Proteomikas darbplūsmas ar augstas caurlaidspējas proteīnu gremošanu

Proteomika ir būtisks lauks bioloģisko procesu un sistēmu izpratnei, un olbaltumvielu gremošana ir kritisks solis tās darbplūsmās. Tradicionāli olbaltumvielu sagremošana tiek veikta šķīdumā, izmantojot proteolītiskos fermentus, piemēram, tripsīnu, kas īpaši hidrolizē peptīdu saites lizīna un arginīna atliekās. Šis process rada peptīdus, kas ir labi piemēroti jonizācijai un sadrumstalotībai masspektrometrijas (MS) lietojumos. Tomēr tradicionālajām gremošanas metodēm ir nepieciešamas 12–24 stundas, lai sasniegtu pabeigšanu, radot ievērojamus sastrēgumus proteomikas darbplūsmās.
Ultrasonication piedāvā spēcīgu alternatīvu, dramatiski saīsinot gremošanas laiku no stundām līdz tikai dažām minūtēm. Kombinējot ar uzlabotiem vairāku paraugu ultraskaņas aparātiem, piemēram, Hielscher CupHorn, VialTweeter un 96 urbumu plāksnes sonikatoru UIP400MTP, ultrasonication ļauj paātrināt, augstas caurlaidspējas proteomiku. Šīs tehnoloģijas racionalizē darbplūsmas, samazinot paraugu sagatavošanas laiku un palielinot efektivitāti, neapdraudot reproducējamību vai datu kvalitāti.

Ultraskaņas enerģijas loma olbaltumvielu sagremošanā

Ultrasonication izmanto fokusētus ultraskaņas viļņus, lai radītu kavitāciju - lokalizētus mikroburbuļus, kas sabrūk, lai radītu intensīvus bīdes spēkus. Šī parādība uzlabo masas pārnesi, veicina fermentu sajaukšanos ar substrātiem un atklāj olbaltumvielu struktūras, pakļaujot šķelšanās vietas proteolītiskiem fermentiem, piemēram, tripsīnam.
Rezultāts? Ievērojams gremošanas laika samazinājums, neapdraudot efektivitāti vai reproducējamību.

Ultraskaņas uzlabota proteolītiskā gremošana: metodoloģija un rezultāti

Paātrinātas fermentatīvās hidrolīzes protokols

Ultraskaņas atbalstītā gremošana apvieno proteolītiskos fermentus un ultraskaņas enerģiju, lai paātrinātu darbplūsmas. Piemēram, izmantojot Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz), gremošanas darbplūsma notiek šādi:

1. Samazināšana: olbaltumvielu paraugus (0,5 mg/ml, 20 μL) apstrādā ar DTT (2 μL, 110 mM) amonija bikarbonāta buferšķīdumā (12,5 mM). Ultraskaņas apstrāde tiek pielietota 50% amplitūdā 5 minūtes.
2. Alkilēšana: Pēc IAA (2 μL, 400 mM) pievienošanas ultraskaņas apstrāde tiek atkārtota tādos pašos apstākļos.
3. Gremošana: Paraugi tiek atšķaidīti un inkubēti ar imobilizētām tripsīna nanodaļiņām. Pēdējā ultraskaņas apstrādes kārta (5 minūtes) pabeidz gremošanu. Peptīdus atdala, žāvē un uzglabā MS analīzei.

Šī ultraskaņas metode samazina kopējo sagatavošanas laiku no 12 stundām līdz mazāk nekā 30 minūtēm. Neskatoties uz paātrināto procesu, peptīdu raža un kvalitāte joprojām atbilst tradicionālajām nakts metodēm.

Ultraskaņas proteīnu gremošanas efektivitāte

Salīdzinošos pētījumos, izmantojot E. coli proteomas:

• Olbaltumvielu identifikācija: Ultrasoniski sagremoti paraugi 5 minūšu laikā identificēja 777 proteīnus, salīdzinot ar 817 12 stundu laikā. Koplietojamo olbaltumvielu identifikācija pārsniedza 70%.
• Reproducējamība: Replikātu analīzes uzrādīja korelācijas vērtības virs 98% katrā metodē, pierādot ticamību.
• Selektivitāti: Daži proteīni tika prioritāri sagremoti ar katru metodi, ar ultraskaņas gremošanu veicinot 65 proteīnus un nakts gremošanu 54 proteīnus. Šādas niansētas atšķirības uzsver unikālo ultrasonication potenciālu konkrētiem lietojumiem.

Olbaltumvielu kvantitatīvās noteikšanas rezultāti bez etiķetēm no septiņiem ķīļveida proteīniem E. coli
Parauga. Šādi proteīni tika pievienoti divos dažādos līmeņos, kā norādīts kolonnā
nosaukts par "Theo Ratio". Teo attiecība ir teorētiskā attiecība starp diviem līmeņiem, ko izmanto šajā
eksperiments. liellopu seruma albumīns (ALBU), β-laktoglobulīns (LACB), α-S1 kazeīns (CASA1),
α-S2 kazeīns (CASA2), citohroms c (CYC), ovalbumīns (OVAL) un karboanhidrāze 2
(CAH2). Attiecības tika aprēķinātas, izmantojot LFQ proteīna intensitāti, kas iegūta no MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Pētījums un grafika: © Mārtiņš et al., 2019)

Nanodaļiņu imobilizēts tripsīns

Imobilizētu tripsīna nanodaļiņu (piemēram, T-FMNP) integrācija ar ultrasonication vēl vairāk uzlabo proteomikas darbplūsmas. Šīs nanodaļiņas nodrošina augstu virsmas laukumu fermentu un substrātu mijiedarbībai, palielinot efektivitāti. Piemērojot sarežģītiem proteomiem, piemēram, E. coli, kombinētā metode sasniedz:

• Ātrums: Pilnīga gremošana 5 minūšu laikā.
• Precizitāti: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Mērogojamība: Pielāgošanās vairāku urbumu platformām, piemēram, UIP400MTP, nodrošina augstas caurlaidspējas apstrādi.

Noklikšķiniet šeit, lai iegūtu detalizētu protokolu ar soli pa solim sniegtām instrukcijām!
(sk. Mārtiņš u.c., 2019)

Proteolītiskā gremošana ar lielu ātrumu un lielu caurlaidspēju ar Hielscher sonikatoriem

Labākie Sonicator modeļi proteomikai

Hielscher Ultrasonics piedāvā dažādus sonikatoru modeļus vienlaicīgai vairāku paraugu sagatavošanai, veicinot augstas caurlaidspējas darbplūsmas. Neatkarīgi no tā, vai strādājat ar flakoniem, mēģenēm, vairāku iedobju platēm (piemēram, 6, 24, 96 iedobju platēm) vai Petri trauciņiem – Mēs piedāvājam jums ideālus ultraskaņas aparātus jūsu eksperimentiem.

UIP400MTP vairāku urbumu plāksnes sonikators

Lai nodrošinātu maksimālu caurlaidspēju, UIP400MTP nodrošina spēju apstrādāt 96 urbumu plāksnes ultrasoniski. Saderīgs ar jebkuru standarta mikroplati, UIP400MTP neprasa dārgas patentētas vienreizējās lietošanas preces un dod jums brīvību izvēlēties labāko vairāku urbumu plāksni jūsu pētījumam. Piegādājot vienmērīgu enerģiju visā platē, tas ļauj ātri samazināt, alkilēt un sagremot līdz pat 200 sarežģītiem proteomiem tikai 1 stundas laikā. Šis automatizācijas un efektivitātes līmenis ir izšķirošs augstas caurlaidspējas proteomikai un klīniskajiem lietojumiem. Uzziniet vairāk par vairāku urbumu plāksnes sonikatoru!

VialTweeter

VialTweeter ir pielāgots laboratorijām, kurām nepieciešama vienlaicīga ultraskaņas apstrāde līdz 10 flakoniem vai mēģenēm. Tās neinvazīvā pieeja novērš savstarpējas inficēšanās riskus, vienlaikus nodrošinot reproducējamu olbaltumvielu sagremošanu. Šī ierīce ir ideāli piemērota pētniekiem, kas strādā ar ierobežotu paraugu apjomu vai dažādiem paraugu veidiem.
Uzziniet vairāk par VialTweeter vairāku cauruļu sonikatoru!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn sonikators ir jaudīga ierīce, kas paredzēta vairāku paraugu vienlaicīgai apstrādei noslēgtos traukos. Tas nodrošina vienmērīgu ultraskaņas enerģijas sadalījumu un precīzu temperatūras kontroli. Spēja vienlaikus apstrādāt līdz pieciem paraugiem kopā ar saderību ar samazinātām, alkilētām un sagremotām darbplūsmām padara CupHorn par uzticamu rīku uz MS balstītai proteomikai.
Uzziniet vairāk par CupHorn SonoReactor!

Soli pa solim protokols ultrasonikācijas atbalstītai proteolītiskai gremošanai, izmantojot nanodaļiņu imobilizētu tripsīnu

(2019) protokols ir optimizēts ātrai olbaltumvielu gremošanai, izmantojot ultraskaņas enerģiju un nanodaļiņu imobilizētu tripsīnu (T-FMNP). Izklāstītie soļi nodrošina efektīvu samazināšanu, alkilēšanu un proteolīzi, kas piemērota masspektrometrijas (MS) lietojumiem.
Protokola soļi

1. Disulfīdu saišu samazināšana
   • Pievieno 2 μl DTT šķīduma (110 mM) 20 μL proteīna paraugam (0,5 mg/ml) AmBic buferšķīdumā.
   • Paraugu ņemšanas mēģeni ievieto sonoreaktorā UP200St-CupHorn.
   • Paraugu apstrādājiet ar ultraskaņu 2,5 minūtes ar 50% amplitūdu (200 W, 26 kHz).
   • Pauzējiet uz īsu intervālu, lai ļautu dzesēt, pēc tam vēl 2,5 minūtes apstrādājiet ar ultraskaņu tādos pašos apstākļos.
2. Reducēto cisteīna atlieku alkilēšana
   • Samazinātajam proteīna paraugam pievieno 2 μl IAA šķīduma (400 mM).
   • Sonicate 2,5 minūtes ar 50% amplitūdu, lai atvieglotu alkilēšanu.
   • Pauzējiet dzesēšanai, pēc tam apstrādājiet ar ultraskaņu vēl 2,5 minūtes.

   Piezīme: Samaziniet alkilētā parauga pakļaušanu gaismai, lai novērstu IAA noārdīšanos.

3. Parauga atšķaidīšana
   • Alkilētās olbaltumvielas paraugu atšķaida līdz galīgajam tilpumam 100 μL, izmantojot 25 mM AmBic buferšķīdumu, kas satur 4% acetonitrila (tilp./tilp.).
   • Rūpīgi samaisa, viegli pipetējot.
4. Proteolītiskā gremošana ar nanodaļiņu imobilizētu tripsīnu
   • Atšķaidītā proteīna paraugam pievieno 20 μl T-FMNP šķīduma (3 mg/ml).
   • Sonicate maisījumu sonoreaktorā 2,5 minūtes ar 50% amplitūdu.
   • Pauzējiet dzesēšanai, pēc tam vēl 2,5 minūtes apstrādājiet ar ultraskaņu tādos pašos apstākļos.
5. Tripsīna nanodaļiņu atdalīšana
   • Izmantojiet magnētu, lai atdalītu T-FMNP no centrifugāta, kas satur sagremotus peptīdus.
   • Centrifugātu pārnes uz jaunu mikrocentrifūgas mēģeni.
6. Peptīdu sagatavošana MS analīzei
   • Centrifugātu, kas satur peptīdus, žāvē vakuuma centrifūgā.
   • Žāvētos peptīdus uzglabā -20°C temperatūrā līdz turpmākai analīzei ar masspektrometriju.