Ar ultraskaņas filtru veicināta paraugu sagatavošana (FASP): proteomikas darba plūsmu uzlabošana ar uzlabotu sonikāciju

Ultraskaņas filtrēšanas metode (FASP) kļūst par ļoti efektīvu un reproducējamu metodi mūsdienu proteomikā. Integrējot kontrolētu sonikāciju izveidotajās FASP darba plūsmās, pētnieki var ievērojami uzlabot proteīnu ekstrakciju, sagremošanas efektivitāti un kopējo datu kvalitāti. Pieaugot pieprasījumam pēc augstas veiktspējas un reproducējamas paraugu sagatavošanas, zinātniskā un praktiskā nozīme pieaug tādiem mērķtiecīgiem sonikatoriem kā mikrodaļiņu sonikators UIP400MTP.

Zinātniskais konteksts: Kāpēc FASP ir svarīga proteomikā?

Filtrā veicināta paraugu sagatavošana (FASP) ir kļuvusi par zelta standartu augšupejošajā proteomikā, jo tā spēj noņemt mazgāšanas līdzekļus, sāļus un citus piesārņotājus, vienlaikus nodrošinot efektīvu fermentatīvo šķelšanu. Tomēr klasiskie FASP protokoli bieži saskaras ar ierobežojumiem, kas saistīti ar nepilnīgu lizi, nekonsekventu sagremošanu un paraugu mainīgumu. – īpaši, ja runa ir par sarežģītām vai elastīgām bioloģiskām šūnām vai audiem.
Tieši šajā gadījumā fokusēta ultraskaņas enerģija (sonikācija) nodrošina izšķirošas priekšrocības. Ieviešot mehāniskus bīdes spēkus un kavitāciju, sonikācija uzlabo vairākus svarīgus FASP darba procesa posmus, neapdraudot proteīnu integritāti.

Sonikācijas pozitīvā ietekme ultraskaņas FASP procesā

Sonikācija ievieš kontrolētu akustisko kavitāciju – mikroskopisko burbuļu veidošanās un sabrukšana. – kas rada lokālus bīdes spēkus un mikrostrūklu.
Sonikācija uzlabo gan alkilēšanas, gan šķelšanas posmus ultraskaņas FASP procesā, uzlabojot masas pārnesi un paātrinot reakcijas kinētiku. Pielietojot ultraskaņas enerģiju, rodas kavitācija, kas izraisa lokalizētu mikroplūsmu un pārejošus bīdes spēkus, kas veicina ātru sajaukšanos un efektīvu reaģentu iekļūšanu proteīna matricā vai filtra vidē. Alkilēšanas laikā tas nodrošina vienmērīgāku un ātrāku cisteīna atlieku modificēšanu ar jodoacetamīdu. Sašķelšanas posmā sonikācija palielina proteolītiskās šķelšanas vietu pieejamību un uzlabo fermenta un substrāta mijiedarbību, tādējādi paātrinot tripsīna aktivitāti un palielinot šķelšanas efektivitāti. Kopumā apstrāde ar ultraskaņu samazina apstrādes laiku, vienlaikus saglabājot vai uzlabojot reakcijas pilnīgumu un reproducējamību.

Proteomikas paraugu sagatavošanā ultraskaņas FASP nozīmē:

• Efektīvāka šūnu izjaukšana un olbaltumvielu ekstrakcija, pat no cietiem audiem vai mikrobu paraugiem.
• Pastiprināta proteīnu šķīdināšana
• Uzlabota fermentu pieejamība gremošanas laikā
• Samazināts apstrādes laiks un uzlabota reproducējamība

Atšķirībā no parastajām mehāniskās vai ķīmiskās līzes metodēm apstrāde ar ultraskaņu ir viegli kontrolējama un mērogojama, tāpēc tā ir īpaši piemērota standartizētām proteomikas darba plūsmām.

Ultraskaņas FASP priekšrocības salīdzinājumā ar tradicionālajām metodēm

Sonikācijas integrēšana FASP protokolos nodrošina izmērāmus ieguvumus, kas tieši ietekmē pakārtotās masspektrometrijas rezultātus.
Ultraskaņas FASP nodrošina pilnīgāku proteīnu atgūšanu, jo īpaši no sarežģītiem paraugiem, piemēram, šķiedrainiem audiem vai bioplēvēm. Vienmērīgs enerģijas sadalījums nodrošina konsekventu apstrādi visos atkārtojumos, samazinot mainīgumu. – būtiska prasība kvantitatīvai proteomikai.
Turklāt sonikācija paātrina gremošanas kinētiku, uzlabojot fermentu un substrāta mijiedarbību. Tas bieži vien ļauj sašķelšanas laiku saīsināt un iegūt vairāk peptīdu, vienlaikus saglabājot sekvences pārklājumu.
No darba plūsmas viedokļa ultraskaņas sistēmas samazina manuālo iejaukšanos un novērš vajadzību pēc agresīvas ķīmiskās apstrādes, saglabājot parauga integritāti un vienkāršojot protokolu standartizāciju.

