Ar ultraskaņu veicināta proteīnu ekstrakcija no audzēja audiem – protokols

Šajā protokolā aprakstīta ar ultraskaņu veicināta proteīnu ekstrakcijas metode audzēja audiem, kas pilnveido standarta CPTAC urīnvielas līzes darbplūsmu, audu sagraušanas laikā pievienojot kontrolētu apstrādes posmu ar ultraskaņas zondi. Balstoties uz iedibināto CPTAC paraugu sagatavošanas stratēģiju padziļinātai proteoma un fosfoproteoma analīzei, šī modifikācija uzlabo šūnu un subcelulāro struktūru sagraušanu, samazina parauga viskozitāti un veicina tādu proteīnu atbrīvošanos, kurus parasti ir grūtāk iegūt tikai ar urīnvielas līzi, īpaši ar membrānām saistītu proteīnu un proteīnu, kas saistās ar DNS vai ir saistīti ar kodolu. Pamatā esošajā pētījumā ar ultraskaņu papildinātā darbplūsma palielināja gan proteīnu, gan fosfopeptīdu noteikšanu, vienlaikus saglabājot saderību ar turpmāko CPTAC tipa šķelšanas, TMT marķēšanas, frakcionēšanas, fosfopeptīdu bagātināšanas un LC-MS/MS analīzes procesu.

Ar ultraskaņu veicināta proteīnu ekstrakcija no audzēja audiem padziļinātai proteomikas un fosfoproteomikas analīzei

Tālāk sniegtais protokols ir optimizēts proteīnu ekstrakcijai no kriogēni sasmalcinātiem audzēja audiem līzes buferšķīdumā ar 8 M urīnvielu: pievienots apstrādes posms ar ultraskaņas zondi uzlabo grūti ekstrahējamu proteīnu klašu, īpaši ar membrānām un DNS/kodolu saistītu proteīnu, ieguvi pirms šķelšanas un turpmākās LC-MS/MS analīzes. Pamatā esošajā Li et al. (2025) pētījumā apstrādes ar ultraskaņu pievienošana palielināja ar membrānām un kodolu saistītu proteīnu noteikšanu un pētījumā izmantotajā darbplūsmā nodrošināja padziļinātu tvērumu ar >12 000 proteīniem un >25 000 fosfopeptīdiem.

Protokola lietojuma joma

Izmantojiet šo procedūru:

• svaigi sasaldētiem, kriogēni sasmalcinātiem audzēja audiem
• šūnu nogulsnēm vai citiem bioloģiskiem paraugiem, kuriem ekstrakcija ar urīnvielu jau ir iedibināta
• globālās proteomikas un fosfoproteomikas darbplūsmām, kurās izmanto šķelšanu ar tripsīnu un pēc izvēles TMT marķēšanu

Li et al. (2025) pētījumā norādīts, ka darbplūsma ir piemērojama arī citiem paraugu veidiem, piemēram, šūnu līnijām, asinīm un urīnam, tomēr atkarībā no parauga veida var būt nepieciešama optimizācija.

Optimizēta paraugu sagatavošanas darbplūsma ar ieviestu apstrādes posmu ar ultraskaņu. Optimizētā darbplūsma un eksperimenta plāns ir balstīti uz CPTAC paraugu sagatavošanas protokolu globālajai proteomikas un fosfoproteomikas analīzei.
Pētījums un shēma: ©Li et al., 2025

Darbības princips

Sākotnējā pētījumā standarta CPTAC urīnvielas līzes darbplūsmai pievienoja apstrādi ar ultraskaņu un konstatēja uzlabotu ar membrānām un kodoliem saistītu proteīnu noteikšanu. Autori norāda, ka apstrādes ar ultraskaņu parametri ir precīzi jāpielāgo parauga lielumam/koncentrācijai – izvēloties sonotrodes izmēru, ievadītās enerģijas daudzumu un impulsu laika iestatījumus.

Piemēram, Hielscher UP200Ht un UP200St gadījumā tas nozīmē:

• izmantot amplitūdu un impulsu režīmu kā galvenos vadības mainīgos
• visā procesa laikā turēt paraugus aukstumā (t. i., uz ledus)
• sākt ar piesardzīgiem iestatījumiem
• optimizēt, ņemot vērā parauga dzidrumu, temperatūru, proteīnu iznākumu un peptīdu kvalitāti turpmākajos posmos

 
Abi Hielscher 200 vatu ultraskaņas apstrādes ierīču modeļi UP200Ht un UP200St ir paredzēti maziem un vidējiem paraugu tilpumiem, un tiem ir regulējami amplitūdas un impulsu iestatījumi; abi ultraskaņas homogenizatori nodrošina digitālu vadību ar skārienekrānu precīzai parametru regulēšanai, automatizētu datu reģistrēšanu, pievienojamu temperatūras sensoru, tālvadību un parauga apgaismojumu.
 

Reaģenti ar ultraskaņu veicinātai proteīnu ekstrakcijai

Urīnvielas līzes buferšķīdums

Pagatavojiet svaigu tieši pirms lietošanas:

• 8 M urīnviela
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinīns
• 10 µg/mL leipeptīns
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Pirms piedevu pievienošanas urīnvielai jābūt pilnībā izšķīdušai; inhibitori jāpievieno tieši pirms lietošanas; buferšķīdums jātur uz ledus; pēc piedevu pievienošanas ieteicams samaisīt ar apļveida kustībām, nevis intensīvi maisīt vorteksa maisītājā.
 

Papildu reaģenti:

• Reaģenti proteīnu noteikšanai ar BCA metodi
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodacetamīds
• LysC
• Tripsīns
• Skudrskābe
• TMT reaģenti, ja izmanto multipleksētu kvantitatīvo proteomiku
• IMAC reaģenti, ja veic fosfopeptīdu bagātināšanu

Aprīkojums proteīnu ekstrakcijai ar ultraskaņas palīdzību

Nepieciešams

Ieteikumi zondes izvēlei

Aptuveni 200–1000 µL paraugiem izmantojiet maza diametra sonotrodi, kas piemērota nelielu tilpumu tiešai apstrādei ar augstas intensitātes ultraskaņu. Hielscher piedāvā dažāda diametra sonotrodes, un mazāks uzgaļa diametrs nodrošina augstāku intensitāti uzgaļa galā.

Praktisks ieteikums: izmantojiet mazāko zondi, kas nodrošina efektīvu sajaukšanu bez pārmērīgas putošanas vai saskares ar trauka sienu.

Ja vienlaikus strādājat ar vairākiem paraugiem, varat apsvērt iespēju izmantot vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīci VialTweeter vai mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP!

Soli pa solim: proteīnu ekstrakcijas procedūra ar ultraskaņas palīdzību

A. Iepriekšēja atdzesēšana un sagatavošana

1. Atdzesējiet centrifūgu līdz 4°C.
2. Sagatavojiet svaigu urīnvielas līzes buferšķīdumu un turiet to uz ledus.
3. Uzstādiet UP200Ht vai UP200St uz statīva skaņu izolējošā kamerā.
4. Sagatavojiet pietiekami lielu ledus vannu, lai paraugu mēģenes tajā varētu stabili novietot vertikāli.

Ir ļoti svarīgi sagatavot svaigu buferšķīdumu un strādāt zemā temperatūrā.

B. Sākotnējā ekstrakcija ar urīnvielu

1. Turiet kriogēni sasmalcinātos audus uz ledus.
2. Pievienojiet 200 µL atdzesēta urīnvielas līzes buferšķīduma uz katriem 50 mg mitru audu.
3. Maisiet virpuļmaisītājā 5–10 s lielā ātrumā.
4. Inkubējiet 15 min 4°C temperatūrā.
5. Vēl vienu reizi atkārtojiet maisīšanas virpuļmaisītājā un inkubēšanas posmu.
6. Centrifugējiet pie 20 000g 10 min 4°C temperatūrā.
7. Pārnesiet lizātu/supernatantu tīrā mēģenē ar zemu proteīnu saistīšanas spēju.

C. Apstrāde ar ultraskaņu, izmantojot UP200Ht vai UP200St

Apstrādes ar ultraskaņu sākuma nosacījumi

• Amplitūda: sāciet ar 20–30%
• Impulsa ilgums: 5 s IESLĒGTS
• Dzesēšana: 2 min uz ledus starp impulsiem
• Ciklu skaits: 4 cikli
• Kopējais aktīvās apstrādes ar ultraskaņu laiks: 20 s
• Kopējais procesa laiks, ieskaitot dzesēšanu: aptuveni 8–10 min

