Deparafinēšana un proteīnu ekstrakcija no FFPE

Atvieglojiet proteīnu ekstrakciju no formalīnā fiksētu, parafīnā ieguldītu (FFPE) audu griezumiem, izmantojot optimizētu deparafinēšanas, solubilizācijas un apstrādes ar ultraskaņu kombināciju ar VialTweeter vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīci. Šis protokols nodrošina turpmāku uz masspektrometriju balstītu proteomikas analīzi un ir saderīgs ar SP3 attīrīšanas un enzimātiskās šķelšanas darbplūsmām.

Šī standarta darba procedūra (SOP) ir paredzēta laboratorijas personālam, kas veic FFPE audu paraugu proteomikas analīzi, izmantojot augstas veiktspējas apstrādi ar ultraskaņu. Tā ir optimizēta līdz desmit FFPE paraugu paralēlai apstrādei, izmantojot VialTweeter vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīci.

Protokols: proteīnu ekstrakcija no FFPE paraugiem, izmantojot VialTweeter

Materiāli un reaģenti

Reaģenti

• Ksilols (histoloģijai piemērotas tīrības pakāpes)
• Etanols (absolūtais 96%)
• Līzes buferšķīdums:

6 M guanidīna hidrohlorīds
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-karboksietil)fosfīns)
40 mM CAA (2-hloracetamīds)

• Proteāžu inhibitors (pēc izvēles; piemēram, cOmplete™ mini EDTA-free)

Aprīkojums

• VialTweeter vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīce
• 1,5 mL vai 2,0 mL mikrocentrifūgas mēģenes ar zemu vielu piesaisti pie sieniņām
• Sildbloks vai inkubators (95°C un 80°C iestatījumi)
• Mikrocentrifūga
• Termomikseris (pēc izvēles, bet ieteicams)

Sākotnējais parauga daudzums

• 1–2 FFPE audu griezumi, katrs 10 µm biezs, vienam paraugam (t. i., vienam flakonam)

VAI

• Kopā ~100 µg audu vienam paraugam (t. i., vienam flakonam)

Piezīme: mikrotomijai izmantojiet jaunus asmeņus, lai samazinātu piesārņojumu ar parafīna atliekām.

Procedūra

1. Deparafinēšana
   1. Pārnesiet FFPE griezumus mikrocentrifūgas mēģenēs ar zemu vielu piesaisti pie sieniņām.
   2. Pievienojiet 1 mL ksilola un īsi samaisiet vorteksa maisītājā.
   3. Inkubējiet 10 minūtes istabas temperatūrā.
   4. Centrifugējiet ar 14 000 × g 2 minūtes; izlejiet supernatantu.
   5. Atkārtojiet mazgāšanu ar ksilolu vēl vienu reizi (2.–4. darbība).
   6. Mazgājiet nogulsnes ar 1 mL 96% etanola, samaisiet vorteksa maisītājā un pēc tam centrifugējiet ar 14 000 × g 2 minūtes. Izlejiet supernatantu.
   7. Atkārtojiet mazgāšanu ar etanolu vēl vienu reizi (kopā 2 mazgāšanas reizes ar etanolu).
   8. Žāvējiet nogulsnes gaisā 10 minūtes istabas temperatūrā ar atvērtiem vāciņiem, lai iztvaicētu atlikušo etanolu.
2. Proteīnu ekstrakcija un apstrāde ar ultraskaņu
   1. Katrām sausajām nogulsnēm pievienojiet 200 µL līzes buferšķīduma.

      Piezīme: lai gan ultraskaņas apstrādes ierīcē var apstrādāt līdz 1 mL, turpmākajai apstrādei optimālais tilpums ir 200 µL.

   2. Samaisiet vorteksa maisītājā vai saudzīgi pipetējot.
3. Pirmā termiskā inkubācija
   1. Inkubējiet mēģenes 95 °C temperatūrā 30 min, maisot ar 400 rpm un izmantojot termomikseri vai sildbloku.
   2. Ļaujiet paraugiem atdzist istabas temperatūrā 5 min.
4. Pirmā apstrāde ar ultraskaņu, izmantojot VialTweeter
   1. Ievietojiet mēģenes VialTweeter ierīcē.
   2. Iestatiet VialTweeter UP200St tālāk norādītās vērtības un veiciet apstrādi ar ultraskaņu.
Ultraskaņas apstrādes ierīces iestatījumi
• Iestatiet amplitūdu (A) uz 100%
• Iestatiet pulsācijas režīmu (C) uz 100%
• Perioda taimeris: ieslēgts
• Ieslēguma laiks: 60s
• Izslēguma laiks: 30s
• Robežvērtība: 15 min (atbilst 10 cikliem)
(Piezīme par aprēķinu: (60 s ieslēgts + 30 s izslēgts) × 10 cikli = 900 s = 15 min)
5. Otrā termiskā inkubācija
   Izņemiet mēģenes un atkārtoti inkubējiet 95 °C temperatūrā 15 min ar 400 rpm.
6. Otrā apstrāde ar ultraskaņu
   Atkārtojiet apstrādi ar ultraskaņu VialTweeter ierīcē, izmantojot tos pašus iestatījumus (kā norādīts iepriekš), vēl 10 ciklus (kopā 15 min).
7. Lizāta dzidrināšana
   1. Centrifugējiet paraugus ar 13 000 × g 10 min 23°C temperatūrā (istabas temperatūrā).
   2. Uzmanīgi pārnesiet supernatantu jaunā 2,0 mL Safe-lock Eppendorf mēģenē. Izvairieties no nogulšņu uzduļķošanas.
8. Turpmākā apstrāde
   Lizāts tagad ir gatavs SP3 attīrīšanai un enzimātiskajai šķelšanai.

Piezīmes un labākā prakse

1. Pārkaršanas risku apstrādes ar ultraskaņu laikā mazina ieprogrammēta ieslēgšanas un izslēgšanas ciklu maiņa.
2. Pēc apstrādes ar ultraskaņu izvairieties no maisīšanas vorteksa maisītājā, lai novērstu proteīnu agregāciju.

Atkritumu apsaimniekošana un drošība

Tālāk redzamā tabula sniedz priekšstatu par mūsu laboratorijas ultraskaņas apstrādes ierīču aptuveno apstrādes jaudu: