Hromatīna fragmentēšana ar ultraskaņu

Hromatīna fragmentēšana ir būtisks posms daudzās epiģenētikas un molekulārās bioloģijas darbplūsmās, jo īpaši hromatīna imūnprecipitācijā (ChIP), ChIP-seq un saistītajās analīzēs. Mērķis ir fragmentēt hromatīnu, iegūstot reproducējamus DNS un olbaltumvielu kompleksus, vienlaikus saglabājot epitopu integritāti un līdz minimumam samazinot parauga zudumus. Starp pieejamajām metodēm hromatīna fragmentēšana ar ultraskaņu ir kļuvusi par plaši izmantotu pieeju, jo tā nodrošina uzticamu fragmentēšanu bez reaģentiem ar izcilu reproducējamību.

Kas jāņem vērā, fragmentējot hromatīnu?

Efektīvai hromatīna fragmentēšanai nepieciešama rūpīga eksperimentālo parametru kontrole. Nepareiza fragmentēšana var apdraudēt turpmākos ChIP eksperimentus, radot fragmentus, kas ir pārāk lieli, pārmērīgi degradēti vai atšķirīgi dažādos paraugos.
Viens no svarīgākajiem faktoriem ir vēlamais fragmentu izmēru sadalījums. Lielākajai daļai ChIP un ChIP-seq lietojumu optimāli ir hromatīna fragmenti ar garumu no 100 līdz 600 bāzu pāriem. Šis izmēru diapazons nodrošina efektīvu imūnprecipitāciju, vienlaikus sniedzot pietiekamu izšķirtspēju genoma kartēšanai.

Vēl viens būtisks faktors ir šķērssaišu veidošanās efektivitāte pirms apstrādes ar ultraskaņu. Lielākā daļa ChIP darbplūsmu ietver fiksāciju ar formaldehīdu, lai stabilizētu olbaltumvielu un DNS mijiedarbību. Tomēr pārmērīga šķērssaišu veidošanās var padarīt hromatīnu izturīgāku pret fragmentēšanu, tādēļ nepieciešams ilgāks apstrādes laiks ar ultraskaņu un iespējama pastiprināta siltuma iedarbība.
Arī temperatūras kontrole ir izšķiroši svarīga. Apstrāde ar ultraskaņu rada lokālu enerģiju, kas var paaugstināt parauga temperatūru. Paaugstināta temperatūra var bojāt DNS vai denaturēt olbaltumvielas, ietekmējot to atpazīšanu ar antivielām ChIP laikā. Tādēļ daudzi pētnieki izmanto impulsveida apstrādes ar ultraskaņu ciklus kopā ar dzesēšanas intervāliem, lai saglabātu parauga stabilitāti.
Arī parauga koncentrācija un tilpums ietekmē fragmentēšanas efektivitāti. Ļoti koncentrētām hromatīna suspensijām var būt nepieciešams ilgāks apstrādes laiks ar ultraskaņu, savukārt nelieliem paraugu tilpumiem nepieciešama precīza enerģijas pievadīšana, lai novērstu pārmērīgu apstrādi.
Visbeidzot, ultraskaņas apstrādes ierīces izvēle būtiski ietekmē eksperimentu reproducējamību. Hromatīna fragmentēšanai paredzētās ierīces parasti nodrošina kontrolētu ultraskaņas enerģijas pievadīšanu un standartizētu paraugu apstrādi, ļaujot panākt vienmērīgu fragmentēšanu vairākos paraugos.

Kādu ultraskaņas apstrādes ierīci izvēlēties hromatīna fragmentēšanai?

Dažādām laboratorijas darbplūsmām nepieciešamas atšķirīgas ultraskaņas apstrādes konfigurācijas. Optimālā sistēma lielā mērā ir atkarīga no apstrādājamo paraugu skaita laika vienībā, tilpuma un eksperimenta formāta.

Zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīce

Zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīce pievada ultraskaņas enerģiju tieši paraugam caur titāna zondi. Šī konfigurācija nodrošina ļoti augstu enerģijas blīvumu un tādēļ ir piemērota intensīvai hromatīna sagraušanai atsevišķos paraugos.

Zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīces ir īpaši noderīgas:

• Nelielam līdz vidējam paraugu skaitam
• Grūti fragmentējamam hromatīnam
• Elastīgiem eksperimentālajiem protokoliem

Vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīce – VialTweeter

Laboratorijām, kurās vienlaikus apstrādā vairākus paraugus, VialTweeter vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīce piedāvā risinājumu ar augstu reproducējamību. Sistēma pārvada ultraskaņas enerģiju netieši caur flakonu turētāju, ļaujot veikt fragmentēšanu vairākās noslēgtās mēģenēs identiskos apstākļos.

Šī konfigurācija sniedz būtiskas priekšrocības:

• Paralēla hromatīna fragmentēšana vairākos paraugos
• Zondes piesārņojuma novēršana
• Augsta rezultātu reproducējamība starp mēģenēm
• Vienkāršota darbplūsma ChIP paraugu sagatavošanai

Šādas vairāku mēģeņu sistēmas ir labi piemērotas rutīnas ChIP eksperimentiem un pētījumiem ar vidēju apstrādājamo paraugu skaitu laika vienībā.
 

Mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce – UIP400MTP

Epiģenētikas pētījumos ar lielu apstrādājamo paraugu skaitu laika vienībā arvien vairāk izmanto paraugu apstrādi mikroplatēs. UIP400MTP mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce ir paredzēta hromatīna fragmentēšanai tieši standarta mikroplatēs bez paraugu pārnešanas.

Šī pieeja nodrošina:

• Desmitiem vai simtiem paraugu vienlaicīgu apstrādi
• Automatizācijai piemērotas darbplūsmas
• Vienmērīgs ultraskaņas enerģijas sadalījums starp iedobēm
• Būtisks paraugu apstrādes darbību skaita samazinājums

Lielos ChIP-seq skrīninga projektos vai augstas caurlaidspējas epiģenētiskajos pētījumos apstrāde ar ultraskaņu mikroplatēs nodrošina izcilas mērogošanas iespējas un efektivitāti. Daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP ir labi piemērota integrēšanai šķidrumu apstrādes sistēmās un automatizētās laboratorijas darbplūsmās.
 

Kāpēc izvēlēties apstrādi ar ultraskaņu citu hromatīna šķelšanas metožu vietā?

Salīdzinājumā ar fermentatīvām pieejām apstrāde ar ultraskaņu ChIP vajadzībām nodrošina fragmentēšanu bez secību atlases nobīdes, jo process nav atkarīgs no enzīmu aktivitātes, kas ir specifiska noteiktām secībām. Tas ir īpaši svarīgi visa genoma epiģenētiskajos pētījumos, kuros būtisks ir vienmērīgs pārklājums.
Vēl viena nozīmīga priekšrocība ir mērogojamība. Ultraskaņas sistēmās var apstrādāt atsevišķus paraugus, vairākas mēģenes vai veselas mikroplates, ļaujot laboratorijām izvēlēties eksperimentu caurlaidspējai vispiemērotāko konfigurāciju.
Visbeidzot, apstrāde ar ultraskaņu nodrošina lielisku fragmentēšanas parametru kontroli. Pielāgojot impulsu ciklus, ilgumu un jaudas līmeņus, pētnieki var droši iegūt vēlamo fragmentu izmēru sadalījumu.

Kā kvantitatīvi un kvalitatīvi novērtēt iegūto hromatīnu pēc fragmentēšanas ar ultraskaņu?

Pēc apstrādes ar ultraskaņu ChIP vajadzībām pētniekiem jānovērtē gan fragmentētā hromatīna daudzums, gan kvalitāte. Šis pārbaudes posms nodrošina, ka hromatīna fragmentēšana atbilst turpmāko lietojumu, piemēram, ChIP-qPCR vai ChIP-seq, prasībām.
Kvantitatīvā novērtēšana parasti sākas ar DNS koncentrācijas mērīšanu. Spektrofotometriskās metodes, piemēram, Nanodrop analīze, vai fluorometriskie testi, piemēram, DNS kvantitatīvā noteikšana ar Qubit, nodrošina ticamu hromatīna iznākuma novērtējumu pēc šķērssaišu pārraušanas un attīrīšanas.
Tomēr DNS koncentrācija pati par sevi neatklāj, vai fragmentēšana ir bijusi veiksmīga. Tāpēc pētnieki novērtē fragmentu izmēru sadalījumu, izmantojot elektroforēzes metodes. Agarozes gela elektroforēze joprojām ir plaši izmantota pieeja DNS fragmentu vizualizēšanai un pārbaudei, vai lielākā daļa fragmentu atrodas vēlamajā izmēru diapazonā.
Laboratorijas ar modernāku aprīkojumu bieži izmanto kapilārās elektroforēzes sistēmas, piemēram, Agilent Bioanalyzer vai TapeStation. Šīs platformas nodrošina precīzus izmēru sadalījuma profilus un ļauj pētniekiem konstatēt pārmērīgu fragmentēšanu vai nepilnīgu šķelšanu.

Novērtējot hromatīna kvalitāti pēc fragmentēšanas ar ultraskaņu, pētnieki parasti pārliecinās par turpmāko:

• Lielākās daļas DNS fragmentu garums ir 100–600 bp diapazonā
• Fragmentu sadalījums atkārtotajos paraugos ir vienāds
• DNS degradācija ir minimāla
• Kopējais hromatīna iznākums ir pietiekams plānotajai ChIP analīzei

Pienācīga kvalitātes kontrole nodrošina, ka hromatīna fragmentēšanas posms ar ultraskaņu sniedz reproducējamus un bioloģiski nozīmīgus rezultātus.

Secinājums: hromatīna fragmentēšana ar ultraskaņu uzticamiem pētījumiem

Uzticama hromatīna fragmentēšana ir sekmīgu ChIP un epiģenētikas pētījumu pamats. Fragmentēšana ar ultraskaņu piedāvā iedarbīgu risinājumu, jo tā nodrošina precīzu un reproducējamu hromatīna sagraušanu bez reaģentiem plašā eksperimentālo formātu klāstā.
Rūpīgi optimizējot apstrādes ar ultraskaņu parametrus, pārbaudot fragmentu izmēru sadalījumu un izvēloties piemērotu ultraskaņas apstrādes sistēmu – zondes tipa ultraskaņas apstrādes ierīci, vairāku mēģeņu apstrādes sistēmu VialTweeter vai augstas caurlaidspējas mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP –, pētnieki var panākt vienmērīgu hromatīna fragmentēšanu, kas palīdz iegūt augstas kvalitātes ChIP un ChIP-seq rezultātus.
Epiģenētikas pētījumiem turpinot attīstīties lielākas caurlaidspējas un labākas eksperimentu reproducējamības virzienā, hromatīna fragmentēšana ar ultraskaņu joprojām ir viena no daudzpusīgākajām un uzticamākajām metodēm, kas pieejamas mūsdienu molekulārās bioloģijas laboratorijām.

Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Vācijā radīta kvalitāte

Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces ir labi pazīstamas ar saviem augstākajiem kvalitātes un projektēšanas standartiem. Izturība un vienkārša lietošana ļauj mūsu ultraskaņas apstrādes ierīces viegli integrēt rūpnieciskās ražotnēs. Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces viegli tiek galā ar skarbiem apstākļiem un prasīgu darba vidi.

Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums, kas īpašu uzmanību pievērš augstas veiktspējas ultraskaņas apstrādes ierīcēm ar vismodernākajām tehnoloģijām un ērtu lietošanu. Protams, Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces atbilst CE prasībām un izpilda UL, CSA un RoHs prasības.

Literatūra / Atsauces

• Dreyer J., Ricci G., van den Berg J., Bhardwaj V., Funk J., Armstrong C., van Batenburg V., Sine C., VanInsberghe M.A., Marsman R., Mandemaker I.K., di Sanzo S., Costantini J., Manzo S.G., Biran A., Burny C., Völker-Albert M., Groth A., Spencer S.L., van Oudenaarden A., Mattiroli F. (2024): Acute multi-level response to defective de novo chromatin assembly in S-phase. Molecular Cell 2024.
• Mittal, N., Guimaraes, J.C., Gross, T. et al. (2017): The Gcn4 transcription factor reduces protein synthesis capacity and extends yeast lifespan. Nat Commun 8, 457 (2017).
• Shih H.-T., Chen W.-Y., Liu K.-Y., Shih Z.-S., Chen Y.-J., Hsieh P.-C., et al. (2016): dBRWD3 Regulates Tissue Overgrowth and Ectopic Gene Expression Caused by Polycomb Group Mutations. PLoS Genetics 12(9): e1006262.
• José A. Jarillo, Dorota N. Komar, and Manuel Piñeiro (2018): The Use of the Chromatin Immunoprecipitation Technique for In Vivo Identification of Plant Protein–DNA Interactions. Chapter in book: Luis Oñate-Sánchez (ed.), Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1794, 2018.
• Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V. et al. (2023): RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nature Communications 14, 5147 (2023)