Apstrādes ar ultraskaņu soļi

1. Pārnesiet lizātu apstrādei ar ultraskaņu piemērotā mēģenē. Izmantojiet šauru mēģeni ar plānām sienām, kas nodrošina labu siltumapmaiņu un drošu zondes iegremdēšanu.
2. Ievietojiet mēģeni ledus vannā. Publikācijā norādīts, ka dzesēšana apstrādes ar ultraskaņu laikā ir ļoti svarīga, lai novērstu karstuma radītus bojājumus.
3. Iegremdējiet zondes uzgali paraugā. Turiet uzgali pietiekami dziļi iegremdētu, lai nodrošinātu stabilu kavitāciju, taču neļaujiet tam pieskarties mēģenes sienai vai dibenam.
4. Veiciet vienu 5 s impulsu ar sākuma amplitūdu.
5. Nekavējoties atkal pilnībā ievietojiet paraugu ledū uz 2 min.
6. Atkārtojiet, līdz pabeigti 4 cikli.
7. Pārbaudiet lizātu pēc cikla.
8. Turpiniet tikai tad, ja nepieciešams, katru reizi veicot vienu papildu 5 s impulsu un pēc tā vienmēr pilnībā atdzesējot paraugu.
9. Pārtrauciet apstrādi, tiklīdz lizāts kļūst viendabīgāks un mazāk staipīgs/viskozs.
   Beigu punkts ir caurspīdīgāks lizāts, kas veido pilienus, nevis nepārtrauktu viskozu plūsmu.
10. Centrifugējiet pie aptuveni 16 000g 15 min 4°C temperatūrā.
11. Pārnesiet dzidrināto supernatantu jaunā mēģenē un izmēriet proteīnu koncentrāciju.

Globālās proteomikas un fosfoproteomikas salīdzinājums starp paraugiem, kas apstrādāti un nav apstrādāti ar ultraskaņu.
a. Identificēto proteīnu skaits (globālā proteomika) visos PDX audzēju audos ar vai bez apstrādes ar ultraskaņu. b. Identificēto fosfopeptīdu skaits (IMAC bagātināšana) visos PDX audzēju audos ar vai bez apstrādes ar ultraskaņu. Tika skaitīti tikai proteīni un fosfopeptīdi, kuru daudzuma attiecība bija lielāka vai vienāda ar 25. procentili. Daudzuma attiecība tika aprēķināta starp viena un tā paša veida paraugiem.
Pētījums un grafiki: ©Li et al., 2025

Turpmākā šķelšana un analīze

Pēc apstrādes ar ultraskaņu un dzidrināšanas turpiniet, kā aprakstīts sākotnējā CPTAC tipa darbplūsmā:

1. Atšķaidiet lizātu attiecībā 1:3 (v/v) ar 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, lai samazinātu urīnvielas koncentrāciju līdz <2 M.
2. Pievienojiet LysC daudzumā 1 mAU uz 50 µg proteīnu un inkubējiet 2 h 25°C temperatūrā.
3. Pievienojiet tripsīnu attiecībā 1:49 enzīms:substrāts (w/w) un šķeliet pa nakti 25°C temperatūrā.
4. Apturiet reakciju ar skudrskābi līdz tās gala koncentrācijai 1%.
5. Pēc nepieciešamības turpiniet ar atsāļošanu, TMT marķēšanu, frakcionēšanu, fosfopeptīdu bagātināšanu un LC-MS/MS.

Fosfopeptīdu diferenciālā ekspresija pēc TMT marķētu paraugu MS analīzes.
a. Bazālais apakštips, izceļot dažus cilvēka fosfopeptīdus (olbaltumvielas secības sākums un beigas), kuru ekspresija ar ultraskaņu apstrādātajos paraugos ir paaugstināta salīdzinājumā ar neapstrādātajiem paraugiem. b. Luminālais apakštips, izceļot dažus cilvēka fosfopeptīdus (protein_sequence sākums un beigas), kuru ekspresija ar ultraskaņu apstrādātajos paraugos ir paaugstināta salīdzinājumā ar neapstrādātajiem paraugiem. c. Bagātinātie KEGG ceļi, kas noteikti, balstoties uz to fosfopeptīdu olbaltumvielām, kuru ekspresija ir paaugstināta ar ultraskaņu apstrādātajos bazālā apakštipa audzējos. d. Bagātinātie KEGG ceļi, kas noteikti, balstoties uz to fosfopeptīdu olbaltumvielām, kuru ekspresija ir paaugstināta ar ultraskaņu apstrādātajos luminālā apakštipa audzējos.
Pētījums un grafiki: ©Li et al., 2025

Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Vācijā radīta kvalitāte

Hielscher ultraskaņas ierīces ir labi pazīstamas ar saviem visaugstākajiem kvalitātes un projektēšanas standartiem. Izturība un vienkārša lietošana ļauj mūsu ultraskaņas ierīces netraucēti integrēt rūpnieciskajās iekārtās. Hielscher ultraskaņas ierīces viegli tiek galā ar skarbiem apstākļiem un prasīgu darba vidi.

Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums, kas īpašu uzmanību pievērš augstas veiktspējas ultraskaņas ierīcēm ar vismodernākajām tehnoloģijām un ērtu lietošanu. Protams, Hielscher ultraskaņas ierīces atbilst CE prasībām un izpilda UL, CSA un RoHs prasības.

Literatūra / Atsauces

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.