Mikroplates ultraskaņošana „Shotgun“ proteomikā – Lietošanas norādījumi

„Shotgun“ proteomika ir atkarīga no efektīvas un reproducējamas paraugu sagatavošanas, lai sarežģītu bioloģisko materiālu pārvērstu par LC-MS/MS analīzei piemērotiem peptīdiem. UIP400MTP mikropaketes ultraskaņas iekārta atbalsta šo procesu, nodrošinot standartizētu un paralēlu maza tilpuma paraugu apstrādi ar ultraskaņu, tādējādi palīdzot laboratorijām uzlabot šūnu sadrupināšanu, ekstrakciju un atkārtotu šķīdināšanu darba plūsmās, kas balstās uz mikropaketu izmantošanu. Šajā lietošanas pamācībā ir aprakstīts, kā UIP400MTP var integrēt proteomikas paraugu sagatavošanā, izmantojot publicētu ekstracelulāro vezikulu darba plūsmu no PLA2G12A/Th17 pētījumiem kā laboratorijā pārbaudītu piemēru.

Mikroplates ultraskaņošana, lai panāktu labāku reproducējamību „shotgun“ proteomikā

Proteomikas pētniekiem reproducējama paraugu sagatavošana ir izšķiroša, lai iegūtu augstas kvalitātes LC-MS/MS datus. UIP400MTP mikroplates ultraskaņas apstrādes iekārta nodrošina standartizētu, paralēlu ultraskaņas apstrādi gan plāksnēs balstītos, gan maza tilpuma/augstas caurlaidspējas darba procesos.

Tas ir īpaši noderīgi laboratorijām, kas strādā ar:

• Lieli paraugu kopumi, kuru apstrādei nepieciešama vienota pieeja daudzās akās
• Materiāls ar ierobežotu ieejas daudzumu, kurā parauga zudums un variabilitāte ir jāsamazina līdz minimumam
• Paraugi ar augstu lipīdu saturu, piemēram, ekstracelulārās vezikulas
• Sarežģīti bioloģiski preparāti, kuriem nepieciešama efektīva šūnu sadrupināšana, ekstrakcija vai atkārtota šķīdināšana
• Salīdzinošā šautenes proteomika, kurā būtiska nozīme ir reproducējamībai dažādos apstākļos un atkārtojumos

Iekļaujot mikroplates ultraskaņošanu pirms hidrolīzes, pētnieki var uzlabot paraugu gatavību:

• Olbaltumvielu ekstrakcija un atkārtota šķīdināšana
• Trypsīna/Lys-C hidrolīze
• Datu ieguve ar Nano-LC/MS/MS
• Kvantitatīvā proteomikas analīze pēc sintezēšanas

 

Paplašiniet savu proteomikas paraugu sagatavošanas procesu ar pārliecību!
Uzziniet, kā mikropaketes ultraskaņošana palīdz samazināt manuālo variabilitāti, uzlabot paraugu sadalīšanu un sagatavot sarežģītus bioloģiskos paraugus uzticamai LC-MS/MS analīzei.

Informācijas pieprasījums


E-pasta adrese (obligāti)


Produkts vai interešu joma



Es piekrītu privātuma politikai









Pieprasīt informāciju

Mikroplates ultraskaņošana var nodrošināt šādus ieguvumus:

• Proteomikas pamatlaboratorijas
• EV pētniecības laboratorijas
• Imunoloģijas un šūnu bioloģijas laboratorijas
• Translacionālās pētniecības grupas
• Dabaszinātņu komandas, kas paplašina darbības jomu no viena parauga sagatavošanas līdz darba plūsmām ar lielāku caurlaidspēju

Augstas caurlaidspējas paraugu sagatavošana ekstracelulāro vezikulu proteoma analīzei

Kas ir „Shotgun“ proteomika?

