Ar sonikāciju veicināta proteīnu ekstrakcija fosfoproteomikas vajadzībām

Mūsdienu dzīvības zinātnēs fosfoproteomika ir kļuvusi par stūrakmeni šūnu signalizācijas ceļu dekodēšanai un slimību mehānismu izpratnei sistēmu līmenī. Fosforilēšana regulē kritiski svarīgas bioloģiskās funkcijas. – no fermentu aktivitātes līdz proteīnu-proteīnu mijiedarbībai. – tā precīzs mērījums ir būtisks gan fundamentālajiem pētījumiem, gan translatoloģijai. Nesenie sasniegumi masspektrometrijā ir ļāvuši identificēt desmitiem tūkstošu fosforilēšanas gadījumu vienā eksperimentā, uzsverot nepieciešamību pēc stabilām, mērogojamām un reproducējamām paraugu sagatavošanas darba plūsmām.
Viens no ietekmīgākajiem sasniegumiem šajā jomā ir olbaltumvielu ekstrakcijas ar sonikācijas palīdzību ieviešana, kas ievērojami uzlabo paraugu kvalitāti, caurlaidību un reproducējamību. Ultraskaņas tehnoloģijas, piemēram, VialTweeter un UIP400MTP, tagad no jauna nosaka to, kā laboratorijas apstrādā lielas paraugu grupas, jo īpaši augstas veiktspējas fosfoproteomikā.

Fosfoproteomikas efektīvas paraugu sagatavošanas zinātniskā nozīme

Olbaltumvielu fosforilēšana ir ļoti dinamiska un atgriezeniska post-translācijas modifikācija, kas ietekmē lielāko daļu cilvēka šūnu olbaltumvielu. Tā regulē olbaltumvielu struktūru, lokalizāciju un mijiedarbības tīklus, un tās disregulācija ir saistīta ar tādām slimībām kā vēzis un neirodeģenerācija.
Tomēr fosfoproteomiskā analīze ir saistīta ar unikāliem tehniskiem izaicinājumiem. Fosforilētu peptīdu bieži vien ir maz, un tiem nepieciešama rūpīga bagātināšana un ļoti efektīva paraugu sagatavošana. Jebkāda neefektivitāte olbaltumvielu ekstrakcijas vai šķelšanas laikā var izraisīt signāla zudumu, sliktu reproducējamību un nepilnīgu fosfosītu pārklājumu.
Šajā brīdī sonikācija kļūst ļoti svarīga.

Kāpēc sonikācija pārveido proteīnu ekstrakciju

Sonikācijā izmanto augstas intensitātes ultraskaņas viļņus, lai mehāniski izjauktu šūnas un audus, tādējādi nodrošinot efektīvu olbaltumvielu izdalīšanos no šūnām, audiem, bioloģiskajiem šķidrumiem un ārpusšūnu vezikulām. Salīdzinot ar parastajām līzes metodēm, sonikācijai ir vairākas būtiskas priekšrocības:

• Pirmkārt, tas nodrošina ātru un vienmērīgu šūnu izjaukšanu, kas ir īpaši svarīgi, lai saglabātu pārejošus fosforilēšanas stāvokļus. Fosfoproteomikā pat neliela aizkavēšanās vai nepilnīga līze var mainīt signālu profilus, tāpēc ātra un reproducējama ekstrakcija ir būtiska.
• Otrkārt, sonikācija uzlabo olbaltumvielu iznākumu un šķīdināšanu, jo īpaši grūti šķīstošos paraugos, piemēram, blīvos audos vai membrānām bagātās šūnās. Tas tieši nozīmē labāku turpmāko šķelšanu un fosfopeptidu atgūšanu.
• Treškārt, ultraskaņas apstrāde ir pēc būtības mērogojama. Tādas ierīces kā VialTweeter ļauj vienlaicīgi sonicēt vairākas noslēgtas mēģenes, nodrošinot identiskus apstrādes apstākļus visiem paraugiem. Tas novērš mainīgumu, ko rada manuāla apstrāde.
• Lai nodrošinātu vēl lielāku caurlaides spēju, UIP400MTP ir liels tehnoloģisks solis uz priekšu. Tas ļauj tieši sonikēt veselas mikroplates vai mēģenīšu statīvus, tostarp automātiskās paraugu tvertnes, tādējādi tas ir ideāli piemērots simtiem paraugu paralēli. Šī iespēja ir īpaši vērtīga sistēmbioloģijā un klīniskajos pētījumos, kur parasti tiek izmantotas lielas paraugu grupas.

Augstas veiktspējas sonikācija: VialTweeter un UIP400MTP uzmanības centrā.

Moderno ultraskaņas ierīču integrācija fosfoproteomikas darba plūsmās nav tikai ērtība. – tas ir metodoloģisks uzlabojums.
VialTweeter ir paredzēts vairāku slēgtu flakonu sinhronizētai apstrādei ar ultraskaņu, samazinot savstarpējo piesārņojumu un nodrošinot reproducējamību. Tas ir īpaši piemērots vidējas caurlaidības lietojumiem un standartizētām darba plūsmām.
 

Turpretī UIP400MTP ir optimizēts augstas caurlaidības vidēm, ļaujot:

• Vienmērīga sonikācija visā standarta mikroplatēs, piemēram, 96 vai 384 iedobju plates.
• Tieša mēģenīšu plauktu un autosamplera flakonu apstrāde
• Ievērojami samazināts darba laiks
• Uzlabota reproducējamība lielās datu kopās

Šī mērogojamība lieliski atbilst mūsdienu fosfoproteomikas pieejām, kur darba plūsmas parasti paralēli apstrādā desmitiem līdz simtiem paraugu.

Vispārīgs protokols fosfoproteomisko paraugu sagatavošanai ar sonikācijas palīdzību

Robusta fosfoproteomikas darba plūsma apvieno efektīvu proteīnu ekstrakciju, fermentatīvo šķelšanu un fosfopeptidu bagātināšanu. Turpmāk izklāstītajā shēmā atspoguļota iedibinātā labākā prakse, kas pielāgota uz sonikāciju balstītai sagatavošanai:

1. Ātra paraugu dzēšana un savākšana
   Šūnas vai audi ātri izdziest – parasti izmantojot ātru sasaldēšanu – lai saglabātu fosforilēšanas stāvokļus. Šis solis ir ļoti svarīgs, jo fosforilēšanas procesi ir pārejoši.
2. Ultraskaņas šūnu līze un olbaltumvielu ekstrakcija
   Paraugus atkausē un pakļauj sonikācijai, parasti īsos ciklos. Ultraskaņas enerģija izjauc šūnu membrānas un efektīvi atbrīvo olbaltumvielas. Apstiprinātās darba plūsmās sonikāciju veic vairākos ciklos, lai nodrošinātu pilnīgu līzi.
   Piemērs: Pēc paraugu atkausēšanas uz ledus šūnu līzi panāca ar sonikāciju, piemēram, ar Vialtweeter instrumentu 2 ciklus, katrs cikls 1 min.
3. Noskaidrošana un olbaltumvielu kvantitatīva noteikšana
   Pēc līzes paraugus centrifugē, lai atdalītu atliekas. Supernatantu, kas satur šķīstošos proteīnus, savāc un kvantitatīvi nosaka, lai nodrošinātu viendabīgu ievadi visos paraugos.
4. Reducēšana un alkilēšana
   Disulfīdu saites tiek reducētas (piemēram, izmantojot DTT) un alkilētas (piemēram, izmantojot IAA), lai stabilizētu olbaltumvielas un uzlabotu sagremošanas efektivitāti.
5. proteolītiskā gremošana
   Olbaltumvielas tiek fermentatīvi sašķeltas, parasti ar tripsīnu, radot peptīdus, kas piemēroti masspektrometrijas analīzei. Uzziniet vairāk par ultraskaņas paātrinātu olbaltumvielu sagremošanu!
6. Peptīdu attīrīšana un atsāļošana
   Peptidus attīra, izmantojot C18 metodes, lai novērstu piesārņotājus, kas varētu traucēt LC-MS analīzi.
7. fosfopeptidu bagātināšana
   Ņemot vērā fosforilētu peptīdu nelielo daudzumu, lai selektīvi izolētu fosfopeptidus, tiek izmantotas tādas bagātināšanas metodes kā Fe-NTA vai TiO₂ afinitātes metodes.
8. LC-MS/MS analīze un datu apstrāde
   Bagātinātie paraugi tiek analizēti, izmantojot augstas izšķirtspējas masspektrometriju, bieži izmantojot no datiem neatkarīgu iegūšanu (DIA), lai uzlabotu kvantitatīvo noteikšanu un reproducējamību.

