Olbaltumvielu ekstrakcija ar ultraskaņas palīdzību fosfoproteomikai

Mūsdienu dzīvības zinātnēs fosfoproteomika ir kļuvusi par pamattehnoloģiju šūnu signālu pārvades ceļu atšifrēšanai un slimību mehānismu izpratnei sistēmu līmenī. Tā kā fosforilēšana regulē būtiskas bioloģiskās funkcijas – no enzīmu aktivitātes līdz olbaltumvielu savstarpējai mijiedarbībai –, tās precīza mērīšana ir nepieciešama gan fundamentālajiem pētījumiem, gan translācijas medicīnai. Nesenie sasniegumi masspektrometrijā ir ļāvuši vienā eksperimentā identificēt desmitiem tūkstošu fosforilēšanas notikumu, uzsverot nepieciešamību pēc uzticamām, mērogojamām un reproducējamām paraugu sagatavošanas darbplūsmām.
Viens no nozīmīgākajiem sasniegumiem šajā jomā ir olbaltumvielu ekstrakcijas ar ultraskaņas palīdzību ieviešana, kas ievērojami uzlabo paraugu kvalitāti, paraugu apstrādes caurlaidspēju un reproducējamību. Tādas ultraskaņas tehnoloģijas kā VialTweeter un UIP400MTP pašlaik pārveido veidu, kā laboratorijas apstrādā lielas paraugu kopas, īpaši augstas caurlaidspējas fosfoproteomikā.

Efektīvas paraugu sagatavošanas zinātniskā nozīme fosfoproteomikā

Olbaltumvielu fosforilēšana ir ļoti dinamiska un atgriezeniska pēctranslācijas modifikācija, kas skar lielāko daļu cilvēka šūnu olbaltumvielu. Tā regulē olbaltumvielu struktūru, lokalizāciju un mijiedarbības tīklus, un tās regulācijas traucējumi ir saistīti ar tādām slimībām kā vēzis un neirodeģenerācija.
Tomēr fosfoproteomiskā analīze rada specifiskus tehniskus izaicinājumus. Fosforilēto peptīdu daudzums bieži ir mazs, un tiem nepieciešama rūpīga bagātināšana un ļoti efektīva paraugu sagatavošana iepriekšējos posmos. Jebkura neefektivitāte olbaltumvielu ekstrakcijas vai šķelšanas laikā var izraisīt signāla zudumu, sliktu reproducējamību un nepilnīgu fosforilēšanas vietu aptvērumu.
Tieši šeit apstrāde ar ultraskaņu kļūst izšķiroši svarīga.

Kāpēc apstrāde ar ultraskaņu pārveido olbaltumvielu ekstrakciju

Apstrādē ar ultraskaņu izmanto augstas intensitātes ultraskaņas viļņus, lai mehāniski sagrautu šūnas un audus, nodrošinot efektīvu olbaltumvielu atbrīvošanu no šūnām, audiem, bioloģiskajiem šķidrumiem un ārpusšūnu vezikulām. Salīdzinājumā ar tradicionālajām līzes metodēm apstrādei ar ultraskaņu ir vairākas būtiskas priekšrocības:

• Pirmkārt, tā nodrošina ātru un vienmērīgu šūnu sagraušanu, kas ir īpaši svarīgi pārejošu fosforilēšanas stāvokļu saglabāšanai. Fosfoproteomikā pat neliela aizkavēšanās vai nepilnīga līze var mainīt signālu pārvades profilus, tādēļ ātra un reproducējama ekstrakcija ir būtiska.
• Otrkārt, apstrāde ar ultraskaņu uzlabo olbaltumvielu iznākumu un solubilizāciju, īpaši paraugiem, kurus ir grūti lizēt, piemēram, blīviem audiem vai šūnām ar lielu membrānu daudzumu. Tas tieši uzlabo turpmāko šķelšanu un fosfopeptīdu atgūšanu.
• Treškārt, apstrāde ar ultraskaņu pēc savas būtības ir mērogojama. Tādas ierīces kā VialTweeter ļauj vienlaikus apstrādāt ar ultraskaņu vairākus noslēgtus stobriņus, nodrošinot visiem paraugiem identiskus apstrādes apstākļus. Tas novērš mainīgumu, ko rada manuāla apstrāde.
• Ja nepieciešama vēl lielāka paraugu apstrādes caurlaidspēja, UIP400MTP nodrošina būtisku tehnoloģisku izrāvienu. Tas ļauj tieši apstrādāt ar ultraskaņu veselas mikroplates vai stobriņu statīvus, tostarp automātiskā paraugu padevēja flakonus, tādēļ tas ir ideāli piemērots simtiem paraugu paralēlai apstrādei. Šī iespēja ir īpaši vērtīga sistēmu bioloģijā un klīniskajos pētījumos, kur lielas paraugu kopas ir ierasta prakse.

