Proteomikas protokols: bezkontakta ultraskaņas apstrāde uzlabo peptīdu paraugu sagatavošanu masu spektrometrijai
„Bottom-up“ proteomika ir kļuvusi par mūsdienu biomarķieru atklāšanas, strukturālās bioloģijas un klīniskās diagnostikas stūrakmeni. Pirms masu spektrometrijas (MS) analīzes sadalot proteīnus peptīdos, pētnieki var panākt dziļāku sekvenču pārklājumu un uzticamāku kvantitatīvo noteikšanu. Tomēr augstas sarežģītības bioloģisko paraugu sagatavošana MS analīzei joprojām ir tehniski sarežģīta. Nesenie metodoloģiskie sasniegumi parāda, kā kontrolēta ultraskaņas apstrāde – īpaši izmantojot bezkontakta ultraskaņas iekārtu „VialTweeter Multi-Tube“ un mikroplates ultraskaņas iekārtu „UIP400MTP“ – var ievērojami optimizēt šo darba plūsmu, uzlabot rezultātu atkārtojamību un novērst bieži sastopamos instrumentu šaurās vietas.
Iepazīstieties ar detalizētu parauga sagatavošanas protokolu, lai iegūtu peptīdus, kuru izmērs ir piemērots analīzei ar MS.
Kam būtu jāizmanto bezkontakta ultraskaņas apstrāde peptīdu paraugu sagatavošanai?
- Proteomika „no apakšas uz augšu” & „Discovery Labs“: Pētnieki, kuri sagatavo ļoti sarežģītus paraugus LC-MS vai MALDI analīžu cikliem un kuriem nepieciešama stabila un augsta peptīdu izdalīšanās efektivitāte dažādās bioloģiskajās matricās.
- S-Trap™ & Aizturēšana, kas ierobežo lietotājus: Komandas, kas izmanto attīrīšanu ar mikrokolonnām un kurām nepieciešama kontrolēta DNS sadalīšana, lai novērstu kolonnas aizsērēšanu un nodrošinātu vienmērīgu parauga ievietošanu un hidrolīzi.
- Klīnisko & Translacionālās pētniecības grupas: Laboratorijas, kurās tiek apstrādāti audi, šūnas, plazma, serums vai cerebrospinālais šķidrums un kurās izšķiroša nozīme ir partiju starpā nodrošinātai reproducējamībai un paraugu integritātei.
- Kvantitatīvs & Mērķa MS Teams: Laboratorijas, kurās tiek veikti stingri salīdzinoši pētījumi, kuros atkārtoti lietojamie ultraskaņas ģeneratori rada savstarpējās piesārņošanas risku, kas varētu apdraudēt reti sastopamu peptīdu kvantitatīvo noteikšanu.
- Galvenās iekārtas & Operācijas ar lielu caurlaidspēju: Grupas, kas vienlaikus apstrādā vairākus bioloģiskos atkārtojumus un kurām noder VialTweeter ierīces nodrošinātā slēgtu caurulīšu un daudzu caurulīšu bloka ultraskaņas apstrāde, kas atbrīvo no zondes tīrīšanas, samazina darbam veltīto laiku un nodrošina aseptiskus apstākļus.
- Vecāku un skolotāju sapulce & Struktūrproteīnu pētnieki: Pētnieki, kuriem nepieciešama maiga, temperatūras kontrolēta apstrāde, lai saglabātu nestabilas modifikācijas un maksimāli palielinātu sekvences pārklājumu šūnu līzes un homogenizācijas laikā.
Vairāku paraugu Sonicator “VialTweeter” vairāku hermetiski noslēgtu flakonu bezkontakta paraugu sagatavošanai proteomikas vajadzībām
Protokola pārskats: no audiem un šūnām līdz peptīdiem, kas gatavi MS analīzei
Wojtkiewicz u.c. izklāstītā, plaši izmantotā „no apakšas uz augšu” proteomikas darba plūsma nodrošina uzticamu un mērogojamu metodi peptīdu paraugu sagatavošanai no dažādām bioloģiskām matricām. Sākot ar 50–100 mg ātri sasaldēta auda vai 1–20 miljoniem šūnu, šajā protokolā ir integrēta suspensijas uztveršanas (S-Trap™) tehnoloģija, kas ļauj efektīvi noņemt detergentus, sāļus un piemaisījumus pirms fermentatīvās sadalīšanas.
Pēc līzes, proteīnu kvantificēšanas, reducēšanas un alkilēšanas paraugs tiek paskābināts un ievietots S-Trap™ centrifugālajā kolonā, kur notiek tripsīna/lysC hidrolīze. Iegūtie peptīdi tiek eluēti, žāvēti un pakļauti LC-MS analīzei. Piemērojot šo darba plūsmu 50 mg cilvēka sirds auda, tā konsekventi nodrošina pietiekamu peptīdu daudzumu 30–40 injekcijām, identificējot vairāk nekā 4000 unikālu proteīnu vienā analīzes ciklā. Lai gan ķīmiskie procesi un attīrīšana, izmantojot kolonnas, ir labi definēti, procesa veiksmīga norise lielā mērā ir atkarīga no sākotnējās fiziskās sadalīšanas un DNS apstrādes posmiem.
Protokolā ieteikts izmantot „VialTweeter Multi-Tube Sonicator“ ultraskaņas apstrādei, lai izjauktu šūnas un sadalītu DNS – Abi šie posmi ir ļoti svarīgi peptīdu analīzē.
Ierīce „VialTweeter“ veic ultraskaņas apstrādi noslēgtiem 1,0, 1,5 un 2,0 ml Eppendorf mēģenēm, kā arī dažādām NUNC mēģenēm
Ultraskaņas šūnu un audu līze proteīnu ekstrakcijai
„Bottom-up“ proteomikas darba plūsmā ultraskaņas apstrāde ir galvenais posms šūnu paraugu līzē, lai ekstrahētu proteīnus turpmākai masu spektrometrijas analīzei. Pēc SDS šūnu līzes bufera pievienošanas šūnu nogulsnei paraugi tiek pakļauti ultraskaņas apstrādei, izmantojot VialTweeter Multi-Tube Sonicator. Protokolā tiek izmantotas 1,5 ml mikrocentrifūgas mēģenes, un tajā ir norādīts, ka ultraskaņas iekārta jādarbojas ar 30 % jaudu, 10 sekundes ieslēgta un 10 sekundes izslēgta, atkārtojot šo ciklu 3 reizes. Pēc 1 minūtes gaidīšanas cikls tiek atkārtots vēl divas reizes. Paraugi tiek nepārtraukti atdzesēti ar ledu.
Šis process ne tikai palīdz šūnu sadalīšanā, bet ir īpaši nepieciešams, lai sadalītu lizēšanas laikā atbrīvoto genomisko DNS. Efektīva DNS sadalīšana ir ļoti svarīga, lai samazinātu parauga viskozitāti un novērstu S-Trap™ kolonnu aizsērēšanu, tādējādi nodrošinot optimālu proteīnu atgūšanu un uzticamu turpmāko peptīdu hidrolīzi.
Ultraskaņas DNS sadalīšanas izšķirošā nozīme
Viena no visbiežākajām kļūmēm darba plūsmās, kurās izmanto S-Trap™, ir kolonnas aizsērēšana, ko gandrīz vienmēr izraisa augstas molekulmasas genomiskā DNS, kas atbrīvojas šūnu vai audu homogenizācijas laikā. Nesadalīta DNS ievērojami palielina parauga viskozitāti, aiztur peptīdus un bloķē mikroporaino S-Trap™ sorbenta slāni.
Ultraskaņas apstrāde atrisina šo problēmu, mehāniski sadalot DNS mazos, šķīstošos fragmentos. Pielietojot kontrolētu akustisko enerģiju, VialTweeter efektīvi sadala nukleīnskābes, neradot pārmērīgu siltumu un neievadot svešus piemaisījumus. Šī viskozitātes samazināšanās nodrošina vienmērīgu parauga ievietošanu, stabilu caurplūdes ātrumu un nepārtrauktu hidrolīzes kinētiku.
Optimizētie „VialTweeter“ ultraskaņas apstrādes parametri
Protokolā ir aprakstīta ļoti reproducējama ultraskaņošanas procedūra, kas optimizēta bioloģisko paraugu integritātes saglabāšanai un turpmākai saderībai ar masu spektrometriju (MS). Paraugiem, kas atrodas 1,5 ml mikrocentrifūgas mēģenēs, izmantojot bezkontakta bloka ultraskaņotāju „Hielscher VialTweeter“, šādi parametri nodrošina šūnu līzi un optimālu DNS sadalīšanu, vienlaikus saglabājot proteīnu struktūru:
- Amplitūda: 30 % jaudas
- Cikla režīms: 10 sekundes ieslēgts / 10 sekundes izslēgts
- Ilgums: 3 cikli (10 sek. ieslēgts/10 sek. izslēgts) → 1 minūtes atpūta uz ledus → atkārtot vēl 2 reizes
- Temperatūras kontrole: Apstrādes laikā paraugi tiek novietoti uz ledus, lai novērstu termisko denaturāciju un priekšlaicīgu fermentu aktivitāti
Šī impulsu ultraskaņas apstrādes metode novērš lokālu pārkaršanu, samazina peptīdu oksidāciju un nodrošina vienmērīgu akustisko iedarbību uz visiem flakoniem. Slēgtās caurules konfigurācija arī novērš nepieciešamību tīrīt zondi starp paraugiem, tādējādi ievērojami samazinot praktisko darbu laiku un operatora ietekmes variabilitāti.
Galvenās priekšrocības mūsdienu proteomikas darba plūsmām
VialTweeter integrēšana jūsu „bottom-up” proteomikas procesā sniedz vairākas praktiskas un zinātniskas priekšrocības:
- Pastāvīga DNS fragmentācija: Vienmērīga akustiskās enerģijas pievade visiem flakoniem nodrošina reproducējamu viskozitātes samazināšanu un novērš S-Trap™ piepildījuma svārstības starp partijām.
- Labilo modifikāciju saglabāšana: Apstrāde zemā temperatūrā ledus vannā saglabā pēctranslācijas modifikācijas (PTM) un novērš siltuma izraisītu proteīnu agregāciju šūnu līzes laikā.
- Optimizēta pēcapstrāde: Ar VialTweeter apstrādātos lizātus var tieši attīrīt, izmantojot centrifugēšanu, un noteikt to daudzumu bez papildu attīrīšanas posmiem, tādējādi paātrinot S-Trap™ hidrolīzes procesu.
- Mērogojamība & Elastību: Tie paši ultraskaņas apstrādes iestatījumi ir piemērojami gan augstas sarežģītības audu paraugiem, gan šūnu suspensijām, atbalstot atklājumu proteomikas, mērķtiecīgas kvantifikācijas un glikoproteomikas darba plūsmas. Hielscher mikropaliktņu ultraskaņas iekārtas ļauj viegli palielināt apjomu, apstrādājot lielu paraugu skaitu daudzbedrīšu mikropaliktņos.
Bezkontakta daudzcauruļu ultraskaņas iekārta „VialTweeter“ var darboties ledusskapjos
Ultraskaņas iekārtas proteomikas paraugu sagatavošanai
Augstas kvalitātes peptīdu paraugu sagatavošanai masu spektrometrijai nepieciešams kas vairāk nekā tikai efektīva līze – Tas prasa precīzu kontroli pār DNS sadalīšanu, temperatūru un piesārņojuma novēršanu. Iekļaujot Hielscher VialTweeter savā „bottom-up” proteomikas darba plūsmā, jūs varat novērst S-Trap™ aizsērēšanu, nodrošināt reproducējamu proteīnu izdalīšanu un saglabāt tīrību, kas nepieciešama jutīgām MS analīzēm. Neatkarīgi no tā, vai apstrādājat cilvēka audus, kultivētas šūnas vai sarežģītus lizātus, ultraskaņas bloka apstrāde nodrošina uzticamību, mērogojamību un procesa kontroli, kādu prasa mūsdienu proteomikas laboratorijas.
Lai palielinātu apstrādājamo paraugu skaitu, izmantojiet Hielscher fokusuētos, bezkontakta mikroplākšņu ultraskaņas apstrādes iekārtu modeļus UIP400MTP un UIP550MTP! Apstrādājiet jebkuru standarta daudzkameru plāksni, lai veiktu proteomikas pētījumus ar augstu caurlaidspēju!
Apstrāde ar slēgtu cauruli salīdzinājumā ar tradicionālajiem ultraskaņas ģeneratoriem ar zondi
Vēsturiski pētnieki DNS sadalīšanai ir izmantojuši ultraskaņas iekārtas ar tiešu kontaktu. Lai gan šīs sistēmas ir efektīvas, tās rada vairākus būtiskus ierobežojumus proteomikas darba plūsmās:
- Krustkontaminācijas risks: Viena un tā paša zondes atkārtota izmantošana vairākiem paraugiem rada aerosola pārnesi un izraisa krustenisko piesārņojumu, kas izkropļo kvantitatīvos MS rezultātus.
- Parauga zudums: Tieša ievadīšana var izraisīt šļakstīšanos, iztvaikošanu un vērtīgo peptīdu pielipšanu zondes virsmai.
- Tīrīšana: Rūpīga zondes dekontaminācija starp eksperimentu cikliem ir laikietilpīga un bieži vien nepilnīga, kas apdraud retu proteīnu pētījumus.
„VialTweeter“ bloka ultraskaņas apstrādes iekārta apstrādā paraugus pilnībā noslēgtās mikrocentrifūgas mēģenēs. Šī slēgtās sistēmas konstrukcija novērš zondes saskari ar paraugu, neļauj veidoties aerosoliem un nodrošina stingrus aseptiskos apstākļus visā homogenizācijas un līzes procesa laikā. Laboratorijām, kas apstrādā ļoti sarežģītus audu lizātus vai vairākas šūnu līnijas, tas nodrošina tīrākus MS datus, augstāku peptīdu izguvi un uzticamākus bioloģiskos atkārtojumus.
