Proteomikas protokols: bezkontakta apstrāde ar ultraskaņu uzlabo peptīdu paraugu sagatavošanu MS analīzei
Augšupējā proteomika ir kļuvusi par mūsdienu biomarķieru atklāšanas, strukturālās bioloģijas un klīniskās diagnostikas stūrakmeni. Pirms masas spektrometrijas (MS) analīzes sašķeļot proteīnus peptīdos, pētnieki var panākt plašāku sekvences pārklājumu un uzticamāku kvantitatīvo noteikšanu. Tomēr ļoti sarežģītu bioloģisko paraugu sagatavošana MS analīzei joprojām ir tehniski sarežģīta. Jaunākie metodoloģiskie sasniegumi parāda, kā kontrolēta apstrāde ar ultraskaņu – īpaši ar bezkontakta vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīci VialTweeter un mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP – var ievērojami racionalizēt šo darbplūsmu, uzlabot rezultātu reproducējamību un novērst bieži sastopamus instrumentu darbības ierobežojumus.
Iepazīstieties ar detalizētu paraugu sagatavošanas protokolu, lai iegūtu MS analīzei piemērota izmēra peptīdus.
Kam būtu jāizmanto bezkontakta apstrāde ar ultraskaņu peptīdu paraugu sagatavošanai?
- Augšupējās proteomikas un atklājumu pētniecības laboratorijas: Pētnieki, kuri sagatavo ļoti sarežģītus paraugus LC-MS vai MALDI darbplūsmām un kuriem nepieciešama vienmērīga peptīdu atgūšana ar augstu iznākumu no dažādām bioloģiskām matricām.
- S-Trap™ un uztveršanas suspensijā metodes lietotāji: Komandas, kuras izmanto attīrīšanu mikrokolonnās un kurām nepieciešama kontrolēta DNS fragmentēšana ar bīdes spēkiem, lai novērstu kolonnu aizsērēšanu un nodrošinātu netraucētu paraugu uznešanu un šķelšanu.
- Klīniskās un translācijas pētniecības grupas: Laboratorijas, kurās apstrādā audus, šūnas, plazmu, serumu vai cerebrospinālo šķidrumu un kurās izšķiroša nozīme ir rezultātu reproducējamībai starp paraugu partijām un paraugu integritātei.
- Kvantitatīvās un mērķētās MS komandas: Laboratorijas, kuras veic stingri kontrolētus salīdzinošus pētījumus un kurās zonžu ultraskaņas apstrādes ierīces rada savstarpējas kontaminācijas riskus, kas varētu apdraudēt mazā daudzumā sastopamu peptīdu kvantitatīvo noteikšanu.
- Koplietošanas pētniecības infrastruktūras un augstas paraugu caurlaidspējas laboratorijas: Grupas, kuras vienlaikus apstrādā vairākus bioloģiskos atkārtojumus un kurām priekšrocības sniedz apstrāde ar ultraskaņu slēgtās mēģenēs, izmantojot VialTweeter vairāku mēģeņu bloku, kas novērš nepieciešamību tīrīt zondi, samazina manuālā darba laiku un uztur aseptiskus apstākļus.
- PTM un proteīnu struktūras pētnieki: Pētnieki, kuriem nepieciešama saudzīga apstrāde kontrolētā temperatūrā, lai saglabātu labilās modifikācijas un maksimāli palielinātu sekvences pārklājumu šūnu līzes un homogenizācijas laikā.
Vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes ierīce “VialTweeter” vairāku noslēgtu flakonu paraugu bezkontakta sagatavošanai proteomikai
Protokola pārskats: no audiem un šūnām līdz MS analīzei gataviem peptīdiem
Plaši izmantotā augšupējās proteomikas darbplūsma, kuru aprakstījuši Wojtkiewicz un līdzautori, nodrošina uzticamu, mērogojamu metodi peptīdu paraugu sagatavošanai no dažādām bioloģiskām matricām. Sākot ar 50–100 mg strauji sasaldētu audu vai 1–20 miljoniem šūnu, protokolā tiek izmantota uztveršanas suspensijā (S-Trap™) tehnoloģija, lai pirms fermentatīvās šķelšanas efektīvi atdalītu detergentus, sāļus un piesārņotājus.
Pēc līzes, proteīnu kvantitatīvās noteikšanas, reducēšanas un alkilēšanas paraugu paskābina un uznes uz S-Trap™ centrifugēšanas kolonnas, kur notiek šķelšana ar tripsīnu/lysC. Iegūtos peptīdus eluē, izžāvē un analizē ar LC-MS. Izmantojot šo darbplūsmu 50 mg cilvēka sirds audu apstrādei, pastāvīgi tiek iegūts pietiekams peptīdu daudzums 30–40 injekcijām, katrā analīzes reizē identificējot vairāk nekā 4 000 unikālu proteīnu. Lai gan ķīmiskie procesi un attīrīšana kolonnās ir skaidri definēti, darbplūsmas sekmīga norise lielā mērā ir atkarīga no sākotnējiem fizikālās sagraušanas un DNS apstrādes posmiem.
Protokolā ieteikts izmantot vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīci VialTweeter šūnu lizēšanai un DNS fragmentēšanai ar bīdes spēkiem, izmantojot ultraskaņu – abi posmi ir izšķiroši peptīdu analīzei.
VialTweeter apstrādā ar ultraskaņu noslēgtas 1,0, 1,5 un 2,0mL Eppendorf mēģenes, kā arī dažādus NUNC flakonus
Šūnu un audu līze ar ultraskaņu proteīnu ekstrakcijai
Augšupējās proteomikas darbplūsmā apstrāde ar ultraskaņu ir būtisks šūnu paraugu līzes posms, lai ekstrahētu olbaltumvielas turpmākai masas spektrometrijas analīzei. Pēc SDS šūnu līzes buferšķīduma pievienošanas šūnu nogulsnēm paraugus apstrādā ar ultraskaņu, izmantojot vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīci VialTweeter. Protokolā izmanto 1,5 mL mikrocentrifūgas mēģenes un norāda, ka ultraskaņas apstrādes ierīce jādarbina ar 30% jaudu, to ieslēdzot uz 10 sekundēm un izslēdzot uz 10 sekundēm, atkārtojot 3 ciklus. Pēc 1 minūtes nogaidīšanas ciklu atkārto vēl divas reizes. Paraugus nepārtraukti dzesē ar ledu.
Šis process ne tikai veicina šūnu sagraušanu, bet ir īpaši nepieciešams, lai ar bīdes spēku iedarbību fragmentētu līzes laikā atbrīvoto genoma DNS. Efektīva DNS fragmentēšana ar bīdes spēku iedarbību ir būtiska, lai samazinātu parauga viskozitāti un novērstu S-Trap™ kolonnu aizsērēšanu, tādējādi nodrošinot optimālu olbaltumvielu atgūšanu un uzticamu turpmāko peptīdu šķelšanu.
Ultraskaņas izraisītas DNS fragmentēšanas izšķirošā nozīme
Viena no biežākajām kļūmēm darbplūsmās, kurās izmanto S-Trap™, ir kolonnu aizsērēšana, ko gandrīz vienīgi izraisa šūnu vai audu homogenizācijas laikā atbrīvotā lielas molekulmasas genoma DNS. Neskarta DNS krasi palielina parauga viskozitāti, aiztur peptīdus un nosprosto mikroporaino S-Trap™ sorbenta slāni.
Apstrāde ar ultraskaņu atrisina šo problēmu, mehāniski sadalot DNS mazos, šķīstošos fragmentos. Izmantojot kontrolētu akustisko enerģiju, VialTweeter efektīvi fragmentē nukleīnskābes ar bīdes spēku iedarbību, neradot pārmērīgu siltumu un neievadot svešus piesārņotājus. Šī viskozitātes samazināšana nodrošina netraucētu paraugu ievadīšanu, vienmērīgu caurplūdes ātrumu un nepārtrauktu šķelšanas kinētiku.
Optimizēti apstrādes ar ultraskaņu parametri ierīcei VialTweeter
Protokolā ir noteikts ļoti labi reproducējams apstrādes ar ultraskaņu režīms, kas optimizēts bioloģisko paraugu integritātes saglabāšanai un saderībai ar turpmāko MS analīzi. Apstrādājot paraugu 1,5mL mikrocentrifūgas mēģenēs ar Hielscher VialTweeter bezkontakta bloka ultraskaņas apstrādes ierīci, tālāk norādītie parametri nodrošina līzi un optimālu DNS fragmentēšanu ar bīdes spēku iedarbību, vienlaikus saglabājot olbaltumvielu struktūru:
- Amplitūda: 30% jaudas
- Cikla shēma: 10 sekundes IESLĒGTS / 10 sekundes IZSLĒGTS
- Ilgums: 3 cikli (10sec IESLĒGTS/10sec IZSLĒGTS) → 1 minūtes pauze uz ledus → atkārtot vēl 2 reizes
- Temperatūras regulēšana: apstrādes laikā paraugus novieto uz ledus, lai novērstu termisko denaturāciju un priekšlaicīgu enzīmu aktivitāti
Šāda impulsveida apstrāde ar ultraskaņu novērš lokālu pārkaršanu, samazina peptīdu oksidēšanos līdz minimumam un nodrošina vienmērīgu akustisko iedarbību uz visiem flakoniem. Apstrāde slēgtās mēģenēs arī novērš nepieciešamību tīrīt zondi starp paraugiem, krasi samazinot manuālā darba laiku un operatora izraisīto mainīgumu.
Galvenās priekšrocības mūsdienu proteomikas darbplūsmās
VialTweeter iekļaušana augšupējās proteomikas darbplūsmā sniedz vairākas praktiskas un zinātniskas priekšrocības:
- Vienmērīga DNS fragmentēšana: Vienmērīga akustiskās enerģijas pievadīšana visiem flakoniem nodrošina reproducējamu viskozitātes samazināšanos un novērš atšķirības starp paraugu partijām, ievadot paraugus S-Trap™ kolonnās.
- Labilu modifikāciju saglabāšana: Apstrāde zemā temperatūrā ledus vannā aizsargā pēctranslācijas modifikācijas (PTM) un novērš karstuma izraisītu olbaltumvielu agregāciju šūnu līzes laikā.
- Vienkāršota turpmākā apstrāde: Ar VialTweeter apstrādātus lizātus var tieši dzidrināt ar centrifugēšanu un kvantitatīvi analizēt bez papildu attīrīšanas posmiem, paātrinot sagatavošanu šķelšanai S-Trap™ kolonnās.
- Mērogojamība un elastība: Tie paši apstrādes ar ultraskaņu iestatījumi ir piemērojami gan ļoti sarežģīta sastāva audu paraugiem, gan šūnu suspensijām, atbalstot atklājumu proteomikas, mērķētas kvantitatīvās noteikšanas un glikoproteomikas darbplūsmas. Hielscher mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīces ļauj viegli palielināt apstrādes mērogu līdz lielam paraugu skaitam daudziedobju platēs.
Vairāku mēģeņu bezkontakta ultraskaņas apstrādes ierīci VialTweeter var darbināt dzesējamos skapjos
Ultraskaņas apstrādes ierīces proteomikas paraugu sagatavošanai
Augstas kvalitātes peptīdu paraugu sagatavošanai masspektrometrijai nepieciešama ne tikai efektīva līze – tā prasa arī precīzu DNS fragmentēšanas ar bīdes spēkiem un temperatūras kontroli, kā arī piesārņojuma novēršanu. Iekļaujot Hielscher VialTweeter savā augšupējās proteomikas darbplūsmā, varat novērst S-Trap™ aizsērēšanu, nodrošināt reproducējamu olbaltumvielu atgūšanu un uzturēt jutīgām MS analīzēm nepieciešamo tīrību. Neatkarīgi no tā, vai apstrādājat cilvēka audus, kultivētas šūnas vai sarežģītus lizātus, ultraskaņas apstrāde blokā nodrošina uzticamību, mērogojamību un procesa kontroli, ko pieprasa mūsdienīgas proteomikas laboratorijas.
Lai palielinātu apstrādājamo paraugu skaitu, izmantojiet Hielscher fokusētās bezkontakta mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīču modeļus UIP400MTP un UIP550MTP! Apstrādājiet jebkuru standarta vairāku iedobju plati augstas caurlaidspējas proteomikas vajadzībām!
Apstrāde noslēgtās mēģenēs salīdzinājumā ar tradicionālajām zondes ultraskaņas apstrādes ierīcēm
Vēsturiski pētnieki DNS fragmentēšanai ar bīdes spēkiem ir izmantojuši tieša kontakta zondes ultraskaņas apstrādes ierīces. Lai gan zondes sistēmas ir efektīvas, tās rada vairākus būtiskus ierobežojumus proteomikas darbplūsmās:
- Krusteniskā piesārņojuma risks: Vienas zondes atkārtota izmantošana vairākiem paraugiem izraisa aerosolu pārnesi un ievada krustenisko piesārņojumu, kas izkropļo kvantitatīvās MS rezultātus.
- Parauga zudums: Tieša zondes ievietošana var izraisīt izšļakstīšanos, iztvaikošanu un vērtīgo peptīdu pielipšanu zondes virsmai.
- Tīrīšana: Rūpīga zondes attīrīšana no piesārņojuma starp apstrādes reizēm ir laikietilpīga un bieži vien nepilnīga, tādējādi apdraudot nelielā daudzumā sastopamu olbaltumvielu pētījumus.
VialTweeter bloka ultraskaņas apstrādes ierīce apstrādā paraugus pilnībā noslēgtās mikrocentrifūgas mēģenēs. Šī noslēgtās sistēmas konstrukcija novērš zondes saskari ar paraugu, nepieļauj aerosolu veidošanos un uztur stingrus aseptiskus apstākļus visā homogenizācijas un līzes laikā. Laboratorijām, kas apstrādā ļoti sarežģītus audu lizātus vai vairākas šūnu līnijas, tas nozīmē tīrākus MS datus, lielāku peptīdu atgūšanu un uzticamākus bioloģiskos atkārtojumus.
Mēroga palielināšana līdz augstas caurlaidspējas paraugu sagatavošanai vairāku iedobju platēs
Izmantojot mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīču modeļus UIP400MTP un UIP550MTP, apstrādi mēģenēs var viegli paplašināt līdz augstas caurlaidspējas paraugu apstrādei jebkurā standarta vairāku iedobju platē.
Vairāku iedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP augstas caurlaidspējas olbaltumvielu ekstrakcijai no paraugiem
Bieži uzdotie jautājumi par apstrādi ar ultraskaņu peptīdu paraugu sagatavošanai
Kāpēc pirms peptīdu apstrādes ar S-Trap™ nepieciešama apstrāde ar ultraskaņu?
Apstrāde ar ultraskaņu ir nepieciešama, lai ar bīdes spēkiem fragmentētu lielas molekulmasas genomisko DNS, kas izdalās šūnu vai audu līzes laikā. Neskarta DNS krasi palielina parauga viskozitāti, un tas var aizsprostot S-Trap™ mikrokolonnu un aizturēt peptīdus, ievērojami samazinot atgūšanu un saderību ar MS.
Kā VialTweeter bloka ultraskaņas apstrādes ierīce uzlabo paraugu sagatavošanu salīdzinājumā ar tradicionālajām zondes ultraskaņas apstrādes ierīcēm?
Atšķirībā no tieša kontakta zondes ultraskaņas apstrādes ierīcēm, kurām nepieciešama rūpīga tīrīšana starp apstrādes reizēm un kuras rada aerosolu pārneses risku, VialTweeter apstrādā paraugus pilnībā noslēgtos flakonos un mikrocentrifūgas mēģenēs. Šī konstrukcija ar noslēgtām mēģenēm novērš krustenisko piesārņojumu, nepieļauj paraugu zudumu un uztur stingrus aseptiskus apstākļus visā homogenizācijas un šūnu līzes laikā.
Kādi ir optimālie ultraskaņas apstrādes parametri proteomikas paraugu sagatavošanai?
Bioloģiskiem paraugiem, piemēram, šūnām un audiem, ieteiktajā protokolā izmanto VialTweeter ultraskaņas apstrādes ierīci ar 30% jaudu un ciklu, kurā ierīce ir ieslēgta 10 sekundes un izslēgta 10 sekundes un kuru atkārto 3 reizes. Apstrādes laikā paraugi jātur uz ledus, un cikls jāatkārto vēl divas reizes, ja apstrādā ≥5 miljonus šūnu. (sal. Wojtkiewicz et al., 2021)
Kas man jādara, ja parauga ielādes laikā aizsērē mana S-Trap™ kolonna?
Kolonnas aizsērēšanu parasti izraisa augsta DNS viskozitāte vai nepietiekama dzidrināšana. Lai to novērstu, pirms pipetēšanas rūpīgi centrifugējiet lizātu un pārliecinieties, ka DNS ir pietiekami fragmentēta ar bīdes spēkiem ultraskaņas apstrādes laikā.
Kā bezkontakta apstrāde ar ultraskaņu palīdz kvantitatīvās proteomikas darbplūsmās?
Kvantitatīvos pētījumos pat niecīga paraugu savstarpēja kontaminācija var izkropļot nelielā daudzumā sastopamu peptīdu mērījumu rezultātus. Vairāku paraugu apstrāde slēgtās mēģenēs ar VialTweeter novērš nepieciešamību ievietot zondi, nodrošina reproducējamību starp paraugu partijām un saglabā paraugu integritāti precīzām salīdzinošām analīzēm.
Kādu olbaltumvielu iznākumu un MS analīzes dziļumu varu sagaidīt, izmantojot šo protokolu?
Sākot ar 50 mg cilvēka sirds audu vai 5 miljoniem šūnu, S-Trap™ darbplūsma parasti nodrošina pietiekamu peptīdu daudzumu 30–50 LC-MS injekcijām, katrā analīzes reizē konsekventi identificējot vairāk nekā 4 000 unikālu olbaltumvielu. (sk. Wojtkiewicz et al., 2021)
Literatūra / Atsauces
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Wojtkiewicz M., Berg Luecke L., Kelly M.I., Gundry R.L. (2021): Facile Preparation of Peptides for Mass Spectrometry Analysis in Bottom-Up Proteomics Workflows. Current Protocols 2021 Mar;1(3):e85.
- Lori C., Kaczmarczyk A., de Jong I., Jenal U. (2018): A single-domain response regulator functions as an integrating hub to coordinate general stress response and development in alphaproteobacteria. mBio Vol 9, No 3; 2018.
- Jorge S., Pereira K., López-Fernández H., LaFramboise W., Dhir R., Fernández-Lodeiro J., Lodeiro C., Santos H.M., Capelo-Martínez J.L. (2020): Ultrasonic-assisted extraction and digestion of proteins from solid biopsies followed by peptide sequential extraction hyphenated to MALDI-based profiling holds the promise of distinguishing renal oncocytoma from chromophobe renal cell carcinoma. Talanta, 2020.
Hielscher Ultrasonics piegādā jaudīgas bezkontakta ultraskaņas apstrādes ierīces paraugu sagatavošanai un klīniskajai analīzei. Daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP, VialTweeter, CupHorn un plūsmas ultraskaņas apstrādes ierīce GDmini2 apstrādā paraugus, tiem nepieskaroties.