Venna diagramma, kurā parādīts ar ultraskaņas FASP identificēto proteīnu skaita pieaugums salīdzinājumā ar nakts FASP.
Attēls un pētījums: ©Carvalho et al., 2020

Protokols: Augstas caurlaidības ultraskaņas FASP ar UIP400MTP

Laboratorijām, kas apstrādā lielus paraugu kopumus, UIP400MTP mikroplatīšu sonikators ļauj vienlaicīgi sonikēt standarta daudznodalījumu plates (piem., 96 iedobju plates), ievērojami palielinot caurlaides spēju un reproducējamību.
Šajā formātā paraugus (parasti 50-200 µl uz iedobi) sagatavo tieši mikroplatēs, kas ir saderīgas ar ultrafiltrāciju vai pakārtotu apstrādi. Lizes buferi ir līdzīgi tiem, ko izmanto standarta FASP protokolos.

UIP400MTP izmanto vienmērīgu ultraskaņas enerģiju visos urbumos. Sonikāciju parasti veic ar 60-80 % amplitūdu 2-4 minūtes atkarībā no parauga veida. Uzraugiet temperatūru, izmantojot pievienojamo temperatūras sensoru. Izmantojot pulsējošu sonikāciju un pēc izvēles ar laboratorijas dzesētāju.

Protokola paraugs:

1. Alkilēšanas posmā paraugus sonikē, izmantojot mikroplates sonikatoru (UIP400MTP) ar 40 % amplitūdu 7 ciklus (30 s ieslēgts, 15 s izslēgts; kopējais sonikācijas laiks: 5 min 45 s).
2. Pēc sonikācijas jodoacetamīda (IAA) šķīdumu noņem ar centrifugēšanu. Pirms tripsīna šķelšanas paraugi jānomazgā, lai atdalītu urīnvielas atlikumus, kas ir spēcīgs haotrops, kurš kavē fermentatīvo aktivitāti. Tāpēc paraugus divas reizes mazgā ar 200 μl 25 mM amonija bikarbonāta (AmBic).
3. Pēc tam pievieno 100 μl tripsīna šķīduma (1:30 fermenta un proteīna attiecība), kas sagatavots 12,5 mM amonija bikarbonātā. Pēc tam ar UIP400MTP tiek veikta olbaltumvielu šķelšana, izmantojot tos pašus sonikācijas nosacījumus (40 % amplitūda, 7 cikli, 30 s ON / 15 s OFF; kopējais laiks: 5 min 45 s).
4. Pēc sonikācijas paraugus pārnes uz filtrplāksnēm vai apstrādā, izmantojot FASP sistēmas uz plākšņu bāzes. Redukcijas un alkilēšanas darbības tiek veiktas uz plates, tādējādi saglabājot racionālu darba plūsmu.
5. Tripsīna šķelšanu veic kontrolētos apstākļos (piemēram, 37 °C, 4-16 stundas) ar iespēju īslaicīgi stimulēt ar ultraskaņu, lai paātrinātu fermentatīvo aktivitāti un uzlabotu peptīdu iznākumu.
6. Peptidus atgūst ar centrifugēšanu, un tie ir gatavi LC-MS/MS analīzei.

Šīs sistēmas galvenā priekšrocība ir tās spēja nodrošināt identiskus apstrādes apstākļus visās iedobēs, līdz minimumam samazinot partijas efektu un nodrošinot stabilus kvantitatīvos salīdzinājumus liela mēroga proteomikas pētījumos.

Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Kvalitāte ražots Vācijā

Hielscher ultrasonikatori ir labi pazīstami ar saviem augstākajiem kvalitātes un dizaina standartiem. Robustums un viegla darbība ļauj vienmērīgi integrēt mūsu ultrasonikatorus rūpnieciskajās iekārtās. Hielscher ultrasonikatori viegli apstrādā neapstrādātus apstākļus un prasīgu vidi.

Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums un īpašu uzsvaru liek uz augstas veiktspējas ultrasonikatoriem, kas piedāvā vismodernākās tehnoloģijas un lietotājdraudzīgumu. Protams, Hielscher ultrasonikatori atbilst CE prasībām un atbilst UL, CSA un RoHs prasībām.

Literatūra / Atsauces