Ultrasonication ir uzticama metode, lai fragmentētu plazmīdu DNS. Precīzi kontrolējama amplitūda, pulsācijas režīms un temperatūras kontrole ir svarīgākās ultrasonicator iezīmes, lai nesabojātu plazmīdu sadrumstalotību. Turklāt dažu līdzekļu izmantošana palīdz aizsargāt pret plazmīdu noārdīšanos. Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus risinājumus kontrolētai plazmīdu sadrumstalotībai no atsevišķiem flakoniem, vienlaikus daudzu paraugu ultraskaņas apstrādei, kā arī vairāku aku plāksnēm. Uzziniet vairāk par veiksmīgu ultraskaņas plazmīdu sadrumstalotību!

Plazmīdu nobīde, izmantojot ultrasonication

Kad DNS paraugi tiek pakļauti ultraskaņas viļņiem, ultrasoniski radītās vibrācijas rada akustisku kavitāciju šķidrumā, kas ar mehāniskiem spēkiem nobīdās vai izjauc augstas molekulmasas DNS molekulas. Ultraskaņas apstrāde ir visplašāk izmantotā metode lielapjoma DNS nobīdes eksperimentiem, tostarp lietojumiem, piemēram, hromatīna imūnprecipitācijai (ChIP), kurai mazi fragmentu izmēri ir absolūti nepieciešami, lai iegūtu augstu izšķirtspēju. (sal.: Tseng et al., 2012)
Plazmīdu DNS (pDNS) ir specifiska DNS forma, ko raksturo tās gredzena forma, un tā ir atrodama baktērijās un dažos eikariotos.
Supercoiled pDNS ir vēlamais plazmīdu DNS veids, jo tas parāda vislabākos rezultātus lejupstraumes procesos, piemēram, automatizētā sekvencēšanā un transfekcija. Ultrasonication ir piemērots, lai veiksmīgi sadrumstalotu pDNS, ieskaitot pārkarsētu pDNS.
(2008) pierādīja, ka plazmīdu ultraskaņas apstrāde, kas, kā zināms, fragmentē supercoiled DNS, ir efektīvs veids, kā uzlabot sekvences phred20 lasīšanas garumus līdz tādam līmenim, ka tie būtiski neatšķiras no Beckman Coulter kontroles veidnes vai fermentatīvi linearizētām plazmīdām.

Plazmīdu vektoru izmantošana

Plazmīdas bieži izmanto kā instrumentus gēnu klonēšanai, pārnešanai un manipulācijām ar tiem. Ja šiem nolūkiem eksperimentāli tiek izmantotas plazmīdas, tās sauc par vektoriem. DNS fragmentus vai gēnus var ievietot plazmīdu vektorā, radot tā saukto rekombinanto plazmīdu. Plazmīdu vektorus izmanto kā nesējus, lai rekombinanto DNS iedzītu saimniekšūnā, un tie ir molekulārās klonēšanas galvenā sastāvdaļa.
“Ne-vīrusu vektori tiek plaši pētīti par to iespējamo izmantošanu gēnu terapijā dažādu sarežģītu slimību ārstēšanai. Ne-vīrusu vektori aizsargā plazmīdu DNS pret fizikālu, ķīmisku un fermentatīvu noārdīšanos un nogādā DNS molekulu mērķa vietā. Piemēram, katjonu liposomas, hitozāns un citas pozitīvi uzlādētas nanodaļiņas veido kompleksus ar plazmīdu DNS, izmantojot elektrostatisku mijiedarbību. Tomēr viegli veidotie katjonu liposomu/plazmīdu DNS kompleksi ir salīdzinoši lieli (t.i., 300–400 nm) un neviendabīgi pēc būtības, tāpēc tos ir grūti izmantot farmaceitiskiem lietojumiem. Lielos un neviendabīgos plazmīdu DNS/liposomus, plazmīdu DNS/aerosolus un plazmīdu DNS/peptīdu kompleksus var reducēt līdz mazākām un viendabīgām daļiņām, izmantojot ultrasonikāciju.” (Sarker et al., 2019)
Uzskatāms piemērs plazmīdu vektoru izmantošanai ir CRISPR–Cas9. CRISPR–Cas9 sistēma parasti tiek piegādāta šūnām kā viena liela plazmīda vai vairākas mazākas plazmīdas, kas kodē mērķa sekvenci, CRISPR rokasgrāmatu un Cas9.