Pāreja uz augstas caurlaidspējas paraugu sagatavošanu daudzkameru plāksnēs
Izmantojot mikropaketes ultraskaņas iekārtas modeļus UIP400MTP un UIP550MTP, caurulīšu apstrādi var viegli pielāgot liela apjoma paraugu apstrādei jebkurā standarta daudzkameru plāksnē.
Multi-well plāksnes ultraskaņas UIP400MTP augstas veiktspējas olbaltumvielu ekstrakcijai no paraugiem
Bieži uzdotie jautājumi par ultraskaņas apstrādi peptīdu paraugu sagatavošanai
Kāpēc pirms S-Trap™ peptīdu apstrādes ir nepieciešama ultraskaņas apstrāde?
Ultraskaņas apstrāde ir nepieciešama, lai sadalītu augstmolekulmasas genomisko DNS, kas atbrīvojas šūnu vai audu līzes laikā. Nesadalīta DNS krasi palielina parauga viskozitāti, kas var aizsprostot S-Trap™ mikrokolonnu un aizturēt peptīdus, tādējādi ievērojami samazinot atgūstamību un MS saderību.
Kā VialTweeter blokveida ultraskaņas iekārta uzlabo paraugu sagatavošanu salīdzinājumā ar tradicionālajām zondes tipa ultraskaņas iekārtām?
Atšķirībā no ultraskaņas iekārtām ar tiešu kontaktu, kurām starp darba cikliem nepieciešama rūpīga tīrīšana un kurās pastāv aerosola pārneses risks, „VialTweeter“ apstrādā paraugus pilnībā noslēgtos flakonos un mikrocentrifūgas mēģenēs. Šī slēgto caurulīšu konstrukcija novērš savstarpējo piesārņojumu, neļauj paraugiem izplūst un nodrošina stingrus aseptiskos apstākļus visā homogenizācijas un šūnu līzes procesa laikā.
Kādi ir optimālie ultraskaņas apstrādes parametri proteomikas paraugu sagatavošanai?
Bioloģiskiem paraugiem, piemēram, šūnām un audiem, ieteicamajā protokolā tiek izmantots ultraskaņas aparāts „VialTweeter“ ar 30 % jaudu, strādājot ciklā „10 sekundes ieslēgts / 10 sekundes izslēgts“, ko atkārto 3 reizes. Apstrādes laikā paraugi jāuzglabā uz ledus, un, ja tiek apstrādāti ≥5 miljoni šūnu, cikls jāatkārto vēl divas reizes. (sk. Wojtkiewicz et al., 2021)
Ko man jādara, ja S-Trap™ kolonna aizsērē parauga ievietošanas laikā?
Kolonnas aizsērēšanu parasti izraisa augsta DNS viskozitāte vai nepietiekama nosēdināšana. Lai atrisinātu šo problēmu, pirms pipetēšanas rūpīgi centrifugējiet lizātu un pārliecinieties, ka DNS ir pietiekami sadalīta ar ultraskaņas palīdzību.
Kā bezkontakta ultraskaņas apstrāde uzlabo kvantitatīvās proteomikas darba plūsmas?
Kvantitatīvos pētījumos pat niecīga savstarpējā piesārņošana starp paraugiem var izkropļot mazsastopamu peptīdu mērījumus. „VialTweeter“ sistēmas slēgtā caurule un iespēja apstrādāt vairākus flakonus vienlaikus novērš zondes ievietošanu, nodrošina reproducējamību starp partijām un saglabā paraugu integritāti, lai veiktu precīzas salīdzinošās analīzes.
Kādu proteīna iznākumu un MS dziļumu varu sagaidīt, izmantojot šo protokolu?
Sākot ar 50 mg cilvēka sirds audu vai 5 miljoniem šūnu, S-Trap™ darba plūsma parasti nodrošina pietiekamu peptīdu daudzumu 30–50 LC-MS injekcijām, katrā analīzē konsekventi identificējot vairāk nekā 4 000 unikālu proteīnu. (sk. Wojtkiewicz et al., 2021)
Literatūra / Atsauces
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Uzņēmums „Hielscher Ultrasonics“ piedāvā jaudīgus bezkontakta ultraskaņas iekārtas paraugu sagatavošanai un klīniskajai analīzei. Daudzbedrīšu plākšņu ultraskaņas iekārta UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn un plūsmas ultraskaņas iekārta GDmini2 apstrādā paraugus, tos nepieskaroties.