Plazmīdu sagatavošana, izmantojot ultrasonication
Ultrasonication ir uzticama metode, lai fragmentētu plazmīdu DNS. Precīzi kontrolējama amplitūda, pulsācijas režīms un temperatūras kontrole ir svarīgākās ultrasonikatora iezīmes nekaitīgai plazmīdu sadrumstalotībai. Turklāt noteiktu līdzekļu lietošana palīdz aizsargāt pret plazmīdu noārdīšanos. Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus risinājumus kontrolētai plazmīdu sadrumstalotībai no atsevišķiem flakoniem, vienlaicīgi daudzu paraugu apstrādi ar ultraskaņu, kā arī vairāku urbumu plāksnēm. Uzziniet vairāk par veiksmīgu ultraskaņas plazmīdu sadrumstalotību!
The UIP400MTP ļauj precīzi kontrolēt vairāku urbumu plākšņu ultrasonikāciju. Viens no UIP400MTP pielietojumiem ir plazmīdu DNS fragmentācija, lai iegūtu īpaši mērķēta garuma fragmentus.
Plazmīdu nobīde, izmantojot ultrasonication
Kad DNS paraugi tiek pakļauti ultraskaņas viļņiem, ultrasoniski radītās vibrācijas rada akustisku kavitāciju šķidrumā, kas ar mehāniskiem spēkiem nogriež vai izjauc augstas molekulmasas DNS molekulas. Ultraskaņas apstrāde ir visplašāk izmantotā metode lielapjoma DNS nobīdes eksperimentiem, ieskaitot lietojumus, piemēram, hromatīna imūnprecipitāciju (ChIP), kurai mazi fragmentu izmēri ir absolūti izšķiroši, lai iegūtu augstu izšķirtspēju. (sal. ar Tseng et al., 2012)
Plazmīdu DNS (pDNS) ir specifiska DNS forma, ko raksturo gredzena forma un kas atrodama baktērijās un dažos eukariotos.
Supercoiled pDNA ir vēlamā plazmīdu DNS forma, jo tā uzrāda vislabākos rezultātus lejupējos procesos, piemēram, automatizētā sekvencēšanā un transfekcijā. Ultrasonication ir piemērots, lai veiksmīgi fragmentētu pDNS, ieskaitot supercoiled pDNS.
(2008) pierādīja, ka plazmīdu ultraskaņas apstrāde, kas, kā zināms, fragmentē supercoiled DNS, ir efektīvs veids, kā uzlabot sekvences phred20 nolasīšanas garumus līdz tādam līmenim, ka tie būtiski neatšķiras no Beckman Coulter vadības veidnes vai fermentatīvi linearizētām plazmīdām.
- precīzi kontrolējams
- Reproducējami rezultāti
- Pielāgojams mērķa DNS fragmentu garumiem
- temperatūras kontrole
- Mērogojams jebkuram parauga lielumam
Plazmīdu vektoru izmantošana
Plazmīdas bieži izmanto kā instrumentus gēnu klonēšanai, pārnešanai un manipulēšanai ar tiem. Ja šiem nolūkiem eksperimentāli izmanto plazmīdas, tās sauc par vektoriem. DNS fragmentus vai gēnus var ievietot plazmīdas vektorā, radot tā saukto rekombinanto plazmīdu. Plazmīdu vektorus izmanto kā nesējus rekombinantās DNS ievadīšanai saimniekšūnā, un tie ir molekulārās klonēšanas galvenā sastāvdaļa.
“Ne-vīrusu vektori tiek plaši pētīti, lai tos varētu izmantot gēnu terapijā dažādu sarežģītu slimību ārstēšanai. Ne-vīrusu vektori aizsargā plazmīdu DNS pret fizikālu, ķīmisku un fermentatīvu degradāciju un nogādā DNS molekulu mērķa vietā. Piemēram, katjonu liposomas, hitozāns un citas pozitīvi uzlādētas nanodaļiņas veido kompleksus ar plazmīdu DNS, izmantojot elektrostatisko mijiedarbību. Tomēr viegli veidojamie katjonu liposomu/plazmīdu DNS kompleksi ir salīdzinoši lieli (t.i., 300–400 nm) un neviendabīgi, tāpēc tos ir grūti izmantot farmācijā. Lielos un neviendabīgos plazmīdu DNS / liposomas, plazmīdu DNS / aerosolus un plazmīdu DNS / peptīdu kompleksus var samazināt līdz mazākām un viendabīgām daļiņām, izmantojot ultrasonication.” (Sarker et al., 2019)
Spilgts plazmīdu vektoru izmantošanas piemērs ir CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9 sistēma parasti tiek piegādāta šūnām kā viena liela plazmīda vai vairākas mazākas plazmīdas, kas kodē mērķa secību, CRISPR ceļvedi un Cas9.
Ultraskaņas sagatavošana ar DNS ielādētām PLGA nanodaļiņām ar nanoprecipitāciju
(2020) izmantoja poli(pienskābes-koglikolskābes) (PLGA), lai izveidotu nanodaļiņu nesēju CRISPR–Cas9 plazmīdas modeļa nogādāšanai primārajos kaulu smadzeņu atvasinātajos makrofāgos. PLGA nanodaļiņu nanoprecipitācijai tika izmantota PLGA ar divām dažādām gala grupām (esteru un amīnu grupām) ar mērķi, lai pozitīvi lādētie amīna gala vāciņi palielinātu iekapsulēšanas efektivitāti un slodzi, pateicoties lādiņa mijiedarbībai starp to un DNS negatīvi lādēto mugurkaulu. 50 ml polipropilēna koniskā centrifūgas mēģenē 100 mg Pluronic F127 tika izšķīdināts 20 ml autoklāvētā DI ūdenī, sajaucot virpuli, kam sekoja 30 minūšu maiga ultraskaņas apstrāde, izmantojot ultraskaņas vannu (skatīt CupHorn). Tika pievienots autoklāvēts magnētiskais maisīšanas stienis, un šķīdums tika sajaukts ar 600 apgriezieniem minūtē 30 minūtes, kamēr tika izgatavoti pārējie šķīdumi. Stikla trauku vietā viscaur tika izmantoti plastmasas laboratorijas trauki, lai samazinātu nespecifisku DNS adsorbciju. PLGA šķīdumi, kas izšķīdināti DMF (44,48 mg/ ml) un TIPS pentacēna šķīdumi, kas izšķīdināti THF (0,667 mg/ml), tika pagatavoti atsevišķi. PLGA tika atstāts dīvaini, lai mitrinātu DMF 30 minūtes, pirms tas tika apstrādāts ar ultraskaņu 30 min (pilnu protokolu sk. Jo et al., 2020)
- DNS ekstrakcija
- DNS iekapsulēšana
- Ar nanodaļiņām pārklātas DNS dispersija
- Plazmīdu DNS ievadīšana šūnās
UP200St CupHorn paraugu netiešai apstrādei ar ultraskaņu, piemēram, DNS ekstrakcijai un sadrumstalotībai.
Plazmīdu DNS aizsardzība ultraskaņas apstrādes laikā
DNS, ieskaitot plazmīdas un virspusējās plazmīdas, ir ļoti jutīga noārdīšanās. Visas pieejamās sadrumstalotības metodes ir zināmas ar zināmiem trūkumiem. Ultraskaņas DNS fragmentācija ir viena no vēlamajām metodēm, jo kontrolēta ultraskaņas apstrāde kombinācijā ar aizsardzības pasākumiem ļauj samazināt bīdes un siltuma izraisītus DNS pavedienu bojājumus.
Bez zemas amplitūdas iestatījumiem, pulsācijas režīma un temperatūras kontroles ultraskaņas DNS nobīdes laikā dažu līdzekļu lietošana parādīja ievērojamu aizsargājošu iedarbību pret DNS degradāciju. Piemēram, dažādi polimēri, peptīdi un lipīdi aizsargā plazmīdu DNS ultrasonikācijas laikā.
Izmantojot agarozes gēla elektroforēzes testu, tika pētīta plazmīdu DNS un plazmīdu DNS/IL nanokompleksu stabilitāte pret ultraskaņas bīdes stresu. Gan plazmīdu DNS, gan plazmīdu DNS/IL nanokompleksi tika pakļauti ultraskaņas bīdes stresam dažādos laika punktos. Plazmīdu DNS tika pakļauta ultraskaņas bīdes stresam 0, 10, 20, 30 un 40 minūtes. Tomēr plazmīdu DNS/IL nanokompleksi tika pakļauti ultraskaņas bīdes stresam 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 un 120 minūtes.
(pētījums un attēls: ©Sarker et al., 2019)
(2019) pierādīja, ka tad, kad plazmīdas DNS / jonu šķidruma (pDNS/IL) nanostruktūras tika pakļautas ultraskaņas bīdes stresam 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 un 120 min un kompleksotas ar komerciāli pieejamo katjonu gēnu piegādes līdzekli lipofektamīnu, fluorescējošo pozitīvo šūnu procentuālais daudzums bija 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, attiecīgi 65% un 50% (sk. attēlu zemāk). Fluorescējošo pozitīvo šūnu procentuālais daudzums palielinājās, kad nanostruktūras tika pakļautas ultraskaņas bīdes stresam 10 un 20 minūtes, un pēc tam lēnām samazinājās.
Jonu šķidruma [Bmim][PF6] ietekme uz plazmīdu DNS piegādi COS7 šūnām. Plazmīdu DNS/IL (jonu šķidruma) nanokompleksi tika pakļauti ultraskaņas bīdes stresam līdz 120 minūtēm un kompleksoti ar LA pirms nogādāšanas COS7 šūnās. Dati parāda GFP pozitīvo HeLa šūnu vidējo skaitu (%) saskaitītas 10 dažādos mikroskopiskos laukos, un eksperiments tika veikts vairākas reizes trīs dažādās dienās. (Pētījums un diagramma: ©Sarker et al., 2019)
Plazmīdu DNS var aizsargāt, pievienojot līdzekli pirms ultraskaņas fragmentācijas: ultraskaņas izraisīta kailas pDNS (A) un pDNS noārdīšanās, kas formulēta ar 1,5 mM CaCl2 un 20% (v / v) t-butanolu (B)
Paraugi tika apstrādāti ar 20W zondi līdz 120 gadiem, kā norādīts katras joslas augšpusē. Josla H atbilst Hyperladder I ™️ marķierim. Ir norādītas OC un SC plazmīdu joslas.
(pētījums un attēli: ©Wu et al., 2009)
Ultraskaņas lizāta sagatavošana
Ultraskaņas šūnu līzes protokols
Sāk ar bagātinātu šūnu paraugu, kas sagatavots, izmantojot šūnu atdalīšanas metodi (piemēram, imūnmagnētisko šūnu atdalīšanu, fluorescences aktivētu šūnu šķirošanu (FACS), blīvuma gradienta centrifugēšanu, imūnblīvitātes šūnu izolēšanu).
Šūnu paraugiem jāparāda līzes bufera tilpums, kas ir piemērots eksperimentālajam mērķim un zondes tipa ultrasonikatoram.
Priekšroka dodama hipotoniskiem buferiem, jo tie uzlabo ultraskaņas šūnu līzi. Ir svarīgi, lai piedevas un sāls koncentrācija tiktu izmantota atbilstošā veidā.
Izvēlieties savu ultraskaņas līzes ierīci: Flakonu netiešai apstrādei ar ultraskaņu ieteicams izmantot VialTweeter vai CupHorn. Multiwell-plāksnēm UIP400MTP ir ideāls ultrasonikators. Un klasiskā zondes tipa ultraskaņas apstrāde, ultraskaņas homogenizators kā UP100H vai UP200Ht ar mikro-galu ir vispiemērotākais.
Protokols zondes tipa apstrādei ar ultraskaņu: Ievietojiet ultrasonicator zondi parauga tilpumā mikrocentrifūgas mēģenē un apstrādājiet ar ultraskaņu apmēram 10 sekundes. Atkarībā no DNS parauga ultraskaņas apstrādi var atkārtot vēl vienu vai divas reizes. Nepieciešamā ultraskaņas enerģijas ievade (Ws / ml) ir atkarīga no parauga viskozitātes un DNS tipa. Dzesēšana, izmantojot ledus vannu un ultrasonikatora pulsācijas režīmu, palīdz novērst, ka paraugs tiek termiski noārdīts.
Pēc ultraskaņas līzes paraugu centrifugē, lai atdalītu granulu atliekas (kas satur nelysed šūnas, kodolus un nelysed organellas)
Ja paraugu uzreiz neapstrādā tālāk, to var uzglabāt atbilstošā temperatūrā, lai saglabātu tā dzīvotspēju.
Ultrasonikatori DNS sadrumstalotībai
Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādas ultraskaņas platformas DNS, RNS un hromatīna sadrumstalotībai. Šīs dažādās platformas ietver ultraskaņas zondes (sonotrodes), netiešās ultraskaņas risinājumus vairāku cauruļu vai vairāku urbumu plākšņu vienlaicīgai paraugu sagatavošanai (piemēram, 96 urbumu plāksnes, mikrotitrēšanas plāksnes), sonoreaktori un ultraskaņas cuphorns. Visas DNS nobīdes platformas darbina frekvences noregulēti, augstas veiktspējas ultraskaņas procesori, kas ir precīzi kontrolējami un nodrošina reproducējamus rezultātus.
Ultraskaņas procesori jebkuram paraugu skaitam un lielumam
Ar Hielscher vairāku paraugu ultrasonikatoriem VialTweeter (līdz 10 mēģenēm) un UIP400MTP (mikroplatēm / multiwell plāksnēm) kļūst viegli iespējams samazināt paraugu apstrādes laiku, pateicoties intensīvai un precīzi kontrolējamai ultrasonikācijai, vienlaikus iegūstot vēlamo DNS fragmentu izmēru, sadalījumu un ražu. Ultraskaņas DNS sadrumstalotība padara plazmīdu sagatavošanas soļus efektīvus, uzticamus un mērogojamus. Protokolus var lineāri mērogot no viena līdz daudziem paraugiem, izmantojot nemainīgus ultraskaņas parametrus.
Zondes ultrasonatori ar vienu līdz pieciem pirkstiem ir ideāli piemēroti mazāku paraugu skaita sagatavošanai. Hielscher laboratorijas ultrasonikatori ir pieejami ar dažādiem jaudas līmeņiem, lai jūs varētu izvēlēties ideālu ultraskaņas traucētāju ar DNS saistītam lietojumam.
Ultraskaņas vairāku paraugu sagatavošanas vienība VialTweeter ļauj vienlaicīgi apstrādāt ar ultraskaņu līdz 10 flakoniem. Izmantojot piestiprināmo ierīci VialPress, līdz 4 papildu caurulēm var nospiest uz priekšu, lai intensīvi apstrādātu ultraskaņu.
Precīza procesa kontrole
Precīzi kontrolējami ultraskaņas iestatījumi ir izšķiroši, jo pilnīga sonifikācija var iznīcināt DNS, RNS un hromatīnu, bet nepietiekama ultraskaņas nobīde rada pārāk garus DNS un hromatīna fragmentus. Hielscher digitālos ultrasonikatorus var viegli iestatīt uz precīzu ultraskaņas parametru. Konkrētus ultraskaņas iestatījumus var saglabāt arī kā ieprogrammētu iestatījumu, lai ātri atkārtotu to pašu procedūru.
Visas ultraskaņas apstrāde tiek automātiski protokolēta un saglabāta kā CSV fails iebūvētajā SD kartē. Tas ļauj precīzi dokumentēt veiktos izmēģinājumus un ļauj viegli pārskatīt ultraskaņas braucienus.
Izmantojot pārlūka tālvadības pulti, visus digitālos ultrasonatorus var darbināt un uzraudzīt, izmantojot jebkuru standarta pārlūkprogrammu. Papildu programmatūras instalēšana nav nepieciešama, jo LAN savienojums ir ļoti vienkāršs plug-n-play iestatījums.
Augstākā lietotājdraudzīgums ultraskaņas DNS sagatavošanas laikā
Visi Hielscher ultrasonikatori ir paredzēti, lai nodrošinātu augstas veiktspējas ultraskaņu, tajā pašā laikā vienmēr ir ļoti lietotājam draudzīgi un viegli lietojami. Visi iestatījumi ir labi strukturēti skaidrā izvēlnē, kurai var viegli piekļūt, izmantojot krāsainu skārienekrānu vai pārlūkprogrammas tālvadības pulti. Viedā programmatūra ar programmējamiem iestatījumiem un automātisku datu ierakstīšanu nodrošina optimālus ultraskaņas iestatījumus, lai iegūtu uzticamus un reproducējamus rezultātus. Tīrs un viegli lietojams izvēlnes interfeiss pārvērš Hielscher ultrasonikatorus par lietotājam draudzīgām un efektīvām ierīcēm.
Zemāk redzamajā tabulā ir sniegta norāde par mūsu laboratorijas ultrasonikatoru aptuveno apstrādes jaudu šūnu līzei un DNS sadrumstalotībai:
| Partijas apjoms | Plūsmas ātrums | Ieteicamās ierīces |
|---|---|---|
| Vairāku urbumu plāksnes | Nav | UIP400MTP |
| flakoni, maza vārglāze | Nav | Ultraskaņas CupHorn |
| līdz 10 flakoniem | Nav | VialTweeter |
| 1 līdz 500 ml | 10 līdz 200 ml/min | UP100H |
| 10 līdz 2000 ml | 20 līdz 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
Sazinieties ar mums! / Jautājiet mums!
Literatūra / Atsauces
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
Fakti, kurus ir vērts zināt
Kas ir plazmīdas?
Plazmīda ir maza apļveida DNS molekula, kas ir fiziski atdalīta no hromosomu DNS un replicējas neatkarīgi. Plazmīdas bieži ir saistītas ar gēniem, kas veicina organisma izdzīvošanu un sniedz specifiskas priekšrocības, piemēram, rezistenci pret antibiotikām. Plazmīdas visbiežāk sastopamas kā mazas apļveida, divvirzienu DNS molekulas baktērijās; Tomēr plazmīdas dažreiz ir sastopamas arheju un eikariotu organismos. Plazmīdas ir svarīgi instrumenti molekulārajā bioloģijā, ģenētikā, bioķīmijā un zinātnē par dzīvību. Pazīstami kā vektori gēnu inženierijā, plazmīdas tiek izmantotas, lai replicētu vai izteiktu noteiktus gēnus. Vektora mērķtiecīgu pārveidošanu sauc par vektora dizainu.
GFP analīze šūnu izpētē
Zaļais fluorescējošais proteīns (GFP) ir daudzpusīgs bioloģiskais marķieris fizioloģisko procesu uzraudzībai, proteīnu lokalizācijas vizualizēšanai un transgēnās ekspresijas noteikšanai in vivo. GFP var ierosināt 488 nm lāzera līnija, un to optimāli nosaka pie 510 nm.
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus no Lab līdz rūpnieciskais izmērs.