardzība apstrādes ar ultraskaņu laikā

DNS, tostarp plazmīdas un supersavītas plazmīdas, ir ļoti jutīga pret noārdīšanos. Visām pieejamajām fragmentēšanas metodēm ir zināmi noteikti trūkumi. DNS fragmentēšana ar ultraskaņu ir viena no vēlamajām metodēm, jo kontrolēta apstrāde ar ultraskaņu kopā ar aizsardzības pasākumiem ļauj samazināt bīdes un karstuma izraisītus DNS pavedienu bojājumus.
Papildus zemas amplitūdas iestatījumiem, pulsācijas režīmam un temperatūras kontrolei DNS fragmentēšanas ar ultraskaņas radītu bīdi laikā arī noteiktu vielu izmantošana uzrādīja būtisku aizsargājošu iedarbību pret DNS noārdīšanos. Piemēram, dažādi polimēri, peptīdi un lipīdi aizsargā plazmīdu DNS apstrādes ar ultraskaņu laikā.

Plazmīdu DNS un plazmīdu DNS/IL nanokompleksu stabilitāti pret ultraskaņas radītu bīdes spriegumu pētīja, izmantojot agarozes gēla elektroforēzes analīzi. Gan plazmīdu DNS, gan plazmīdu DNS/IL nanokompleksus dažādu laiku pakļāva ultraskaņas radītam bīdes spriegumam. Plazmīdu DNS pakļāva ultraskaņas radītam bīdes spriegumam 0, 10, 20, 30 un 40 minūtes. Savukārt plazmīdu DNS/IL nanokompleksus pakļāva ultraskaņas radītam bīdes spriegumam 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 un 120 minūtes.
(pētījums un attēls: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) pierādīja, ka, pakļaujot plazmīdu DNS / jonu šķidruma (pDNA/IL) nanostruktūras ultraskaņas radītam bīdes spriegumam 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 un 120 min un veidojot to kompleksus ar komerciāli pieejamo katjonu gēnu ievadīšanas līdzekli lipofektamīnu, fluorescences pozitīvo šūnu īpatsvars bija attiecīgi 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% un 50% (skatīt diagrammu zemāk). Fluorescences pozitīvo šūnu īpatsvars palielinājās, kad nanostruktūras pakļāva ultraskaņas radītam bīdes spriegumam 10 un 20 min, un pēc tam lēnām samazinājās.

Jonu šķidruma [Bmim][PF6] ietekme uz plazmīdu DNS ievadīšanu COS7 šūnās. Plazmīdu DNS/IL (jonu šķidruma) nanokompleksus pakļāva ultraskaņas radītam bīdes spriegumam līdz 120 minūtēm un pirms ievadīšanas COS7 šūnās veidoja to kompleksus ar LA. Dati parāda vidējo GFP pozitīvo HeLa šūnu skaitu (%), kas saskaitīts 10 dažādos mikroskopa redzes laukos, un eksperiments tika veikts vairākas reizes trijās dažādās dienās. (Pētījums un diagramma: ©Sarker et al., 2019)

Lizāta sagatavošana ar ultraskaņu

Šūnu līzes ar ultraskaņu protokols
Sāciet ar bagātinātu šūnu paraugu, kas sagatavots, izmantojot kādu šūnu atdalīšanas metodi (piemēram, imūnmagnētisko šūnu atdalīšanu, fluorescences aktivētu šūnu šķirošanu (FACS), blīvuma gradienta centrifugēšanu vai šūnu izolēšanu pēc imūnblīvuma).
Šūnu paraugos jābūt tādam līzes bufera tilpumam, kas atbilst eksperimenta mērķim un zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīcei.
Priekšroka dodama hipotoniskiem buferiem, jo tie pastiprina šūnu līzi ar ultraskaņu. Ir svarīgi atbilstoši izmantot piedevas un izvēlēties sāls koncentrāciju.
Izvēlieties ierīci līzei ar ultraskaņu: netiešai flakonu apstrādei ar ultraskaņu ieteicams izmantot VialTweeter vai CupHorn. Daudziedobju platēm UIP400MTP ir ideāla ultraskaņas apstrādes ierīce. Savukārt klasiskai apstrādei ar ultraskaņas zondi vispiemērotākais ir ultraskaņas homogenizators, piemēram, UP100H vai UP200Ht ar mikrouzgali.
Protokols apstrādei ar ultraskaņas zondi: Ievietojiet ultraskaņas apstrādes ierīces zondi mikrocentrifūgas stobriņā esošajā paraugā un apstrādājiet ar ultraskaņu aptuveni 10 sekundes. Atkarībā no DNS parauga apstrādi ar ultraskaņu var būt nepieciešams atkārtot vēl vienu vai divas reizes. Nepieciešamais ievadītās ultraskaņas enerģijas daudzums (Ws/mL) ir atkarīgs no parauga viskozitātes un DNS veida. Dzesēšana ledus vannā un ultraskaņas apstrādes ierīces impulsu režīms palīdz novērst parauga termisku noārdīšanos.
Pēc līzes ar ultraskaņu paraugu centrifugē, lai atdalītu nogulsnēs esošās atliekas (kas satur nelizētas šūnas, kodolus un nelizētus organoīdus).
Ja paraugu nekavējoties neapstrādā tālāk, to var var uzglabāt atbilstošā temperatūrā, lai saglabātu tā dzīvotspēju.

Ultraskaņas apstrādes ierīces DNS fragmentēšanai

Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādas uz ultraskaņu balstītas platformas DNS, RNS un hromatīna fragmentēšanai. Šīs dažādās platformas ietver ultraskaņas zondes (sonotrodes), netiešas apstrādes ar ultraskaņu risinājumus vienlaicīgai paraugu sagatavošanai vairākos stobriņos vai daudziedobju platēs (piemēram, 96 iedobju platēs, mikrotitrēšanas platēs), sonoreaktorus un ultraskaņas kausveida sonotrodes. Visas platformas DNS fragmentēšanai ar bīdes spēkiem darbina augstas veiktspējas ultraskaņas procesori ar pieskaņotu frekvenci, kurus var precīzi kontrolēt un kuri nodrošina reproducējamus rezultātus.

Ultraskaņas procesori jebkuram paraugu skaitam un tilpumam

Izmantojot Hielscher vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes ierīces VialTweeter (līdz 10 mēģenēm) un UIP400MTP (mikroplatēm/daudziedobju platēm), intensīvā un precīzi kontrolējamā apstrāde ar ultraskaņu ļauj viegli samazināt paraugu apstrādes laiku, vienlaikus iegūstot vēlamo DNS fragmentu izmēru sadalījumu un iznākumu. DNS fragmentēšana ar ultraskaņu padara plazmīdu sagatavošanas posmus efektīvus, uzticamus un mērogojamus. Protokolus var lineāri mērogot no viena parauga līdz daudziem paraugiem, izmantojot nemainīgus ultraskaņas parametrus.
Ultraskaņas apstrādes ierīces ar zondēm, kurām ir viens līdz pieci zari, ir ideāli piemērotas mazāka paraugu skaita sagatavošanai. Hielscher laboratorijas ultraskaņas apstrādes ierīces ir pieejamas ar dažādiem jaudas līmeņiem, lai jūs varētu izvēlēties savam ar DNS saistītajam pielietojumam ideāli piemērotu ultraskaņas sagraušanas ierīci.