„Shotgun“ proteomika ir kļuvusi par galveno analītisko stratēģiju sarežģītu bioloģisko paraugu raksturošanai — sākot no veselu šūnu lizātiem un audu ekstraktiem līdz attīrītiem organoīdiem, ekstracelulārajām vezikulām un klīniskajiem paraugiem ar nelielu ievadi. Tās galvenā priekšrocība slēpjas proteīnu hidrolīzes, augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas un tandēma masu spektrometrijas, kā arī datorizētas peptīdu-proteīnu attiecības noteikšanas apvienošanā. Tomēr galīgā proteoma datu kopuma kvalitāte tiek noteikta jau ilgi pirms paraugs nonāk masu spektrometrā. Efektīva parauga sadalīšana, proteīnu šķīdināšana, traucējošo vielu noņemšana, reproducējama enzīmatiskā hidrolīze un stabila peptīdu atgūšana ir izšķiroši faktori, kas nosaka pārklājuma dziļumu un kvantitatīvo uzticamību.
Proteomikas pētniekiem un dabaszinātņu laboratorijām, kas strādā ar ierobežotu vai vērtīgu paraugu daudzumu, paraugu sagatavošana bieži vien ir galvenais šķērslis.

Ārpusšūnu vezikulu radītie izaicinājumi proteomikā

Piemēram, ekstracelulārās vezikulas (EV) ir īpaši sarežģīta paraugu klase. Tās ir ar membrānu apvalkotas, lipīdu bagātas, nanomēroga daļiņas ar salīdzinoši zemu proteīnu iznākumu un augstu risku, ka tajās var nokļūt lipīdi, sāļi, deterģenti, seruma proteīni un citi matricas komponenti. Šīs īpašības var traucēt hidrolīzes efektivitāti, hromatogrāfisko veiktspēju, elektrosprādziena stabilitāti un peptīdu identifikāciju. Tāpēc EV proteomikas paraugu sagatavošanas procesam jābūt pietiekami spēcīgam, lai izjauktu vezikulu struktūras un padarītu proteīnu saturu šķīstošu, vienlaikus saglabājot saderību ar turpmāko fermentatīvo hidrolīzi un LC-MS/MS analīzi.
Šajā kontekstā ar mikroplāksnēm saderīga ultraskaņas apstrāde piedāvā praktisku pieeju reproducējamai, paralēlai paraugu apstrādei. Hielscher mikropateņu ultraskaņas apstrādes iekārtu modeļi UIP400MTP (400 W) un UIP550MTP (550 W) ir paredzēti paraugu apstrādei ar ultraskaņu daudzbedrīšu plāksnēs un maza tilpuma traukos, nodrošinot augstāku caurlaidspēju nekā tradicionālās ultraskaņas iekārtas ar vienu zondi. Proteomikas laboratorijām šis formāts ir pievilcīgs, jo tas var samazināt manuālo variabilitāti, uzlabot vairāku paraugu paralēlu apstrādi un dabiskāk integrēties plāksnēs balstītajās paraugu sagatavošanas procesa ķēdēs.

Paraugdarba plūsma

Nesen veiktais ekstracelulāro vezikulu proteomikas darba process PLA2G12A regulēto Th17 šūnu bioloģijā sniedz noderīgu, laboratorijā pārbaudītu piemēru tam, kā mikroplates ultraskaņas iekārtu UIP400MTP var iekļaut „shotgun” proteomikas paraugu sagatavošanā. Šajā pētījumu sērijā EV paraugi tika apstrādāti proteoma analīzei, izmantojot metanola apstrādi, UIP400MTP ultraskaņošanu, centrifugēšanu, žāvēšanu, tripsīna/Lys-C hidrolīzi un nano-plūsmas LC-augstas izšķirtspējas tandēma MS. Par šo pašu bioloģisko pētījumu sākotnēji tika ziņots kā bioRxiv priekšizdevums, un vēlāk tas tika publicēts žurnālā „Cell Reports”, kur proteomikas analīze palīdzēja raksturot, kā PLA2G12A maina EV kravas proteīnus patogēno T-šūnu reakciju kontekstā.

Multi-well plāksnes ultraskaņas UIP400MTP

Kāpēc izmantot ultraskaņas apstrādi mikroplāksnēm?
UIP400MTP ļauj veikt standartizētu, paralēlu maza tilpuma paraugu ultraskaņošanu. Tas ir noderīgi gadījumos, kad svarīga ir reproducējamība, neliels ievadāmais parauga daudzums un daudzu paraugu apstrādes jauda.

Kvalitātes kontroles pārbaudes lapa

• Pārliecinieties, ka visos paraugos ir ievadīts vienāds EV proteīna ekvivalents.
• Izmantojiet randomizētus vai līdzsvarotus paraugu apstrādes izkārtojumus.
• Metanola tilpumam, ultraskaņas apstrādes ilgumam, žāvēšanas ilgumam un sadalīšanas tilpumam jābūt nemainīgiem.
• Uzraugiet peptīdu iznākumu un kopējo proteīnu identifikāciju.
• Pārbaudiet nepareizi sadalīto peptīdu īpatsvaru un peptīdu garuma sadalījumu.
• Pārbaudiet hromatogrāfiskā pīķa formu un retencijas laika reproducējamību.
• Iekļaujiet tukšās vietas, lai kontrolētu pārnesumu.
• Lielāka mēroga pētījumos izmantojiet apvienotus kvalitātes kontroles paraugus.
• Aprēķiniet atkārtojuma variācijas koeficientu.
• Izmantojiet PCA vai līdzīgas metodes, lai identificētu partiju ietekmi vai noviržu paraugus.

Ieteikumi protokolu sastādīšanai

Publicējot vai dokumentējot šo darba plūsmu, norādiet EV ievadīto daudzumu, plāksnes formātu, metanola tilpumu, UIP400MTP amplitūdu un ultraskaņošanas laiku, centrifugēšanas apstākļus, žāvēšanas metodi, hidrolīzes buferu, fermentu koncentrāciju, hidrolīzes laiku, paskābināšanas apstākļus, LC-MS/MS platformu, datu ieguves režīmu, programmatūras versiju, datu bāzi, FDR slieksni, normalizācijas metodi un statistisko darba plūsmu.
Visi Hielscher mikropateņu ultraskaņas iekārtas automātiski reģistrē svarīgus procesa parametrus, piemēram, amplitūdu, ultraskaņas apstrādes ilgumu un temperatūru, norādot datumu un laiku, un saglabā tos kā CSV failu integrētajā SD kartē. Datu protokolēšana atkārtojamības un kvalitātes kontroles nolūkos nekad nav bijusi vienkāršāka!