Augstas caurlaidspējas apstrāde ar ultraskaņu: uzmanības centrā VialTweeter un UIP400MTP

Progresīvu ultraskaņas ierīču integrēšana fosfoproteomikas darbplūsmās sniedz ne tikai ērtības – tā ir metodoloģisks uzlabojums.
VialTweeter ir paredzēts vairāku noslēgtu flakonu sinhronizētai apstrādei ar ultraskaņu, līdz minimumam samazinot savstarpēju piesārņošanos un vienlaikus nodrošinot reproducējamību. Tas ir īpaši piemērots lietojumiem ar vidēju paraugu apstrādes caurlaidspēju un standartizētām darbplūsmām.
 

Savukārt UIP400MTP ir optimizēts darbam vidē ar augstu paraugu apstrādes caurlaidspēju, nodrošinot:

• Vienmērīga apstrāde ar ultraskaņu visā standarta mikroplašu platībā, piemēram, 96 vai 384 iedobju platēs
• Tieša mēģeņu statīvu un automātiskā paraugu ievadītāja flakonu apstrāde
• Ievērojams manuālā darba laika samazinājums
• Uzlabota reproducējamība lielās datu kopās

Šī mērogojamība pilnībā atbilst mūsdienu fosfoproteomikas pieejām, kuru darbplūsmās regulāri paralēli apstrādā desmitiem līdz simtiem paraugu.

Vispārīgs protokols fosfoproteomikas paraugu sagatavošanai ar ultraskaņas palīdzību

Uzticama fosfoproteomikas darbplūsma apvieno efektīvu olbaltumvielu ekstrakciju, fermentatīvo šķelšanu un fosfopeptīdu bagātināšanu. Tālāk sniegtais pārskats atspoguļo atzītu labo praksi, kas pielāgota sagatavošanai ar ultraskaņu:

1. Strauja bioķīmisko procesu apturēšana paraugos un paraugu savākšana
   Lai saglabātu fosforilēšanas stāvokļus, šūnās vai audos strauji aptur bioķīmiskos procesus – parasti ar momentānu sasaldēšanu. Šis solis ir izšķiroši svarīgs fosforilēšanas notikumu pārejošā rakstura dēļ.
2. Šūnu lizēšana ar ultraskaņu un olbaltumvielu ekstrakcija
   Paraugus atkausē un apstrādā ar ultraskaņu, parasti īsos ciklos. Ultraskaņas enerģija sagrauj šūnu membrānas un efektīvi atbrīvo olbaltumvielas. Validētās darbplūsmās apstrādi ar ultraskaņu veic vairākos ciklos, lai nodrošinātu pilnīgu lizēšanu.
   Piemērs: pēc paraugu atkausēšanas uz ledus šūnas lizēja, apstrādājot tās ar ultraskaņu, piemēram, izmantojot Vialtweeter ierīci 2 ciklos, katru ciklu 1 min.
3. Dzidrināšana un olbaltumvielu kvantitatīvā noteikšana
   Pēc lizēšanas paraugus centrifugē, lai atdalītu atliekas. Supernatantu, kas satur šķīstošās olbaltumvielas, savāc un kvantificē, lai nodrošinātu vienādu ievades daudzumu visiem paraugiem.
4. Reducēšana un alkilēšana
   Disulfīdu saites reducē (piemēram, izmantojot DTT) un alkilē (piemēram, izmantojot IAA), lai stabilizētu olbaltumvielas un uzlabotu šķelšanas efektivitāti.
5. Proteolītiskā šķelšana
   Olbaltumvielas fermentatīvi šķeļ, parasti ar tripsīnu, iegūstot masas spektrometrijas analīzei piemērotus peptīdus. Lasiet vairāk par olbaltumvielu šķelšanu, ko paātrina ar ultraskaņu!
6. Peptīdu attīrīšana un atsāļošana
   Peptīdus attīra, izmantojot uz C18 balstītas metodes, lai atdalītu piesārņotājus, kas varētu traucēt LC-MS analīzi.
7. Fosfopeptīdu bagātināšana
   Ņemot vērā fosforilēto peptīdu zemo sastopamību, fosfopeptīdu selektīvai izolēšanai izmanto bagātināšanas paņēmienus, piemēram, Fe-NTA vai TiO₂ afinitātes metodes.
8. LC-MS/MS analīze un datu apstrāde
   Bagātinātos paraugus analizē, izmantojot augstas izšķirtspējas masas spektrometriju un bieži vien no datiem neatkarīgu datu iegūšanu (DIA), lai uzlabotu kvantitatīvo noteikšanu un reproducējamību.

