Mikroplašu apstrāde ar ultraskaņu shotgun proteomikā – pielietojuma apraksts

Shotgun proteomika ir atkarīga no efektīvas, reproducējamas paraugu sagatavošanas, lai sarežģītu bioloģisko materiālu pārvērstu peptīdos, kas ir gatavi LC-MS/MS analīzei. Mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP atbalsta šo procesu, nodrošinot standartizētu, paralēlu neliela tilpuma paraugu apstrādi ar ultraskaņu un palīdzot laboratorijām uzlabot sagraušanu, ekstrakciju un atkārtotu šķīdināšanu darbplūsmās, kurās izmanto mikroplates. Šajā pielietojuma aprakstā izklāstīts, kā UIP400MTP var integrēt paraugu sagatavošanā proteomikas analīzei, kā laboratorijā pārbaudītu piemēru izmantojot publicētu ārpusšūnu vezikulu darbplūsmu no PLA2G12A/Th17 pētījumiem.

Mikroplašu apstrāde ar ultraskaņu reproducējamākai shotgun proteomikai

Proteomikas pētniekiem reproducējama paraugu sagatavošana ir izšķiroša augstas kvalitātes LC-MS/MS datu iegūšanai. Mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP nodrošina standartizētu, paralēlu apstrādi ar ultraskaņu darbplūsmās, kurās izmanto plates, kā arī neliela tilpuma paraugu darbplūsmās ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu.

Tā ir īpaši noderīga laboratorijām, kas strādā ar:

• Lieliem paraugu kopumiem, kuriem nepieciešama vienāda apstrāde daudzās iedobēs
• Materiālu, kas pieejams ierobežotā sākotnējā daudzumā un kura apstrādē līdz minimumam jāsamazina paraugu zudumi un mainīgums
• Lipīdiem bagātiem paraugiem, piemēram, ārpusšūnu vezikulām
• Sarežģītiem bioloģiskiem preparātiem, kuriem nepieciešama efektīva sagraušana, ekstrakcija vai atkārtota šķīdināšana
• Salīdzinošo shotgun proteomiku, kurā būtiska ir reproducējamība dažādos apstākļos un atkārtojumos

Iekļaujot mikroplašu apstrādi ar ultraskaņu pirms šķelšanas, pētnieki var uzlabot paraugu sagatavotību šādiem posmiem:

• Olbaltumvielu ekstrakcija un atkārtota šķīdināšana
• Šķelšana ar tripsīnu/Lys-C
• Datu iegūšana ar nano-LC/MS/MS
• Turpmākā kvantitatīvā proteomikas analīze

Mikroplašu apstrāde ar ultraskaņu var būt noderīga:

• Proteomikas koplietošanas infrastruktūras centriem
• EV pētniecības laboratorijām
• Imunoloģijas un šūnu bioloģijas laboratorijām
• Translācijas pētniecības grupām
• Dzīvības zinātņu komandām, kas pāriet no atsevišķu paraugu sagatavošanas uz darbplūsmām ar lielāku paraugu apstrādes ražīgumu

Paraugu sagatavošana ar augstu apstrādes ražīgumu ārpusšūnu vezikulu proteoma analīzei

Kas ir shotgun proteomika?

Shotgun proteomika ir kļuvusi par vienu no galvenajām analītiskajām stratēģijām sarežģītu bioloģisko paraugu raksturošanai – no veselu šūnu lizātiem un audu ekstraktiem līdz attīrītām organellām, ārpusšūnu vezikulām un klīniskajiem paraugiem ar nelielu sākotnējā materiāla daudzumu. Tās galvenā priekšrocība ir olbaltumvielu šķelšanas, šķidruma hromatogrāfijas un augstas izšķirtspējas tandēma masspektrometrijas, kā arī skaitļošanas metožu izmantošanas apvienošana, lai no peptīdu datiem secinātu olbaltumvielu identitāti. Tomēr galīgās proteoma datu kopas kvalitāte tiek noteikta ilgi pirms paraugs sasniedz masspektrometru. Efektīva paraugu sagraušana, olbaltumvielu šķīdināšana, traucējošo vielu atdalīšana, reproducējama fermentatīvā šķelšana un uzticama peptīdu atgūšana ir izšķiroši faktori proteoma pārklājuma dziļumam un kvantitatīvo rezultātu uzticamībai.
Proteomikas pētniekiem un dzīvības zinātņu laboratorijām, kas strādā ar ierobežotā daudzumā pieejamiem vai vērtīgiem paraugiem, paraugu sagatavošana bieži ir procesu ierobežojošais posms.

Ārpusšūnu vezikulu radītie izaicinājumi proteomikā

Piemēram, ārpusšūnu vezikulas (EV) ir īpaši sarežģīta paraugu klase. Tās ir ar membrānu norobežotas, lipīdiem bagātas nanomēroga daļiņas ar salīdzinoši zemu olbaltumvielu iznākumu un augstu lipīdu, sāļu, detergentu, seruma olbaltumvielu un citu matricas komponentu pārneses iespējamību. Šīs īpašības var traucēt šķelšanas efektivitāti, hromatogrāfiskās atdalīšanas veiktspēju, elektrosmidzināšanas stabilitāti un peptīdu identificēšanu. Tādēļ EV proteomikas paraugu sagatavošanas darbplūsmai jābūt pietiekami iedarbīgai, lai sagrautu vezikulu struktūras un izšķīdinātu tajās esošās olbaltumvielas, vienlaikus saglabājot saderību ar turpmāko fermentatīvo šķelšanu un LC-MS/MS analīzi.
Šajā kontekstā apstrāde ar ultraskaņu, kas ir saderīga ar mikroplatēm, piedāvā praktisku pieeju reproducējamai, paralēlai paraugu apstrādei. Hielscher mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīču modeļi UIP400MTP (400 W) un UIP550MTP (550 W) ir paredzēti paraugu apstrādei ar ultraskaņu daudziedobju platēs un maza tilpuma traukos, nodrošinot darbplūsmas ar lielāku paraugu apstrādes ražīgumu nekā parastās vienas zondes ultraskaņas apstrādes ierīces. Proteomikas laboratorijām šis formāts ir pievilcīgs, jo tas var mazināt manuālā darba radīto mainīgumu, uzlabot vairāku paraugu paralēlo apstrādi un dabiskāk iekļauties paraugu sagatavošanas darbplūsmās, kurās izmanto plates.

Darbplūsmas piemērs

Nesen publicēta ārpusšūnu vezikulu proteomikas darbplūsma PLA2G12A virzītas Th17 šūnu bioloģijas izpētē sniedz noderīgu, laboratorijā pārbaudītu piemēru tam, kā mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP var iekļaut paraugu sagatavošanā shotgun proteomikai. Šajā pētījumu sērijā EV paraugi proteoma analīzei tika sagatavoti, izmantojot apstrādi ar metanolu, apstrādi ar ultraskaņu ar UIP400MTP, centrifugēšanu, žāvēšanu, šķelšanu ar tripsīnu/Lys-C un nanoplūsmas LC, kas savienota ar augstas izšķirtspējas tandēma MS. Par bioloģisko pētījumu 2026. gadā ziņoja Mochizuki-Ono un kolēģi; tajā proteomikas analīze palīdzēja raksturot, kā PLA2G12A maina EV saturā esošās olbaltumvielas patogēnu T šūnu atbildes reakciju kontekstā.

Daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP

Kāpēc izmantot mikroplašu apstrādi ar ultraskaņu?
UIP400MTP nodrošina standartizētu, paralēlu maza tilpuma paraugu apstrādi ar ultraskaņu. Tas ir noderīgi, ja svarīga ir reproducējamība, neliels sākotnējā parauga daudzums un vairāku paraugu apstrādes ražīgums.


Kvalitātes kontroles kontrolsaraksts

• Pārliecinieties, ka visu paraugu sākotnējais EV daudzums atbilst vienādam olbaltumvielu daudzumam.
• Izmantojiet randomizētas vai līdzsvarotas paraugu izvietojuma shēmas apstrādei.
• Saglabājiet vienādu metanola tilpumu, ultraskaņas apstrādes ilgumu, žāvēšanas ilgumu un šķelšanas tilpumu.
• Uzraugiet peptīdu iznākumu un kopējo identificēto olbaltumvielu skaitu.
• Pārbaudiet nešķelto šķelšanas vietu īpatsvaru un peptīdu garuma sadalījumu.
• Pārbaudiet hromatogrāfisko pīķu formu un aiztures laika reproducējamību.
• Iekļaujiet tukšos paraugus, lai uzraudzītu pārnesi starp paraugiem.
• Lielākos pētījumos izmantojiet apvienotus kvalitātes kontroles (QC) paraugus.
• Novērtējiet atkārtojumu variācijas koeficientu.
• Izmantojiet PCA vai saistītas metodes, lai identificētu partiju efektus vai izlecējparaugus.

Ieteikumi dokumentēšanai

Publicējot vai dokumentējot šo darbplūsmu, norādiet sākotnējo EV daudzumu, plates formātu, metanola tilpumu, UIP400MTP amplitūdu un ultraskaņas apstrādes ilgumu, centrifugēšanas apstākļus, žāvēšanas metodi, šķelšanas buferšķīdumu, enzīma koncentrāciju, šķelšanas ilgumu, paskābināšanas apstākļus, LC-MS/MS platformu, datu iegūšanas režīmu, programmatūras versiju, datubāzi, FDR robežvērtību, normalizācijas metodi un statistiskās analīzes darbplūsmu.
Visi Hielscher mikroplašu sonikatori automātiski reģistrē svarīgus procesa parametrus, piemēram, amplitūdu, apstrādes ar ultraskaņu ilgumu un temperatūru, ar datuma un laika zīmogu CVS failā integrētajā SD kartē. Datu reģistrēšana reproducējamības un kvalitātes kontroles nodrošināšanai vēl nekad nav bijusi tik vienkārša!

Detalizēts pētījuma apraksts: EV shotgun proteomika PLA2G12A pētījumā

PLA2G12A pētījums sniedz konkrētu piemēru UIP400MTP izmantošanai shotgun proteomikas darbplūsmā. Bioloģiskais pētnieciskais jautājums bija par to, kā sekretētā fosfolipāze PLA2G12A modificē Th17 šūnu izcelsmes ārpusšūnu vezikulas un tādējādi ietekmē patogēno T šūnu diferenciāciju. Autori parādīja, ka PLA2G12A iedarbojas uz EV membrānām, veidojot lizofosfolipīdus, tostarp 1-oleoil-lizofosfatidiletanolamīnu, un ka turpmākā lizofosfatīdskābes signālpārnese ar LPA2 starpniecību veicina Th17 diferenciāciju. Papildus lipīdu signālpārnesei pētījumos tika analizēts arī EV saturs, tostarp RNS un olbaltumvielu saturs, tādēļ shotgun proteomika bija svarīga raksturošanas stratēģijas sastāvdaļa.
EV sagatavošanas darbplūsmā Th17 šūnas kultivēja barotnē, kas saturēja liellopu augļu serumu, no kura izdalītas eksosomas. Kultūru supernatantus vispirms centrifugēja, lai atdalītu šūnas, filtrēja caur 0,22 µm filtru, koncentrēja ar ultrafiltrāciju/ultracentrifugēšanu, mazgāja, atkārtoti suspendēja PBS un kvantitatīvi noteica ar BCA olbaltumvielu testu. Šī sākotnējā EV sagatavošana nodrošināja, ka proteomikas darbplūsmā varēja izmantot noteiktu EV materiāla daudzumu olbaltumvielu ekvivalenta izteiksmē.
Shotgun proteomikas analīzei autori izmantoja EV paraugus, kas atbilda 5 µg olbaltumvielu ekvivalenta. Šos paraugus izžāvēja PCR mēģenēs un pievienoja 25 µL metanola. Pēc tam paraugus 3 minūtes apstrādāja ar ultraskaņu, izmantojot mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP. Pēc apstrādes ar ultraskaņu paraugus centrifugēja 4°C temperatūrā 20 minūtes ar 19 000 × g. Pēc 20 µL supernatanta atdalīšanas paraugus centrifugēja līdz sausumam. Pēc tam olbaltumvielas izšķīdināja, apstrādājot ar ultraskaņu 4 µL tripsīna/Lys-C šķīduma ar koncentrāciju 100 ng/µL 50 mM amonija hidrogēnkarbonāta šķīdumā. Šķelšanu veica 2 stundas 37°C temperatūrā, kratot ar 300 rpm. Šķelšanas produktu maisījumu paskābināja ar 1 µL 1,25% trifluoretiķskābes un analizēja, izmantojot nanoplūsmas šķidruma hromatogrāfiju, kas savienota ar augstas izšķirtspējas tandēma masspektrometriju.
Šī darbplūsma izceļ vairākus noderīgus principus EV proteomikai ar nelielu sākotnējā materiāla daudzumu. Pirmkārt, sākotnējā materiāla daudzums tika normalizēts pēc olbaltumvielu ekvivalenta, kas ir svarīgi, salīdzinot EV no dažādiem genotipiem vai pēc dažādām apstrādēm. Otrkārt, pirms apstrādes ar ultraskaņu tika izmantots metanols, kas veicināja sagraušanu un ekstrakciju, vienlaikus izvairoties no detergentu sistēmām, kas var sarežģīt LC-MS/MS. Treškārt, apstrādes ar ultraskaņu posms bija īss un standartizēts, kas ir saderīgi ar paralēlu paraugu apstrādi. Ceturtkārt, šķelšana ar tripsīnu/Lys-C tika veikta ļoti mazā tilpumā, mazinot atšķaidīšanu un veicinot peptīdu atgūšanu no neliela sākotnējā materiāla daudzuma. Visbeidzot, tieša pāreja no šķelšanas uz paskābināšanu un LC-MS/MS līdz minimumam samazināja nevajadzīgas manipulācijas.
Turpmākajā LC-MS/MS metodē izmantoja nanoplūsmas apgrieztās fāzes atdalīšanu, kas savienota ar Q-Exactive HF Orbitrap masspektrometru. Paraugus uztvēra uz C18 priekškolonnas, pēc tam atdalīja analītiskajā kolonnā ar 50 µm iekšējo diametru pie 200 nL/min un 40°C. Gradienta gaitā 60 minūšu laikā no zema organiskā šķīdinātāja satura pārgāja līdz 35% šķīdinātāja B, kam sekoja mazgāšana ar augstu organiskā šķīdinātāja saturu un atkārtota līdzsvarošana. MS datu iegūšanu veica pozitīvo jonu režīmā, izmantojot no datiem neatkarīgu datu iegūšanu ar augstākas enerģijas sadursmju disociāciju. DIA neapstrādāto datu failus analizēja ar DIA-NN 1.8, izmantojot in silico prognozētu spektrālo bibliotēku.