Proteomikas darbplūsmas ar augstas caurlaidspējas proteīnu šķelšanu

Proteomika ir būtiska nozare bioloģisko procesu un sistēmu izpratnei, un proteīnu šķelšana ir kritiski svarīgs tās darbplūsmu posms. Tradicionāli proteīnu šķelšanu veic šķīdumā, izmantojot proteolītiskos enzīmus, piemēram, tripsīnu, kas specifiski hidrolizē peptīdsaites pie lizīna un arginīna atlikumiem. Šajā procesā veidojas peptīdi, kas ir labi piemēroti jonizācijai un fragmentācijai masspektrometrijā (MS). Tomēr tradicionālajām šķelšanas metodēm nepieciešamas 12–24 stundas, lai šķelšana noritētu līdz galam, un tas būtiski kavē proteomikas darbplūsmas.
Apstrāde ar ultraskaņu piedāvā iedarbīgu alternatīvu, krasi saīsinot šķelšanas laiku no stundām līdz tikai dažām minūtēm. Apvienojumā ar modernām vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes ierīcēm, piemēram, Hielscher CupHorn, VialTweeter un 96 iedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP, apstrāde ar ultraskaņu nodrošina paātrinātu, augstas caurlaidspējas proteomiku. Šīs tehnoloģijas pilnveido darbplūsmas, samazinot paraugu sagatavošanas laiku un palielinot efektivitāti, nepasliktinot reproducējamību vai datu kvalitāti.

Ultraskaņas enerģijas nozīme proteīnu šķelšanā

Apstrādē ar ultraskaņu izmanto fokusētus ultraskaņas viļņus, lai radītu kavitāciju – lokālus mikroburbulīšus, kas, sabrūkot, rada intensīvus bīdes spēkus. Šī parādība uzlabo masas pārnesi, veicina enzīmu sajaukšanos ar substrātiem un atver proteīnu telpiskās struktūras, padarot šķelšanas vietas pieejamas proteolītiskajiem enzīmiem, piemēram, tripsīnam.
Rezultāts? Ievērojami īsāks šķelšanas laiks, nepasliktinot efektivitāti vai reproducējamību.

Ar ultraskaņu veicināta proteolītiskā šķelšana: metodika un rezultāti

Paātrinātas šķelšanas protokols

Ultraskaņas veicinātā šķelšanā apvieno proteolītiskos enzīmus un ultraskaņas enerģiju, lai paātrinātu darbplūsmas. Piemēram, izmantojot Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), šķelšanas darbplūsma norit šādi:

1. Reducēšana: proteīnu paraugus (0,5 mg/mL, 20 µL) apstrādā ar DTT (2 µL, 110 mM) amonija hidrogēnkarbonāta buferšķīdumā (12,5 mM). Apstrādi ar ultraskaņu veic 5 minūtes ar 50% amplitūdu.
2. Alkilēšana: pēc IAA (2 µL, 400 mM) pievienošanas apstrādi ar ultraskaņu atkārto tādos pašos apstākļos.
3. Šķelšana: paraugus atšķaida un inkubē ar nanodaļiņām, uz kurām imobilizēts tripsīns. Noslēdzošais apstrādes ar ultraskaņu cikls (5 minūtes) pabeidz šķelšanu. Peptīdus atdala, izžāvē un uzglabā MS analīzei.

Šī ultraskaņas metode samazina kopējo sagatavošanas laiku no 12 stundām līdz mazāk nekā 30 minūtēm. Neraugoties uz paātrināto procesu, peptīdu iznākums un kvalitāte saglabājas līdzvērtīga tradicionālajām metodēm, kurās šķelšanu veic visu nakti.

Proteīnu šķelšanas ar ultraskaņu efektivitāte

Salīdzinošajos pētījumos, kuros izmantoja E. coli proteomus:

• Proteīnu identificēšana: Ar ultraskaņu šķeltajos paraugos 5 minūtēs identificēja 777 proteīnus, salīdzinot ar 817 proteīniem 12 stundās. Ar abām metodēm kopīgi identificēto proteīnu īpatsvars pārsniedza 70%.
• Reproducējamība: Atkārtotās analīzēs korelācijas vērtības katras metodes ietvaros pārsniedza 98%, apliecinot uzticamību.
• Selektivitāte: Ar katru metodi noteikti proteīni tika šķelti labāk: šķelšana ar ultraskaņu bija labvēlīgāka 65 proteīniem, savukārt šķelšana visas nakts garumā – 54 proteīniem. Šādas niansētas atšķirības uzsver apstrādes ar ultraskaņu unikālo potenciālu konkrētos lietojumos.

Septiņu pievienoto proteīnu bezmarķējuma kvantitatīvās noteikšanas rezultāti E. coli
paraugā. Tālāk minētie proteīni tika pievienoti divos atšķirīgos līmeņos, kā norādīts kolonnā,
kuras nosaukums ir “Theo Ratio”. Theo Ratio ir teorētiskā attiecība starp abiem līmeņiem, kas izmantoti šajā
eksperimentā. Liellopu seruma albumīns (ALBU), β-laktoglobulīns (LACB), α-S1 kazeīns (CASA1),
α-S2 kazeīns (CASA2), citohroms c (CYC), ovalbumīns (OVAL) un karboanhidrāze 2
(CAH2). Attiecības aprēķināja, izmantojot LFQ proteīnu intensitātes vērtības, kas iegūtas MaxQuant
analīzē. Ar katru metodi iegūto vērtību salīdzināšanai izmantoja Stjūdenta t testu (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Pētījums un grafiks: © Martins et al., 2019)

Uz nanodaļiņām imobilizēts tripsīns

Nanodaļiņu ar imobilizētu tripsīnu (piem., T-FMNPs) apvienošana ar apstrādi ar ultraskaņu vēl vairāk uzlabo proteomikas darbplūsmas. Šīs nanodaļiņas nodrošina lielu virsmas laukumu enzīmu un substrātu mijiedarbībai, palielinot efektivitāti. Apstrādājot sarežģītus proteomus, piemēram, E. coli proteomu, kombinētā metode nodrošina:

• Ātrums: Pilnīga šķelšana 5 minūšu laikā.
• Precizitāte: Ar tradicionālajām metodēm salīdzināma olbaltumvielu kvantitatīvā noteikšana (p > 0,01, n=3).
• Mērogojamība: Pielāgošana daudziedobju platformām, piemēram, UIP400MTP, nodrošina apstrādi ar augstu paraugu caurlaidspēju.

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu detalizētu protokolu ar norādījumiem soli pa solim!
(sal. Martins et al., 2019)

Ātra proteolītiskā šķelšana ar augstu paraugu caurlaidspēju, izmantojot Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces

Labākie ultraskaņas apstrādes ierīču modeļi proteomikai

Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus ultraskaņas apstrādes ierīču modeļus vairāku paraugu vienlaicīgai sagatavošanai, veicinot darbplūsmas ar augstu paraugu caurlaidspēju. Neatkarīgi no tā, vai strādājat ar flakoniem, mēģenēm, daudziedobju platēm (piem., 6, 24 vai 96 iedobju platēm) vai Petri traukiem – mēs piedāvājam ideālas ultraskaņas apstrādes ierīces jūsu eksperimentiem.

UIP400MTP ultraskaņas apstrādes ierīce daudziedobju platēm

Visaugstākajai paraugu caurlaidspējai UIP400MTP nodrošina iespēju apstrādāt 96 iedobju plates ar ultraskaņu. UIP400MTP ir saderīga ar jebkuru standarta mikroplati, tai nav nepieciešami dārgi ražotājam specifiski vienreizlietojamie piederumi, un tā sniedz brīvību izvēlēties jūsu pētījumam vislabāko daudziedobju plati. Vienmērīgi pievadot enerģiju visā platē, tā ļauj ātri veikt līdz pat 200 sarežģītu proteomu reducēšanu, alkilēšanu un šķelšanu tikai 1 stundas laikā. Šāds automatizācijas un efektivitātes līmenis ir izšķiroši svarīgs proteomikai ar augstu paraugu caurlaidspēju un klīniskajiem lietojumiem. Uzziniet vairāk par ultraskaņas apstrādes ierīci daudziedobju platēm!

VialTweeter

VialTweeter ir pielāgota laboratorijām, kurām nepieciešama līdz pat 10 flakonu vai mēģeņu vienlaicīga apstrāde ar ultraskaņu. Tās neinvazīvā pieeja novērš savstarpējas kontaminācijas riskus, vienlaikus nodrošinot reproducējamu olbaltumvielu šķelšanu. Šī ierīce ir ideāli piemērota pētniekiem, kuri strādā ar ierobežotu paraugu tilpumu vai dažādu veidu paraugiem.
Uzziniet vairāk par VialTweeter ultraskaņas apstrādes ierīci vairākām mēģenēm!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn ultraskaņas apstrādes ierīce ir jaudīga ierīce, kas paredzēta vairāku paraugu vienlaicīgai apstrādei noslēgtos traukos. Tā nodrošina vienmērīgu ultraskaņas enerģijas sadalījumu un precīzu temperatūras kontroli. Iespēja vienlaikus apstrādāt līdz pat pieciem paraugiem apvienojumā ar saderību ar reducēšanas, alkilēšanas un šķelšanas darbplūsmām padara CupHorn par uzticamu rīku proteomikā, kuras pamatā ir MS.
Uzziniet vairāk par CupHorn SonoReactor!

Soli pa solim izklāstīts protokols ultraskaņas veicinātai proteolītiskajai šķelšanai, izmantojot uz nanodaļiņām imobilizētu tripsīnu

Šis Martins et al. (2019) protokols ir optimizēts ātrai olbaltumvielu šķelšanai, izmantojot ultraskaņas enerģiju un uz nanodaļiņām imobilizētu tripsīnu (T-FMNPs). Aprakstītie soļi nodrošina efektīvu reducēšanu, alkilēšanu un proteolīzi, kas piemērota masas spektrometrijas (MS) lietojumiem.
Protokola soļi

1. Disulfīdsaišu reducēšana
   • Pievienojiet 2 µL DTT šķīduma (110 mM) 20 µL olbaltumvielu paraugam (0,5 mg/mL) AmBic buferšķīdumā.
   • Ievietojiet parauga mēģeni sonoreaktorā UP200St-CupHorn.
   • Apstrādājiet paraugu ar ultraskaņu 2,5 minūtes pie 50% amplitūdas (200 W, 26 kHz).
   • Ieturiet īsu pauzi, lai paraugs atdzistu, pēc tam apstrādājiet ar ultraskaņu vēl 2,5 minūtes tādos pašos apstākļos.
2. Reducēto cisteīna atlikumu alkilēšana
   • Pievienojiet 2 µL IAA šķīduma (400 mM) reducētajam olbaltumvielu paraugam.
   • Apstrādājiet ar ultraskaņu 2,5 minūtes pie 50% amplitūdas, lai veicinātu alkilēšanu.
   • Ieturiet pauzi atdzesēšanai, pēc tam apstrādājiet ar ultraskaņu vēl 2,5 minūtes.

   Piezīme: līdz minimumam samaziniet alkilētā parauga pakļaušanu gaismas iedarbībai, lai novērstu IAA noārdīšanos.

3. Parauga atšķaidīšana
   • Atšķaidiet alkilēto olbaltumvielu paraugu līdz 100 µL galīgajam tilpumam, izmantojot 25 mM AmBic buferšķīdumu, kas satur 4% acetonitrila (v/v).
   • Rūpīgi samaisiet, saudzīgi pipetējot.
4. Proteolītiskā šķelšana ar uz nanodaļiņām imobilizētu tripsīnu
   • Pievienojiet 20 µL T-FMNP šķīduma (3 mg/mL) atšķaidītajam olbaltumvielu paraugam.
   • Apstrādājiet maisījumu sonoreaktorā ar ultraskaņu 2,5 minūtes pie 50% amplitūdas.
   • Ieturiet pauzi, lai ļautu maisījumam atdzist, pēc tam apstrādājiet ar ultraskaņu vēl 2,5 minūtes tādos pašos apstākļos.
5. Tripsīna nanodaļiņu atdalīšana
   • Izmantojiet magnētu, lai atdalītu T-FMNPs no supernatanta, kas satur šķelšanas rezultātā iegūtos peptīdus.
   • Pārnesiet supernatantu jaunā mikrocentrifūgas mēģenē.
6. Peptīdu sagatavošana MS analīzei
   • Izžāvējiet peptīdus saturošo supernatantu vakuuma centrifūgā.
   • Uzglabājiet izžāvētos peptīdus -20°C temperatūrā līdz turpmākai analīzei ar masspektrometriju.