Ultraskaņas izmantošana paraugu sagatavošanā ar filtra palīdzību (FASP): proteomikas darbplūsmu uzlabošana ar pilnveidotu apstrādi ar ultraskaņu

Paraugu sagatavošana ar filtra palīdzību (FASP), izmantojot ultraskaņu, mūsdienu proteomikā kļūst par ļoti efektīvu un reproducējamu metodi. Integrējot kontrolētu apstrādi ar ultraskaņu jau ieviestās FASP darbplūsmās, pētnieki var būtiski uzlabot olbaltumvielu ekstrakciju, šķelšanas efektivitāti un kopējo datu kvalitāti. Pieaugot pieprasījumam pēc reproducējamas paraugu sagatavošanas ar augstu caurlaidspēju, fokusētas ultraskaņas ierīces, piemēram, mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP, iegūst arvien lielāku zinātnisko un praktisko nozīmi.

Zinātniskais konteksts: kāpēc FASP ir svarīga proteomikā

Paraugu sagatavošana ar filtra palīdzību (FASP) ir kļuvusi par zelta standartu augšupējā proteomikā, jo tā ļauj atdalīt detergentus, sāļus un citus piemaisījumus, vienlaikus nodrošinot efektīvu enzimātisko šķelšanu. Tomēr klasiskajiem FASP protokoliem bieži ir ierobežojumi, kas saistīti ar nepilnīgu līzi, nevienmērīgu šķelšanu un paraugu variabilitāti – īpaši, strādājot ar sarežģītām vai izturīgām bioloģiskajām šūnām vai audiem.
Šeit fokusēta ultraskaņas enerģija (apstrāde ar ultraskaņu) sniedz izšķirošu priekšrocību. Radot mehāniskus bīdes spēkus un kavitāciju, apstrāde ar ultraskaņu uzlabo vairākus būtiskus FASP darbplūsmas posmus, neapdraudot olbaltumvielu integritāti.

Apstrādes ar ultraskaņu pozitīvā ietekme FASP procesā, izmantojot ultraskaņu

Apstrāde ar ultraskaņu izraisa kontrolētu akustisko kavitāciju – mikroskopisku burbulīšu veidošanos un sabrukšanu –, kas rada lokālus bīdes spēkus un mikroplūsmas.
Apstrāde ar ultraskaņu uzlabo gan alkilēšanas, gan šķelšanas posmu FASP procesā, izmantojot ultraskaņu, uzlabojot masas pārnesi un paātrinot reakciju kinētiku. Ultraskaņas enerģijas pielietošana rada kavitāciju, kas izraisa lokālas mikroplūsmas un īslaicīgus bīdes spēkus, kuri veicina ātru sajaukšanos un efektīvu reaģentu iekļūšanu olbaltumvielu matricā vai filtra vidē. Alkilēšanas laikā tas nodrošina vienmērīgāku un ātrāku cisteīna atlikumu modificēšanu ar jodacetamīdu. Šķelšanas posmā apstrāde ar ultraskaņu palielina proteolītiskās šķelšanas vietu pieejamību un uzlabo enzīma un substrāta mijiedarbību, tādējādi paātrinot tripsīna darbību un palielinot šķelšanas efektivitāti. Kopumā apstrāde ar ultraskaņu samazina apstrādes laiku, vienlaikus saglabājot vai uzlabojot reakcijas norises pilnīgumu un reproducējamību.

Proteomikas paraugu sagatavošanā FASP ar ultraskaņu nodrošina:

• Efektīvāku šūnu sagraušanu un olbaltumvielu ekstrakciju pat izturīgos audos vai mikroorganismu paraugos
• Uzlabotu olbaltumvielu solubilizāciju
• Uzlabotu enzīmu piekļuvi šķelšanas laikā
• Īsāku apstrādes laiku un lielāku reproducējamību

Atšķirībā no tradicionālajām mehāniskajām vai ķīmiskajām līzes metodēm apstrāde ar ultraskaņu ir ļoti labi kontrolējama un mērogojama, tāpēc tā ir īpaši piemērota standartizētām proteomikas darbplūsmām.

FASP ar ultraskaņu priekšrocības salīdzinājumā ar tradicionālajām pieejām

Apstrādes ar ultraskaņu integrēšana FASP protokolos sniedz izmērāmus ieguvumus, kas tieši ietekmē turpmākās masas spektrometrijas rezultātus.
FASP ar ultraskaņu nodrošina pilnīgāku olbaltumvielu atgūšanu, īpaši no sarežģīti apstrādājamiem paraugiem, piemēram, šķiedrainiem audiem vai bioplēvēm. Vienmērīgais enerģijas sadalījums nodrošina vienādu apstrādi visos atkārtojumos, samazinot variabilitāti – tā ir būtiska prasība kvantitatīvajā proteomikā.
Turklāt apstrāde ar ultraskaņu paātrina šķelšanas kinētiku, uzlabojot enzīma un substrāta mijiedarbību. Tas bieži saīsina šķelšanas laiku un palielina peptīdu iznākumu, vienlaikus saglabājot sekvences pārklājumu.
No darbplūsmas viedokļa ultraskaņas sistēmas samazina manuālas iejaukšanās nepieciešamību un novērš vajadzību pēc agresīvas ķīmiskās apstrādes, saglabājot paraugu integritāti un vienkāršojot protokolu standartizāciju.

Venna diagramma, kas parāda lielāku identificēto olbaltumvielu skaitu, izmantojot FASP ar ultraskaņu, salīdzinājumā ar FASP, ko veic nakts garumā
Attēls un pētījums: ©Carvalho et al., 2020

Protokols: liela paraugu skaita FASP ar ultraskaņu, izmantojot UIP400MTP

Laboratorijām, kas apstrādā lielas paraugu kopas, mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP nodrošina standarta daudzu iedobju plašu (piemēram, 96 iedobju plašu) vienlaicīgu apstrādi ar ultraskaņu, ievērojami palielinot apstrādājamo paraugu skaitu un reproducējamību.
Šajā formātā paraugus (parasti 50–200 µL katrā iedobē) sagatavo tieši mikroplatēs, kas ir saderīgas ar ultrafiltrāciju vai turpmākajiem apstrādes posmiem. Līzes buferšķīdumi ir līdzīgi tiem, ko izmanto standarta FASP protokolos.

UIP400MTP vienmērīgi pievada ultraskaņas enerģiju visām iedobēm. Apstrādi ar ultraskaņu parasti veic ar 60–80% amplitūdu 2–4 minūtes atkarībā no parauga veida. Uzraugiet temperatūru, izmantojot pieslēdzamo temperatūras sensoru. Izmantojiet impulsveida apstrādi ar ultraskaņu un pēc izvēles laboratorijas dzesētāju.

Protokola piemērs:

1. Alkilēšanas posmā paraugus apstrādā ar ultraskaņu, izmantojot mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci (UIP400MTP) ar 40% amplitūdu 7 ciklos (30 s ieslēgta, 15 s izslēgta; kopējais apstrādes ar ultraskaņu laiks: 5 min 45 s).
2. Pēc apstrādes ar ultraskaņu jodacetamīda (IAA) šķīdumu atdala centrifugējot. Pirms šķelšanas ar tripsīnu paraugi ir jāmazgā, lai noņemtu urīnvielas atliekas, jo urīnviela ir spēcīgs haotrops aģents, kas inhibē fermentatīvo aktivitāti. Tāpēc paraugus divreiz mazgā ar 200 μL 25 mM amonija hidrogēnkarbonāta (AmBic) šķīduma.
3. Pēc tam pievieno 100 μL tripsīna šķīduma (fermenta un olbaltumvielu attiecība 1:30), kas sagatavots 12,5 mM amonija hidrogēnkarbonāta šķīdumā. Tad olbaltumvielu šķelšanu veic ar UIP400MTP tādos pašos apstrādes ar ultraskaņu apstākļos (40% amplitūda, 7 cikli, 30 s ieslēgta / 15 s izslēgta; kopējais laiks: 5 min 45 s).
4. Pēc apstrādes ar ultraskaņu paraugus pārnes uz filtrēšanas platēm vai apstrādā, izmantojot uz platēm balstītas FASP sistēmas. Reducēšanas un alkilēšanas posmus veic platē, saglabājot racionalizētu darbplūsmu.
5. Šķelšanu ar tripsīnu veic kontrolētos apstākļos (piemēram, 37°C, 4–16 stundas), ar iespēju izmantot īslaicīgu stimulāciju ar ultraskaņu, lai paātrinātu fermentatīvo aktivitāti un palielinātu peptīdu iznākumu.
6. Peptīdus iegūst centrifugējot, un tie ir gatavi LC-MS/MS analīzei.

Šīs sistēmas galvenā priekšrocība ir tās spēja nodrošināt identiskus apstrādes apstākļus visās iedobēs, līdz minimumam samazinot atšķirības starp paraugu partijām un ļaujot veikt uzticamus kvantitatīvus salīdzinājumus liela mēroga proteomikas pētījumos.

Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Vācijā radīta kvalitāte

Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces ir plaši pazīstamas ar visaugstākajiem kvalitātes un projektēšanas standartiem. Izturība un vienkārša lietošana ļauj mūsu ultraskaņas apstrādes ierīces viegli integrēt rūpnieciskās ražotnēs. Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces viegli tiek galā ar skarbiem apstākļiem un prasīgu darba vidi.

Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums, kas īpašu uzmanību pievērš augstas veiktspējas ultraskaņas apstrādes ierīcēm ar modernākajām tehnoloģijām un lietotājam ērtu darbību. Protams, Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces atbilst CE prasībām un izpilda UL, CSA un RoHs prasības.

Literatūra / Atsauces

FactSheet UIP550MTP Multi-well Plate Sonicator – Non-Contact Sonicator – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• Luís B. Carvalho, José-Luis Capelo-Martínez, Carlos Lodeiro, Jacek R. Wiśniewski, Hugo M. Santos (2020): Ultrasonic-Based Filter Aided Sample Preparation as the General Method to Sample Preparation in Proteomics. Analytical Chemistry 92, 13; 2020. 9164–9171.
• Hugo M. Santos, Luís B. Carvalho, Carlos Lodeiro, Gonçalo Martins, Inês L. Gomes, Wilson D.T. Antunes, Vanessa Correia, Maria M. Almeida-Santos, Helena Rebelo-de-Andrade, António P.A. Matos, J.L. Capelo (2023): How to dissect viral infections and their interplay with the host-proteome by immunoaffinity and mass spectrometry: A tutorial. Microchemical Journal, Volume 186, 2023.
• Walter, J., Monthoux, C., Fortes, C. et al. (2020): The bovine cumulus proteome is influenced by maturation condition and maturational competence of the oocyte. Scientific Reports 10, 9880 (2020).