Pētījuma detalizēts apraksts: EV Shotgun proteomika PLA2G12A pētījumā

PLA2G12A pētījums sniedz konkrētu piemēru par UIP400MTP izmantošanu „shotgun” proteomikas darba plūsmā. Bioloģiskais jautājums bija, kā sekretētā fosfolipāze PLA2G12A modificē no Th17 šūnām atvasinātās ekstracelulārās vezikulas un tādējādi ietekmē patogēno T-šūnu diferenciāciju. Autori parādīja, ka PLA2G12A iedarbojas uz EV membrānām, ražojot lizofosfolipīdus, tostarp 1-oleoil-lizofosfatidiletanolamīnu, un ka tālākā lizofosfatīdskābes signālu pārraide ar LPA2 starpniecību veicina Th17 diferenciāciju. Papildus lipīdu signālceļiem pētījumos tika izvērtēts arī EV saturs, tostarp RNS un proteīnu saturs, tādējādi padarot šautenes proteomiku par svarīgu raksturošanas stratēģijas sastāvdaļu.
EV sagatavošanas procesā Th17 šūnas tika kultivētas barotnē, kas saturēja eksosomām atbrīvotu liellopu augļa serumu. Kultūras supernatantus vispirms centrifugēja, lai atdalītu šūnas, filtrēja caur 0,22 µm filtru, koncentrēja ar ultrafiltrāciju/ultracentrifugēšanu, mazgāja, atkārtoti suspendēja PBS un kvantificēja ar BCA proteīna analīzi. Šis EV sagatavošanas posms pirms turpmākajiem posmiem nodrošināja, ka proteomikas procesā varēja iekļaut noteiktu, proteīniem ekvivalentu EV materiāla daudzumu.
„Shotgun“ proteomikas analīzei autori izmantoja EV paraugus, kas atbilda 5 µg proteīna ekvivalentiem. Šos paraugus izžāvēja PCR mēģenēs un pievienoja 25 µL metanola. Pēc tam paraugus 3 minūtes apstrādāja ar ultraskaņu, izmantojot UIP400MTP mikroplates ultraskaņas iekārtu. Pēc ultraskaņošanas paraugus centrifugēja 4 °C temperatūrā 20 minūtes ar 19 000 × g. Pēc 20 µL supernatanta noņemšanas paraugus centrifugēja līdz pilnīgai izžūšanai. Pēc tam proteīnus izšķīdināja, apstrādājot ar ultraskaņu 4 µL tripsīna/Lys-C šķīdumā ar koncentrāciju 100 ng/µL 50 mM amonija bikarbonāta šķīdumā. Sadalīšanu veica 2 stundas 37 °C temperatūrā, kratot ar ātrumu 300 apgr./min. Sadalīto vielu paskābināja ar 1 µL 1,25 % trifluoroetiķskābes un pakļāva nano-plūsmas LC-augstas izšķirtspējas tandēma masu spektrometrijai.
Šī darba plūsma izceļ vairākus noderīgus principus proteomikai ar nelielu EV ievadi. Pirmkārt, ievadi normalizēja pēc proteīna ekvivalenta, kas ir svarīgi, salīdzinot EV no dažādiem genotipiem vai ārstēšanas režīmiem. Otrkārt, pirms ultraskaņošanas tika izmantots metanols, kas veicināja šūnu membrānu sadalīšanos un ekstrakciju, vienlaikus izvairoties no detergentu sistēmām, kas var apgrūtināt LC-MS/MS analīzi. Treškārt, ultraskaņošanas posms bija īss un standartizēts, kas ir saderīgs ar paralēlu paraugu apstrādi. Ceturtkārt, tripsīna/Lys-C hidrolīze tika veikta ļoti mazā tilpumā, samazinot atšķaidījumu un veicinot peptīdu atgūšanu no paraugiem ar nelielu ievadi. Visbeidzot, tieša pāreja no hidrolīzes uz paskābināšanu un LC-MS/MS analīzi samazināja nevajadzīgos apstrādes posmus.
Pēcapstrādes LC-MS/MS metodē tika izmantota nano-plūsmas apgrieztās fāzes separācija, kas savienota ar Q-Exactive HF Orbitrap masu spektrometru. Paraugi tika uztverti uz C18 priekškolonnas, pēc tam atdalīti uz analītiskās kolonnas ar 50 µm iekšējo diametru, plūsmas ātrumā 200 nL/min un temperatūrā 40 °C. Gradients 60 minūšu laikā mainījās no zema organiskā šķīdinātāja satura līdz 35 % šķīdinātāja B, kam sekoja skalošana ar augstu organiskā šķīdinātāja saturu un atkārtota līdzsvarošana. MS datu ieguve tika veikta pozitīvo jonu režīmā, izmantojot no datiem neatkarīgu datu ieguvi ar augstākas enerģijas sadursmju disociāciju. DIA neapstrādātie faili tika analizēti, izmantojot programmu DIA-NN 1.8 ar in silico prognozētu spektru bibliotēku.