Jo īpaši liela mēroga darba plūsmas var pielāgot 96 iedobju plašu formātiem, ļaujot paralēli apstrādāt līdz pat simtiem paraugu. – pieeja, kas ir pilnībā saderīga ar UIP400MTP balstītu sonikāciju.
 

Optimizēts protokols ātrai fosfoproteoma slāpēšanai, fosfopeptidu bagātināšanai un Phos-DIA-MS.
Protokols un attēls: ©Die et al. 2023

Reproducējamības un datu kvalitātes uzlabošana, izmantojot sonikāciju

Viens no galvenajiem uzdevumiem fosfoproteomikā ir panākt konsekventu kvantifikāciju lielās datu kopās. Paraugu sagatavošanas laikā radusies mainība var aizēnot bioloģiski nozīmīgas atšķirības.

Sonikācija risina šo problēmu, nodrošinot:

1. Standartizēts enerģijas patēriņš visos paraugos
2. Samazināta manuālā mainība
3. Olbaltumvielu ekstrakcijas un šķelšanas reproducējamības uzlabošana

Apvienojumā ar augstas veiktspējas platformām, piemēram, UIP400MTP, laboratorijas var sasniegt konsekvences līmeni, kas ir būtisks sistēmu bioloģijas pētījumiem un klīnisko biomarķieru atklāšanai.

Fosfoproteomikas nākotne: Automatizācija un mērogojamība

Tā kā fosfoproteomika turpina paplašināties, kļūstot par liela mēroga un klīniskiem lietojumiem, pieprasījums pēc automatizācijas un caurlaidspējas tikai pieaugs. Uz sonikāciju balstīta paraugu sagatavošana, jo īpaši, ja tā ir integrēta ar mikroplatēm saderīgās sistēmās, ir galvenā veicinošā tehnoloģija.
Apvienojot efektīvu ultraskaņas līzi, paralēlu apstrādi un saderību ar automatizētām darba plūsmām, tādas ierīces kā VialTweeter un UIP400MTP nosaka jaunus standartus proteomikas paraugu sagatavošanā.
Uzziniet vairāk par UIP400MTP integrāciju automatizētajās laboratorijas darba plūsmās!

Izmantojiet sonikācijas atbalstītās paraugu sagatavošanas priekšrocības fosfoproteomikā!

Ar sonikāciju veicināta olbaltumvielu ekstrakcija ir kļuvusi par būtisku mūsdienu fosfoproteomikas sastāvdaļu, kas nodrošina nepārspējamu efektivitāti, mērogojamību un reproducējamību. Pieaugot nepieciešamībai analizēt sarežģītas bioloģiskās sistēmas lielās paraugu grupās, ultraskaņas tehnoloģijas ir ne tikai izdevīgas, bet arī noderīgas. – tie ir būtiski.
Nodrošinot augstas veiktspējas, standartizētas darba plūsmas, tādi risinājumi kā VialTweeter un UIP400MTP paātrina atklājumus šūnu signalizācijas, slimību mehānismu un precīzās medicīnas jomā.

Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Kvalitāte ražots Vācijā

Hielscher ultrasonikatori ir labi pazīstami ar saviem augstākajiem kvalitātes un dizaina standartiem. Robustums un viegla darbība ļauj vienmērīgi integrēt mūsu ultrasonikatorus rūpnieciskajās iekārtās. Hielscher ultrasonikatori viegli apstrādā neapstrādātus apstākļus un prasīgu vidi.

Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums un īpašu uzsvaru liek uz augstas veiktspējas ultrasonikatoriem, kas piedāvā vismodernākās tehnoloģijas un lietotājdraudzīgumu. Protams, Hielscher ultrasonikatori atbilst CE prasībām un atbilst UL, CSA un RoHs prasībām.

Hielscher Multi-Sample Sonicator modeļi UIP400MTP mikroplatēm, VialTweeter un CupHorn: ātrdarbīga un augstas veiktspējas paraugu sagatavošana