Jāuzsver, ka liela mēroga darbplūsmas var pielāgot 96 iedobju plašu formātiem, ļaujot paralēli apstrādāt līdz pat simtiem paraugu – šī pieeja ir pilnībā saderīga ar apstrādi ar ultraskaņu, izmantojot UIP400MTP.
 

Optimizēts protokols straujai bioķīmisko procesu apturēšanai fosfoproteomā, fosfopeptīdu bagātināšanai un Phos-DIA-MS.
Protokols un attēls: ©Die et al. 2023

Reproducējamības un datu kvalitātes uzlabošana ar ultraskaņas palīdzību

Viens no galvenajiem izaicinājumiem fosfoproteomikā ir panākt konsekventu kvantitatīvo noteikšanu lielās datu kopās. Paraugu sagatavošanas laikā radītā mainība var aizēnot bioloģiski nozīmīgas atšķirības.

Apstrāde ar ultraskaņu risina šo problēmu, nodrošinot:

1. Standartizētu enerģijas ievadi visos paraugos
2. Samazinātu manuālā darba radīto mainību
3. Uzlabotu reproducējamību olbaltumvielu ekstrakcijā un šķelšanā

Apvienojumā ar augstas paraugu apstrādes caurlaidspējas platformām, piemēram, UIP400MTP, laboratorijas var sasniegt tādu konsekvences līmeni, kas ir būtisks sistēmu bioloģijas pētījumiem un klīnisko biomarķieru atklāšanai.

Fosfoproteomikas nākotne: automatizācija un mērogojamība

Fosfoproteomikai turpinot attīstīties plaša mēroga un klīnisko lietojumu virzienā, pieprasījums pēc automatizācijas un paraugu apstrādes ražīguma tikai pieaugs. Uz apstrādi ar ultraskaņu balstīta paraugu sagatavošana, īpaši apvienojumā ar sistēmām, kas ir saderīgas ar mikroplatēm, ir būtiska tehnoloģija, kas paver šīs iespējas.
Apvienojot efektīvu ultraskaņas līzi, paralēlu apstrādi un saderību ar automatizētām darbplūsmām, tādas ierīces kā VialTweeter un UIP400MTP nosaka jaunus standartus paraugu sagatavošanā proteomikai.
Uzziniet vairāk par UIP400MTP integrēšanu automatizētās laboratorijas darbplūsmās!

Izmantojiet priekšrocības, ko sniedz paraugu sagatavošana ar ultraskaņu fosfoproteomikā!

Olbaltumvielu ekstrakcija ar ultraskaņu ir kļuvusi par būtisku mūsdienu fosfoproteomikas sastāvdaļu, nodrošinot nepārspējamu efektivitāti, mērogojamību un reproducējamību. Pieaugot nepieciešamībai analizēt sarežģītas bioloģiskās sistēmas lielās paraugu kopās, ultraskaņas tehnoloģijas sniedz ne tikai priekšrocības – tās ir nepieciešamas.
Nodrošinot standartizētas darbplūsmas ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu, tādi risinājumi kā VialTweeter un UIP400MTP paātrina atklājumus šūnu signalizācijas, slimību mehānismu un precīzijas medicīnas jomās.

Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Vācijā radīta kvalitāte

Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces ir labi pazīstamas ar saviem visaugstākajiem kvalitātes un konstrukcijas standartiem. Izturība un vienkārša lietošana ļauj mūsu ultraskaņas apstrādes ierīces netraucēti integrēt rūpnieciskajās ražotnēs. Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces viegli tiek galā ar skarbiem apstākļiem un prasīgu vidi.

Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums, kas īpašu uzmanību pievērš augstas veiktspējas ultraskaņas apstrādes ierīcēm ar vismodernākajām tehnoloģijām un lietotājam ērtu lietošanu. Protams, Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces atbilst CE prasībām un izpilda UL, CSA un RoHs prasības.

Hielscher vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes ierīču modeļi UIP400MTP mikroplatēm, VialTweeter un CupHorn: ātra paraugu sagatavošana ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu