Hromatīna griešana ar sonikāciju
Hromatīna cirpšana ir kritisks solis daudzās epigenētikas un molekulārās bioloģijas darba plūsmās, jo īpaši hromatīna imūnprecipitācijas (ChIP), ChIP-seq un saistītās analīzēs. Mērķis ir fragmentēt hromatīnu reproducējamos DNS-proteīna kompleksos, vienlaikus saglabājot epitopa integritāti un samazinot parauga zudumus. No pieejamajām metodēm ultraskaņas hromatīna fragmentācija ir kļuvusi par plaši izmantotu metodi, jo tā nodrošina uzticamu fragmentāciju bez reaģentu izmantošanas un lielisku reproducējamību.
Kas jāņem vērā, griežot hromatīnu?
Efektīvai hromatīna griešanai nepieciešama rūpīga eksperimenta parametru kontrole. Nepareiza fragmentācija var apdraudēt pakārtotos ChIP eksperimentus, jo var radīt pārāk lielus, pārāk sadalītus vai nekonsekventus fragmentus dažādos paraugos.
Viens no svarīgākajiem faktoriem ir vēlamais fragmentu izmēru sadalījums. Lielākajai daļai ChIP un ChIP-seq lietojumu optimāli ir hromatīna fragmenti no 100 līdz 600 bāzes pāru. Šis izmēru diapazons nodrošina efektīvu imunoprecipitāciju, vienlaikus nodrošinot pietiekamu izšķirtspēju genoma kartēšanai.
Vēl viens svarīgs faktors ir šķērssaišu veidošanas efektivitāte pirms sonikācijas. Lielākā daļa ChIP darba procesu ietver formaldehīda fiksāciju, lai stabilizētu olbaltumvielu un DNS mijiedarbību. Tomēr pārmērīga šķērssaišu veidošana var padarīt hromatīnu izturīgāku pret fragmentāciju, kas prasa ilgāku sonikācijas laiku un, iespējams, palielina siltuma iedarbību.
Ļoti svarīga ir arī temperatūras kontrole. Sonikācija rada lokalizētu enerģiju, kas var paaugstināt parauga temperatūru. Paaugstināta temperatūra var bojāt DNS vai denaturēt olbaltumvielas, ietekmējot antivielu atpazīšanu ChIP laikā. Tāpēc daudzi pētnieki veic impulsu sonikācijas ciklus kopā ar dzesēšanas intervāliem, lai saglabātu parauga stabilitāti.
Fragmentācijas efektivitāti ietekmē arī parauga koncentrācija un tilpums. Ļoti koncentrētām hromatīna suspensijām var būt nepieciešams ilgāks sonikācijas laiks, savukārt nelielam parauga apjomam nepieciešama precīza enerģijas padeve, lai novērstu pārmērīgu apstrādi.
Visbeidzot, sonikācijas ierīces izvēle būtiski ietekmē eksperimentu reproducējamību. Ierīces, kas paredzētas hromatīna griešanai, parasti nodrošina kontrolētu ultraskaņas enerģiju un standartizētu parauga apstrādi, kas ļauj veikt konsekventu fragmentāciju vairākos paraugos.
Ultraskaņas DNS nobīde ChIP laikā – hromatīna imūnprecipitācija
Kuru sonikatoru izvēlēties hromatīna griešanai?
Dažādām laboratorijas darba plūsmām ir nepieciešamas dažādas sonikācijas konfigurācijas. Optimālā sistēma lielā mērā ir atkarīga no parauga caurlaidspējas, tilpuma un eksperimenta formāta.
Zondes tipa sonikators
Zondes tipa sonikatorā ultraskaņas enerģija caur titāna zondi tiek raidīta tieši paraugā. Šī konfigurācija nodrošina ļoti augstu enerģijas blīvumu, tāpēc ir piemērota spēcīgai hromatīna izjaukšanai atsevišķos paraugos.
Zondes sonikatori ir īpaši noderīgi:
- Mazo un vidējo paraugu skaits
- Grūti sadrumstalojams hromatīns
- Elastīgi eksperimentu protokoli
Daudzcauruļu sonikators - VialTweeter
VialTweeter daudzu mēģenīšu sonikators nodrošina ļoti reproducējamu risinājumu laboratorijām, kas vienlaikus apstrādā vairākus paraugus. Sistēma netieši pārraida ultraskaņas enerģiju caur flakona turētāju, ļaujot fragmentēt vairākas noslēgtas mēģenes vienādos apstākļos.
Šādai konfigurācijai ir svarīgas priekšrocības:
- Vairāku paraugu paralēla hromatīna griešana
- Zondes piesārņojuma novēršana
- Augsta reproducējamība starp mēģenēm
- Vienkāršota darba plūsma ChIP paraugu sagatavošanai
Šādas vairāku mēģenīšu sistēmas ir labi piemērotas regulārajiem ChIP eksperimentiem un vidējas caurlaidības pētījumiem.
Mikrodaļiņu sonikators - UIP400MTP
Augstas veiktspējas epiģenētikas pētījumos aizvien vairāk tiek izmantota mikroplākšņu paraugu apstrāde. Mikrodaļiņu sonikators UIP400MTP ir paredzēts hromatīna fragmentēšanai tieši standarta mikroplatēs, nepārvietojot paraugus.
Šī pieeja ļauj:
- Vienlaicīga vairāku desmitu vai simtu paraugu apstrāde
- Automatizācijai draudzīgas darba plūsmas
- Vienmērīgs ultraskaņas enerģijas sadalījums pa urbumiem
- Ievērojami samazināts paraugu apstrādes posmu skaits
Lielu ChIP-seq skrīninga projektu vai augstas veiktspējas epigenētisko pētījumu veikšanai mikroplatīšu sonikācija nodrošina izcilu mērogojamību un efektivitāti. Sonikators UIP400MTP ar vairākām iedobēm ir labi piemērots šādiem mērķiem integrācija šķidrumu apstrādes sistēmās un automatizētās laboratorijas darba plūsmās.
Kāpēc izvēlēties sonikāciju, nevis citas hromatīna griešanas metodes?
Salīdzinot ar fermentu metodēm, sonikācija ChIP nodrošina objektīvu fragmentāciju, jo process nav atkarīgs no sekvences specifiskas fermentu aktivitātes. Tas ir īpaši svarīgi genoma mēroga epigenētiskajos pētījumos, kur būtisks ir vienmērīgs pārklājums.
Vēl viena būtiska priekšrocība ir mērogojamība. Ultraskaņas sistēmas var apstrādāt atsevišķus paraugus, vairākas mēģenes vai veselas mikroplates, ļaujot laboratorijām izvēlēties piemērotāko konfigurāciju savai eksperimentālajai jaudai.
Visbeidzot, sonikācija nodrošina lielisku fragmentācijas parametru kontroli. Pielāgojot impulsu ciklus, ilgumu un jaudas līmeni, pētnieki var droši panākt vēlamo fragmentu izmēru sadalījumu.
Hromatīna fragmentācija, optimizējot ChIP paraugu sonikāciju.
(a) nav nobīdes (gēlā ir gari fragmenti);
(b) optimālais fragmentācijas profils (200-600 bp fragmentu bagātināšana);
(c) pārmērīga DNS fragmentācija (fragmentu, kas īsāki par 200 bp, pārsvars).
© Jarillo et al., 2018
Hromatīna griešanas metožu salīdzinājums
| Hromatīna griešanas metode | Princips | Priekšrocības | Ierobežojumi |
| Ultraskaņas apstrāde | Augstas frekvences akustiskā enerģija mehāniski sadala hromatīnu. | Fragmentācija bez reaģentu izmantošanas, augsti reproducējami rezultāti, pielāgojams fragmentu izmēru sadalījums, saderīgs ar šķērssaistītu hromatīnu, mērogojams no vienas mēģenes līdz vairāku paraugu un mikroplatīšu formātiem. | Nepieciešams sonikācijas aprīkojums un sonikācijas parametru optimizācija. |
| Fermentatīvā gremošana (MNāze) | Mikrokodolu nukleāze sagrauž DNS starp nukleosomām. | Maiga fragmentācija un noderīga dabiskā hromatīna analīzei. | Enzīmu novirze, sekvences izvēle, grūti kontrolējama sagremošana, iespējamā mainība starp eksperimentiem. |
| Mehāniskā griešana (ar adatu/šļirci) | Hromatīns tiek izjaukts ar atkārtotu fizisku spēku. | Vienkārša metode, kurai nepieciešams minimāls aprīkojums. | Slikta reproducējamība, ierobežota fragmentu lieluma kontrole, darbietilpīga vairāku paraugu iegūšana. |
| Nebulizācija | Saspiests gaiss izspiež DNS caur mazām atverēm, izraisot fragmentāciju. | Ātrs fragmentācijas process. | Iespējami paraugu zudumi, ierobežota mērogojamība, nepieciešams specializēts aprīkojums. |
Kā kvantitatīvi un kvalitatīvi noteikt hromatīna iznākumu pēc ultraskaņas fragmentācijas?
Pēc sonikācijas ChIP pētniekiem jānovērtē gan fragmentētā hromatīna daudzums, gan kvalitāte. Šis pārbaudes posms nodrošina, ka hromatīna fragmentācija atbilst pakārtoto lietojumu, piemēram, ChIP-qPCR vai ChIP-seq, prasībām.
Kvantitatīvā noteikšana parasti sākas ar DNS koncentrācijas mērīšanu. Spektrofotometriskās metodes, piemēram, Nanodropa analīze, vai fluorometriskie testi, piemēram, Qubit DNS kvantifikācija, nodrošina ticamu hromatīna iznākuma aprēķinu pēc dekrosasaistīšanas un attīrīšanas.
Tomēr DNS koncentrācija vien neatklāj, vai fragmentācija ir bijusi veiksmīga. Tāpēc pētnieki novērtē fragmentu izmēru sadalījumu, izmantojot elektroforētiskās metodes. Agarozes gēla elektroforēze joprojām ir plaši izmantota metode, lai vizualizētu DNS fragmentus un pārbaudītu, vai lielākā daļa no tiem ietilpst mērķa izmēru diapazonā.
Progresīvākās laboratorijās bieži izmanto kapilārās elektroforēzes sistēmas, piemēram, Agilent Bioanalyzer vai TapeStation. Šīs platformas nodrošina precīzus izmēru sadalījuma profilus un ļauj pētniekiem noteikt pārmērīgu sadrumstalotību vai nepilnīgu šķelšanu.
Novērtējot hromatīna kvalitāti pēc ultraskaņas fragmentācijas, pētnieki parasti apstiprina:
- Lielākā daļa DNS fragmentu ietilpst 100-600 bp diapazonā.
- Fragmentu sadalījums ir konsekvents visos atkārtotajos paraugos
- DNS degradācija ir minimāla
- Kopējais hromatīna daudzums ir pietiekams plānotajam ChIP testam.
Pareiza kvalitātes kontrole nodrošina, ka ultraskaņas hromatīna griešanas posmā tiek iegūti reproducējami un bioloģiski nozīmīgi rezultāti.
Secinājums: Ultraskaņas hromatīna griešana uzticamiem pētījumiem
Uzticama hromatīna griešana ir būtiska veiksmīgai ChIP un epiģenētikas pētniecībai. Ultraskaņas fragmentācija ir efektīvs risinājums, jo tā nodrošina precīzu, reproducējamu un bez reaģentu izmantošanas veicināmu hromatīna sagraušanu dažādos eksperimentālos formātos.
Rūpīgi optimizējot sonikācijas parametrus, pārbaudot fragmentu izmēru sadalījumu un izvēloties piemērotu sonikācijas sistēmu. – neatkarīgi no tā, vai tas ir zondes tipa sonikators, daudzcauruļu VialTweeter vai augstas veiktspējas mikrotīkla sonikators UIP400MTP. – pētnieki var panākt konsekventu hromatīna fragmentāciju, kas nodrošina augstas kvalitātes ChIP un ChIP-seq rezultātus.
Tā kā epiģenētikas pētījumi turpina paplašināties, palielinot jaudu un uzlabojot eksperimentu reproducējamību, ultraskaņas hromatīna griešana joprojām ir viena no visdaudzpusīgākajām un uzticamākajām metodēm, kas pieejamas mūsdienu molekulārās bioloģijas laboratorijās.
Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Kvalitāte ražots Vācijā
Hielscher ultrasonikatori ir labi pazīstami ar saviem augstākajiem kvalitātes un dizaina standartiem. Robustums un viegla darbība ļauj vienmērīgi integrēt mūsu ultrasonikatorus rūpnieciskajās iekārtās. Hielscher ultrasonikatori viegli apstrādā neapstrādātus apstākļus un prasīgu vidi.
Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums un īpašu uzsvaru liek uz augstas veiktspējas ultrasonikatoriem, kas piedāvā vismodernākās tehnoloģijas un lietotājdraudzīgumu. Protams, Hielscher ultrasonikatori atbilst CE prasībām un atbilst UL, CSA un RoHs prasībām.
Tube rack sonified in the UIP400MTP for chromatin shearing
Literatūra / Atsauces
- Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
- Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
- Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
- José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
- Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)
Biežāk uzdotie jautājumi
Kas ir hromatīns?
Hromatīns ir DNS un ar to saistīto olbaltumvielu strukturālais komplekss, kas organizē ģenētisko materiālu eikariotisko šūnu kodolā. Galvenās hromatīna olbaltumvielas ir histoni, ap kuriem DNS ir aptīta, veidojot nukleosomas. Šī organizācija sablīvē DNS, vienlaikus regulējot piekļuvi ģenētiskajai informācijai tādos procesos kā transkripcija, replikācija un DNS remonts.
Kādi ir hromatīna veidi?
Hromatīnu parasti iedala divās galvenajās formās: eihromatīnā un heterohromatīnā. Eihromatīns ir brīvi sakārtots un transkripcijas ziņā aktīvs, ļaujot transkripcijas mehānismam viegli piekļūt gēniem. Heterohromatīns ir blīvāk iepakots un transkripcijas ziņā neaktīvs, parasti satur atkārtojošās DNS sekvences vai gēnus, kas ir apklusināti. Heterohromatīnu var iedalīt konstitutīvajā heterohromatīnā, kas paliek pastāvīgi kondensēts, un fakultatīvajā heterohromatīnā, kas atkarībā no šūnu apstākļiem var pārslēgties starp aktīvu un neaktīvu stāvokli.
Kas ir šķērssaišu savienošana?
Šķērssaite ir bioķīmisks process, ko izmanto, lai stabilizētu biomolekulu mijiedarbību, veidojot kovalentas saites starp tām. Hromatīna pētniecībā šķērssaišu veidošanu parasti izmanto, lai saglabātu olbaltumvielu un DNS mijiedarbību hromatīnā pirms analīzes. Lai izveidotu atgriezeniskas kovalentas saites starp DNS un saistītajiem proteīniem, parasti izmanto ķīmiskos aģentus, piemēram, formaldehīdu, kas efektīvi veido atgriezeniskas kovalentas saites starp DNS un saistītajiem proteīniem. “Sasalšanas” molekulāro mijiedarbību konkrētā laika brīdī. Šī stabilizācija ļauj hromatīna kompleksus fragmentēt un apstrādāt, nezaudējot dabiskās asociācijas starp DNS un regulatīvajiem proteīniem, kas ir būtiski tādām metodēm kā hromatīna imunoprecipitācija (ChIP).
Kas ir ChIP?
Hromatīna imunoprecipitācija (ChIP) ir molekulārās bioloģijas metode, ko izmanto, lai pētītu proteīnu un DNS mijiedarbību hromatīnā. Izmantojot šo metodi, vispirms stabilizē DNS un olbaltumvielu kompleksus, parasti ar šķērssaišu veidošanu, un pēc tam fragmentē hromatīnu. Lai imunoprecipitētu olbaltumvielu-DNS kompleksus, tiek izmantotas antivielas, kas specifiskas mērķa olbaltumvielai, tādējādi ļaujot izolēt un analizēt saistītās DNS sekvences.
Kādam nolūkam izmanto ChIP?
ChIP izmanto, lai identificētu genoma reģionus, kas saistīti ar konkrētiem ar DNS saistītiem proteīniem, piemēram, transkripcijas faktoriem, histonu modifikācijām vai ar hromatīnu saistītiem regulējošiem proteīniem. Šo metodi plaši izmanto gēnu regulācijas, epigenētisko modifikāciju, transkripcijas faktoru saistīšanas vietu un hromatīna struktūras izpētei. Apvienojumā ar pakārtotām analītiskām metodēm, piemēram, kvantitatīvo PCR (ChIP-qPCR) vai augstas izšķirtspējas sekvenēšanu (ChIP-seq), tā ļauj kartēt proteīnu-DNS mijiedarbību genoma mērogā.
Kādi ir ChIP veidi?
Pastāv vairāki hromatīna imunoprecipitācijas varianti atkarībā no eksperimenta plāna un pakārtotās analīzes. Visizplatītākās pieejas ir ChIP-qPCR, kas kvantitatīvi nosaka konkrētu genoma reģionu bagātināšanos; ChIP-seq, kas izmanto nākamās paaudzes sekvenēšanu, lai kartētu proteīnu-DNS mijiedarbību genomā; un ChIP-chip, kas apvieno ChIP ar DNS mikroshēmu analīzi. Atkarībā no pētāmā bioloģiskā jautājuma plaši izmanto arī tādus papildu variantus kā dabiskais ChIP (N-ChIP), ar kuru analizē nesasaistītu hromatīnu, un šķērssaistītais ChIP (X-ChIP), kurā izmanto ķīmisko šķērssaisti, lai stabilizētu olbaltumvielu un DNS mijiedarbību.
Augstas veiktspējas hromatīna griešana ar mikroplatīšu sonikatoru UIP400MTP
Hielscher Ultrasonics ražo augstas veiktspējas ultraskaņas homogenizatorus no Lab līdz rūpnieciskais izmērs.