Ar DNS ielādētu PLGA nanodaļiņu ultraskaņas sagatavošana ar nanoprecipitāciju

(2020) izmantoja poli(pienskābes-ko-glikolskābi) (PLGA), lai izveidotu nanodaļiņu nesēju CRISPR–Cas9 plazmīdas modeļa piegādei primārajos kaulu smadzeņu atvasinātajos makrofāgos. PLGA nanodaļiņu nanoprecipitācijai tika izmantota PLGA ar divām dažādām gala grupām (estera un amīnu grupām), lai pozitīvi lādētie amīna galu vāciņi palielinātu iekapsulēšanas efektivitāti un slodzi lādiņa mijiedarbības dēļ starp to un negatīvi lādēto DNS mugurkaulu. 50 ml polipropilēna koniskās centrifūgas mēģenē 100 mg pluronic F127 izšķīdināja 20 ml autoklāvēta DI ūdens ar virpuļmaisīšanu, kam sekoja 30 min maigas ultraskaņas apstrāde, izmantojot ultraskaņas vannu (skatīt CupHorn). Tika pievienots autoklāvēts magnētiskais maisīšanas stienis, un šķīdumu sajauca ar 600 apgriezieniem minūtē 30 minūtes, kamēr tika izgatavoti pārējie šķīdumi. Stikla trauku vietā tika izmantoti plastmasas laboratorijas trauki, lai samazinātu DNS nespecifisko adsorbciju. Atsevišķi tika sagatavoti PLGA šķīdumi, kas izšķīdināti DMF (44,48 mg/ml), un TIPS pentacēns, kas izšķīdināts THF (0,667 mg/ml). PLGA tika atstāta 30 minūtes, lai mitrinātu DMF, pirms tā tika apstrādāta ar ultraskaņu 30 min. (pilnu protokolu sk. Jo et al., 2020)

Plazmīdu DNS aizsardzība ultraskaņas apstrādes laikā

DNS, ieskaitot plazmīdas un pārkarsētas plazmīdas, ir ļoti jutīga degradācija. Visas pieejamās sadrumstalotības metodes ir zināmas dažiem trūkumiem. Ultraskaņas DNS sadrumstalotība ir viena no vēlamajām metodēm, jo kontrolēta ultraskaņas apstrāde kombinācijā ar aizsardzības pasākumiem ļauj samazināt bīdes un siltuma izraisītu DNS dzīslu bojājumus.
Papildus zemiem amplitūdas iestatījumiem, pulsācijas režīmam un temperatūras kontrolei ultraskaņas DNS nobīdes laikā dažu līdzekļu lietošana parādīja ievērojamu aizsargājošu efektu pret DNS degradāciju. Piemēram, dažādi polimēri, peptīdi un lipīdi aizsargā plazmīdu DNS ultrasonication laikā.

Plazmīdas DNS un plazmīdu DNS/IL nanokompleksu stabilitāte pret ultraskaņas bīdes stresu tika pētīta, izmantojot agarozes gēla elektroforēzes testu. Gan plazmīdas DNS, gan plazmīdu DNS/IL nanokompleksi tika pakļauti ultraskaņas bīdes stresam dažādos laika punktos. Plazmīdas DNS tika pakļauta ultraskaņas bīdes stresam 0, 10, 20, 30 un 40 minūtes. Tomēr plazmīdu DNS /IL nanokompleksi tika pakļauti ultraskaņas bīdes stresam 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 un 120 minūtēs.
(pētījums un attēls: ©Sarker et al., 2019)

(2019) pierādīja, ka tad, kad plazmīdu DNS / jonu šķidruma (pDNS/IL) nanostruktūras tika pakļautas ultraskaņas bīdes stresam 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 un 120 min un kompleksā ar komerciāli pieejamo katjonu gēnu piegādes aģentu lipofektamīnu, fluorescējošo pozitīvo šūnu procentuālais daudzums bija 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, attiecīgi 65% un 50% (sk. tabulu zemāk). Fluorescējošo pozitīvo šūnu procentuālais daudzums palielinājās, kad nanostruktūras tika pakļautas ultraskaņas bīdes stresam 10 un 20 min, un pēc tam lēnām samazinājās.

Jonu šķidruma [Bmim][PF6] ietekme uz plazmīdu DNS piegādi COS7 šūnām. Plazmīdu DNS/IL (jonu šķidruma) nanokompleksi tika pakļauti ultraskaņas bīdes stresam līdz 120 minūtēm un kompleksi ar LA pirms nokļūšanas COS7 šūnās. Dati parāda GFP pozitīvo HeLa šūnu vidējo skaitu (%), kas saskaitītas 10 dažādos mikroskopiskos laukos, un eksperiments tika veikts vairākas reizes trīs dažādās dienās. (Pētījums un diagramma: ©Sarker et al., 2019)

Ultraskaņas lizāta sagatavošana

Ultraskaņas šūnu līzes protokols
Sāciet ar bagātinātu šūnu paraugu, kas sagatavots, izmantojot šūnu atdalīšanas metodi (piemēram, imūnmagnētisko šūnu atdalīšanu, fluorescences aktivēto šūnu šķirošanu (FACS), blīvuma gradienta centrifugēšanu, imūndensitātes šūnu izolāciju).
Šūnu paraugiem jāparāda līzes bufera tilpums, kas ir piemērots eksperimenta mērķim un zondes tipa ultrasonicator.
Priekšroka tiek dota hipotoniskiem buferiem, jo tie uzlabo ultraskaņas šūnu līzi. Ir svarīgi, lai piedevas un sāls koncentrācija tiktu izmantota atbilstošā veidā.
Izvēlieties ultraskaņas līzes ierīci: Flakonu netiešai ultraskaņas apstrādei ieteicams lietot VialTweeter vai CupHorn. Daudzvirzienu plāksnēm UIP400MTP ir ideāls ultrasonicator. Un vispiemērotākie ir klasiskā zondes tipa ultraskaņas apstrāde, ultraskaņas homogenizators kā UP100H vai UP200Ht ar mikrogalu.
Protokols zondes tipa ultraskaņas apstrādei: Ievietojiet ultrasonikatora zondi parauga tilpumā mikrocentrifuge mēģenē un apstrādājiet ar ultraskaņu apmēram 10 sekundes. Atkarībā no DNS parauga ultraskaņas apstrāde var tikt atkārtota vēl vienu vai divas reizes. Nepieciešamā ultraskaņas enerģijas ievade (Ws / ml) ir atkarīga no parauga viskozitātes un DNS tipa. Dzesēšana, izmantojot ledus vannu un ultrasonikatora pulsācijas režīmu, palīdz novērst to, ka paraugs ir termiski noārdījies.
Pēc ultraskaņas līzes paraugu centrifugē, lai atdalītu granulu atliekas (kas satur nevērtinātas šūnas, kodolus un nevērtinātas organellas)
Ja paraugu uzreiz neapstrādā tālāk, to var uzglabāt piemērotā temperatūrā, lai saglabātu tā dzīvotspēju.

Ultrasonikatori DNS sadrumstalotībai

Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādas ultraskaņas platformas DNS, RNS un hromatīna fragmentācijai. Šīs dažādās platformas ietver ultraskaņas zondes (sonotrodes), netiešus ultraskaņas šķīdumus vairāku cauruļu vai daudzaizdevumu plākšņu (piemēram, 96 urbumu plākšņu, mikrotitru plākšņu), sonoreaktoru un ultraskaņas kušeronu vienlaicīgai paraugu sagatavošanai. Visas DNS bīdes platformas darbina ar frekvencē noregulētiem augstas veiktspējas ultraskaņas procesoriem, kas ir precīzi kontrolējami un nodrošina reproducējamus rezultātus.

Ultraskaņas procesori jebkuram parauga numuram un izmēram

Ar Hielscher vairāku paraugu ultrasonikatoriem VialTweeter (līdz 10 mēģenēm) un UIP400MTP (mikroplatēm / multiwell plāksnēm) kļūst viegli iespējams samazināt paraugu apstrādes laiku intensīvas un precīzi kontrolējamas ultrasonikācijas dēļ, vienlaikus iegūstot vēlamo DNS fragmentu lieluma sadalījumu un ražu. Ultraskaņas DNS sadrumstalotība padara plazmīdu sagatavošanas soļus efektīvus, uzticamus un mērogojamus. Protokolus var lineāri mērogot no viena līdz daudziem paraugiem, izmantojot pastāvīgus ultraskaņas parametrus.
Zondes ultrasonikatori ar vienu līdz pieciem pirkstiem ir ideāli piemēroti mazāku paraugu numuru sagatavošanai. Hielscher laboratorijas ultrasonikatori ir pieejami ar dažādiem jaudas līmeņiem, lai jūs varētu izvēlēties ideālu ultraskaņas traucētāju ar DNS saistītai lietojumprogrammai.