Deparafinizācija un olbaltumvielu ekstrakcija no FFPE

Atvieglojiet olbaltumvielu ekstrakciju no formalīnā fiksētiem parafīna iestrādātiem (FFPE) audu sekcijām, izmantojot optimizētu deparafinizācijas, šķīdināšanas un ultraskaņas kombināciju ar VialTweeter daudzcauruļu ultraskaņas atoru. Šis protokols atbalsta uz masas spektrometriju balstītu proteomiku un ir saderīgs ar SP3 tīrīšanas un fermentatīvās gremošanas darbplūsmām.

Šī SOP ir paredzēta laboratorijas personālam, kas iesaistīts FFPE audu paraugu proteomiskajā analīzē, izmantojot augstas veiktspējas ultraskaņas sistēmu. Tas ir optimizēts līdz desmit FFPE paraugiem, kas apstrādāti paralēli, izmantojot VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Protokols: Olbaltumvielu ekstrakcija no FFPE paraugiem, izmantojot VialTweeter

Materiāli un reaģenti

Reaģentiem

• Ksilols (histoloģijas pakāpe)
• Etanols (absolūtais 96%)
• Līzes buferšķīdums:

6 M guanidīna hidrohlorīds
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-karboksietil)fosfīns)
40 mM CAA (2-hloracetamīds)

• Proteāzes inhibitors (pēc izvēles; piemēram, bez cOmplete™ mini EDTA)

Iekārtas

• VialTweeter daudzcauruļu ultraskaņas aparāts
• 1,5 ml vai 2,0 ml zemas saistīšanas mikrocentrifūgas mēģenes
• Siltuma bloks vai inkubators (95 °C un 80 °C iestatījumi)
• Mikrocentrifūga
• Termomikseris (pēc izvēles, bet ieteicams)

Ievades paraugs

• 1–2 sekcijas ar 10 μm biezu FFPE audu vienā paraugā (t. i., vienā flakonā)

vai

• Kopā ~100 μg audu vienā paraugā (t.i., vienā flakonā)

Piezīme: Mikrotomijai izmantojiet svaigus asmeņus, lai samazinātu parafīna atkritumu piesārņojumu.

Procedūru

1. deparafinizācija
   1. FFPE sekcijas pārnes mikrocentrifūgas mēģenēs ar zemu saistību.
   2. Pievienojiet 1 ml ksilola, īsi virpulis.
   3. Inkubē 10 minūtes istabas temperatūrā.
   4. Centrifugē 14 000 × g 2 minūtes; izmest supernatantu.
   5. Atkārtojiet ksilola mazgāšanu vēlreiz (2.–4. darbība).
   6. Mazgā granulas ar 1 ml 96% etanola, virpulis, pēc tam 2 minūtes centrifugē 14 000 × g. Izmetiet supernatantu.
   7. Atkārto etanola mazgāšanu vēlreiz (kopā 2 etanola mazgāšanas reizes).
   8. Gaisā žāvē granulas 10 minūtes istabas temperatūrā ar atvērtiem vākiem, lai iztvaicētu atlikušo etanolu.
2. Olbaltumvielu ekstrakcija un ultraskaņas apstrāde
   1. Katrai sausai granulai pievieno 200 μl līzes buferšķīduma.
      Piezīme: Lai gan ultraskaņas aparāts uzņem līdz 1 ml, 200 μl ir optimāli pakārtotai apstrādei.

   2. Sajauciet ar virpuļošanu vai maigu pipetēšanu.
3. Pirmā termiskā inkubācija
   1. Mēģenes inkubē 95 °C temperatūrā 30 minūtes, maisot pie 400 apgr./min., izmantojot termomaisītāju vai siltuma bloku.
   2. Ļaujiet paraugiem atdzist istabas temperatūrā 5 minūtes.
4. Pirmā ultraskaņa ar VialTweeter
   1. Ievietojiet caurules VialTweeter.
   2. Iestatiet VialTweeter UP200St uz zemāk norādītajām vērtībām un sonicate.
Ultraskaņas skaņas iestatījumi
• Iestatiet amplitūdu (A) uz 100%
• Iestatiet pulsācijas režīmu (C) uz 100%
• Perioda pulkstenis: ieslēgts
• Laikā: 60 gadi
• Izslēgšanas laiks: 30s
• Robežvērtība: 15 min (atbilst 10 cikliem)
(Aprēķina piezīme: (60 s ieslēgts + 30 s izslēgts) × 10 cikli = 900 s = 15 min)
5. Otrā termiskā inkubācija
   Noņemiet mēģenes un vēlreiz inkubējiet 95 °C temperatūrā 15 minūtes, 400 apgr./min.
6. Otrā ultraskaņas apstrāde
   Atkārtojiet ultraskaņas apstrādi VialTweeter, izmantojot tos pašus iestatījumus (kā iepriekš) vēl 10 ciklus (kopā 15 minūtes).
7. Lizāta precizēšana
   1. Paraugus centrifugē 13 000 × g temperatūrā 10 minūtes 23 °C temperatūrā (istabas temperatūrā).
   2. Uzmanīgi savāciet supernatantu jaunā 2,0 ml Safe-lock Eppendorf mēģenē. Izvairieties no granulu traucēšanas.
8. Pakārtotā apstrāde
   Lizāts tagad ir gatavs SP3 tīrīšanai un fermentatīvai gremošanai.

Piezīmes un paraugprakse

1. Pārkaršanas risku ultraskaņas laikā mazina ieprogrammēts ieslēgšanas / izslēgšanas cikls.
2. Izvairieties no virpuļošanas pēc ultraskaņas, lai novērstu olbaltumvielu agregāciju.

Atkritumu apglabāšana un drošība

Zemāk redzamajā tabulā ir sniegta norāde par mūsu laboratorijas lieluma ultrasonikatoru aptuveno apstrādes jaudu: