Sonikācijas atbalstīta proteīnu ekstrakcija no audzēja audiem – Protokols

Šajā protokolā aprakstīta sonikācijas atbalstīta olbaltumvielu ekstrakcijas metode audzēja audiem, kas uzlabo standarta CPTAC urīnvielas līzes darba procesu, pievienojot kontrolētu zondes sonikācijas soli audu izjaukšanas laikā. Balstoties uz izstrādāto CPTAC proteomu un fosfoproteomu sagatavošanas stratēģiju, šī modifikācija uzlabo šūnu un subcelulāro struktūru izjaukšanu, samazina parauga viskozitāti un uzlabo to proteīnu atbrīvošanu, kurus parasti ir grūtāk atgūt, izmantojot tikai karbamīda līzi, jo īpaši ar membrānām saistītu un DNS saistošu vai ar kodolu saistītu proteīnu atbrīvošanu. Pamatpētījumā ar sonikācijas palīdzību veiktā darba plūsma palielināja gan olbaltumvielu, gan fosfopeptidu noteikšanu, vienlaikus saglabājot saderību ar pakārtoto CPTAC tipa šķelšanu, TMT marķēšanu, frakcionēšanu, fosfopeptidu bagātināšanu un LC-MS/MS analīzes procesu virkni.

Sonikācijas atbalstīta proteīnu ekstrakcija no audzēja audiem dziļas proteomikas un fosfoproteomikas analīzei

The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.

Protokola piemērošanas joma

Šo procedūru izmantojiet, lai:

• svaigi saldēti, kriopulverizēti audzēja audi.
• šūnu granulām vai citiem bioloģiskiem paraugiem, ja jau ir veikta ekstrakcija uz urīnvielas bāzes.
• globālās proteomikas un fosfoproteomikas darba plūsmas, izmantojot triptisko šķelšanu un pēc izvēles TMT marķēšanu.

Li et al. (2025) pētījumā norādīts, ka darba process ir piemērojams arī citiem paraugu veidiem, piemēram, šūnu līnijām, asinīm un urīnam, tomēr var būt nepieciešama optimizācija atkarībā no parauga veida.

Optimizēta paraugu sagatavošanas darba plūsma ar ieviestu sonikācijas soli. Optimizētā darba plūsma un eksperimenta plāns ir balstīts uz CPTAC paraugu sagatavošanas protokolu globālai proteomikas un fosfoproteomikas analīzei.
Pētījums un shēma: ©Li et al., 2025

Darba princips

Sākotnējā pētījumā standarta CPTAC urīnvielas līzes darba plūsmai tika pievienota sonikācija, un tika konstatēts, ka ir uzlabota ar membrānām un kodoliem saistīto olbaltumvielu noteikšana. Autori norāda, ka sonikācijas parametri ir precīzi jāpielāgo attiecībā uz parauga lielumu/koncentrāciju. – izvēloties sonotroda lielumu, ievadītās enerģijas daudzumu un impulsa laiku.

Piemēram, Hielscher UP200Ht un UP200St gadījumā tas nozīmē:

• izmantot amplitūdu un impulsa režīmu kā galvenos vadības mainīgos.
• visu laiku paraugus jāuztur auksti (t. i., uz ledus).
• sākt ar konservatīviem iestatījumiem.
• optimizēt, ņemot vērā parauga tīrību, temperatūru, proteīnu iznākumu un pakārtoto peptīdu kvalitāti.

 
Abi Hielscher 200 vatu sonikatoru modeļi UP200Ht un UP200St ir paredzēti maziem un vidējiem paraugu apjomiem, ar regulējamu amplitūdu un impulsu iestatījumiem; abi ultraskaņas homogenizatori nodrošina digitālo skārienekrāna vadību precīzai parametru regulēšanai, automātisku datu reģistrēšanu, pievienojamu temperatūras sensoru, tālvadības pulti, parauga apgaismojumu.
 

Reaģenti proteīnu ekstrakcijai ar sonikācijas palīdzību

Urīnvielas lizes buferšķīdums

Sagatavojiet svaigu tieši pirms lietošanas:

• 8 M urīnvielas
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/ml aprotinīns
• 10 µg/ml leupeptīna
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Fosfatāzes inhibitoru kokteilis 2, 1:100 (v/v)
• Fosfatāzes inhibitoru kokteilis 3, 1:100 (v/v)

Pirms piedevu pievienošanas urīnvielai jābūt pilnībā izšķīdinātai; inhibitori jāpievieno tieši pirms lietošanas; buferis jāglabā uz ledus; pēc piedevu pievienošanas ieteicams to virpināt, nevis spēcīgi virpināt.
 

Papildu reaģenti:

• Reaģenti BCA proteīnu noteikšanai
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Jodoacetamīds
• LysC
• tripsīns
• Skudrskābe
• TMT reaģenti, ja izmanto daudzkārtēju kvantitatīvo proteomiku.
• IMAC reaģenti, ja tiek veikta fosfopeptidu bagātināšana.

Aprīkojums proteīnu ekstrakcijai ar sonikācijas palīdzību

Nepieciešams

Ieteicamā zondes izvēle

Paraugiem, kuru tilpums ir aptuveni 200-1000 µl, izmantojiet maza diametra sonotrodu, kas piemērots tiešai mazo tilpumu apstrādei ar augstu intensitāti. Hielscher piedāvā vairākus sonotroda diametrus, un mazāki uzgaļu diametri nodrošina lielāku intensitāti uzgaļa galā.

Praktiska piezīme: Izmantojiet mazāko zondi, kas nodrošina efektīvu sajaukšanu bez pārmērīgas putēšanas vai saskares ar trauka sieniņām.

Ja vienlaikus strādājat ar vairākiem paraugiem, varat apsvērt iespēju. daudzcauruļu sonikatora vialtweeteris vai mikroplates sonikatoru UIP400MTP!

Soli pa solim instrukcijas: Procedūra proteīnu ekstrakcijai ar sonikācijas palīdzību

A. Iepriekšēja dzesēšana un sagatavošana

1. Atdzesējiet centrifūgu līdz 4°C.
2. Sagatavojiet svaigu urīnvielas lizes buferšķīdumu un uzglabājiet to uz ledus.
3. Uzstādiet UP200Ht vai UP200St uz statīva skaņu kamerā.
4. Sagatavojiet pietiekami lielu ledus vannu, lai mēģenes ar paraugiem varētu turēt vertikāli un stabili.

Svaiga bufera sagatavošana un aukstā apstrāde ir ļoti svarīga.

B. Sākotnējā urīnvielas ekstrakcija

1. Kriopulverizētos audus uzglabājiet uz ledus.
2. Pievienojiet 200 µl atdzesēta urīnvielas lizes bufera uz 50 mg mitru audu.
3. Virtulis 5-10 s ar lielu ātrumu.
4. Inkubējiet 15 minūtes 4 °C temperatūrā.
5. Vēlreiz atkārtojiet virpuļošanas plus inkubācijas darbību.
6. Centrifugējiet 20 000 g 10 minūtes 4 °C temperatūrā.
7. Pārnesiet lizātu/supernatantu uz tīru zemas saistīšanas pakāpes mēģeni.

C. Sonikācija, izmantojot UP200Ht vai UP200St

Sākuma nosacījumi sonikācijai

• Amplitūda: sākot no 20-30%
• Impulsa garums: 5 s
• Atdzesēšana: 2 min uz ledus starp impulsiem
• Ciklu skaits: 4 cikli
• Kopējais aktīvās sonikācijas laiks: 20 s
• Kopējais procesa laiks, ieskaitot dzesēšanu: apmēram 8-10 min.

Sonikācijas posmi

1. Pārnesiet lizātu uz mēģeni, kas piemērota sonikācijai. Izmantojiet šauru, plānsienu mēģeni, kas nodrošina labu siltuma apmaiņu un drošu zondes iegremdēšanu.
2. Ievietojiet mēģeni ledus vannā. Dokumentā norādīts, ka dzesēšana sonikācijas laikā ir ļoti svarīga, lai novērstu karstuma bojājumus.
3. Iegremdējiet zondes galu paraugā. Uzturiet galu iegremdētu pietiekami, lai nodrošinātu stabilu kavitāciju, bet neļaujiet tam pieskarties mēģenes sieniņai vai dibenam.
4. Palaidiet vienu 5 s impulsu ar sākuma amplitūdu.
5. Paraugu nekavējoties uz 2 minūtēm pilnībā novieto uz ledus.
6. Atkārtojiet, līdz pabeigti 4 cikli.
7. Pēc cikla pārbaudiet lizātu.
8. Turpiniet tikai tad, ja nepieciešams, izmantojot vienu papildu 5 s impulsu, pēc kura vienmēr seko pilnīga atdzesēšana.
9. Pārtrauciet, tiklīdz lizāts kļūst viendabīgāks un mazāk dzīslains/viskozīgs.
   Galapunkts ir caurspīdīgāks lizāts, kas veido pilienus, nevis nepārtrauktu viskozu plūsmu.
10. Centrifugē 15 minūtes 4 °C temperatūrā ar aptuveni 16 000 g.
11. Pārlej noskaidroto supernatantu uz jaunu mēģeni un izmēra olbaltumvielu koncentrāciju.

Globālās proteomikas un fosfoproteomikas salīdzinājums starp sonizētiem un nesonizētiem paraugiem.
a. Identificēto proteīnu skaits (globālā proteomika) visos PDX audzēja audos ar sonikāciju vai bez tās. b. Identificēto fosfopeptidu skaits (IMAC bagātināšana) visos PDX audzēja audos ar sonikāciju vai bez tās. Tika uzskaitīti tikai tie proteīni un fosfopeptidi, kuru daudzuma attiecība ir lielāka vai vienāda ar 25. procentili. Bagātības attiecība tika aprēķināta starp viena veida paraugiem.
Pētījums un grafiki: ©Li et al., 2025.

Pakārtota gremošana un analīze

Pēc sonikācijas un dzidrināšanas rīkojieties, kā aprakstīts sākotnējā CPTAC tipa darba gaitā:

1. Atšķaidiet lizātu 1:3 (v/v) ar 50 mM Tris-HCl pH 8,0, lai reducētu urīnvielu līdz 50 mM. <2 M.
2. Pievienojiet LysC 1 mAU uz 50 µg olbaltumvielu un inkubējiet 2 h 25 °C temperatūrā.
3. Pievienojiet tripsīnu ar attiecību 1:49 ferments:substrāts (w/w) un sagremojiet uz nakti 25 °C temperatūrā.
4. Dzēst ar skudrskābi līdz 1 % galīgajā koncentrācijā.
5. Turpiniet atsāļošanu, TMT marķēšanu, frakcionēšanu, fosfopeptidu bagātināšanu un LC-MS/MS pēc vajadzības.

Fosfopeptidu diferenciāla ekspresija no TMT iezīmētiem MS.
a. Bazālais apakštips, izceļot dažus cilvēka fosfopeptidus (proteīnu sekvences sākums un beigas), kas paaugstināti sonicētajos paraugos salīdzinājumā ar nonsonicētajiem paraugiem. b. Luminālais apakštips, izceļot dažus cilvēka fosfopeptidus (proteīnu sekvences sākums un beigas), kas paaugstināti sonicētajos paraugos salīdzinājumā ar nonsonicētajiem paraugiem. c. Bagātinātie KEGG ceļi, pamatojoties uz olbaltumvielām, kuru fosfopeptidu daudzums ir paaugstināts sonicētajos bazālā apakštipa audzējos. d. Bagātinātie KEGG ceļi, pamatojoties uz olbaltumvielām, kuru fosfopeptidu daudzums ir paaugstināts sonicētajos luminālā apakštipa audzējos.
Pētījums un grafiki: ©Li et al., 2025.

Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Kvalitāte ražots Vācijā

Hielscher ultrasonikatori ir labi pazīstami ar saviem augstākajiem kvalitātes un dizaina standartiem. Robustums un viegla darbība ļauj vienmērīgi integrēt mūsu ultrasonikatorus rūpnieciskajās iekārtās. Hielscher ultrasonikatori viegli apstrādā neapstrādātus apstākļus un prasīgu vidi.

Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums un īpašu uzsvaru liek uz augstas veiktspējas ultrasonikatoriem, kas piedāvā vismodernākās tehnoloģijas un lietotājdraudzīgumu. Protams, Hielscher ultrasonikatori atbilst CE prasībām un atbilst UL, CSA un RoHs prasībām.

Literatūra / Atsauces