Protokols Hielscher vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes ierīču izmantošanai bioplēvju un proteomikas analīzē

Vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes ierīču, piemēram, VialTweeter Multi-Tube Sonicator un UIP400MTP Microplate Sonicator, izmantošana racionalizē laboratorijas darbplūsmas lietojumos ar lielu paraugu caurlaidspēju. Abas ierīces ļauj precīzi un vienmērīgi apstrādāt ar ultraskaņu vairākus paraugus, samazinot mainīgumu un uzlabojot reproducējamību. Tas ir īpaši izdevīgi eksperimentos, kuros nepieciešama konsekventa paraugu līze, bioplēvju atdalīšana, olbaltumvielu ekstrakcija vai proteolītiskā šķelšana un kuros manuālas vai atsevišķu paraugu apstrādes metodes ir mazāk efektīvas un biežāk rada nevienmērīgus rezultātus.

Racionalizējiet darbplūsmas ar vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes ierīcēm

Piemēram, UIP400MTP ļauj vienlaikus apstrādāt ar ultraskaņu mikroplates iedobes, nodrošinot vienmērīgu bioplēvju vai šūnu materiāla atdalīšanu. Savukārt VialTweeter nodrošina precīzu vairāku mēģenēs ievietotu paraugu līzi un homogenizāciju bez savstarpējas kontaminācijas. Šīs ultraskaņas apstrādes ierīces ievērojami saīsina apstrādes laiku, uzlabo eksperimentu reproducējamību un saglabā augstu paraugu integritāti, padarot tās par neaizstājamiem instrumentiem mikrobioloģijas, proteomikas un molekulārās bioloģijas pētījumos.
Tālāk sniegts detalizēts protokols, kas ilustrē Hielscher vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes ierīču modeļu VialTweeter Multi-Tube Sonicator un Microplate Sonicator UIP400MTP izmantošanu pētījumā par E. coli bioplēvju veidošanos un turpmāko proteomikas analīzi.

Protokols: bioplēvju veidošanās, atdalīšana un proteomikas analīze, izmantojot Hielscher vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes ierīces

1. Baktēriju kultūras sagatavošana

• Kultivējiet E. coli baktērijas (celms W3110) 30°C temperatūrā, kas ir labvēlīga E. coli bioplēvju veidošanai, triptona buljona (TB) barotnē, kas satur:
  – 10 g/L triptona
  – 5 g/L NaCl
• Pēc vajadzības pievienojiet antibiotikas, lai nodrošinātu plazmīdu saglabāšanos.
• Mikroskopijas un promotoru aktivitātes pētījumiem izmantojiet E. coli celmu W3110 ar genomā iekļautu uzlabotā GFP (eGFP) reportieri rplL promotora kontrolē.
• Izmantojiet GFP reportierplazmīdas dažādiem promotoriem (piem., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ), lai izmērītu promotoru aktivitāti.

2. Bioplēvju audzēšana un atdalīšana

• Iesējiet 1,5 mL atšķaidītas baktēriju kultūras katrā 12 iedobju plates iedobē (CellStar 12 iedobju plates, Greiner Bio-One).
• Inkubējiet, lai ļautu izveidoties bioplēvei.
• Uzmanīgi noņemiet planktonisko (nepiesaistīto) kultūru.

– Izskalojiet katru iedobi ar 500 µL PBS.
– Atdaliet piesaistītās šūnas, apstrādājot 12 iedobju plati ar ultraskaņu UIP400MTP mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīcē. UIP400MTP nodrošina vienmērīgu atdalīšanu, pievadot vienādu ultraskaņas enerģiju visām iedobēm.
– Ultraskaņas apstrādes iestatījumi: 60% amplitūda, cikliskais režīms: 60 sec IESLĒGTS / 30 sec IZSLĒGTS.

3. Šūnu savākšana un līze

• Centrifugējiet atdalītās bioplēves šūnas ar 4 500 g 5 minūtes.
• Mazgājiet šūnu nogulsnes ar PBS.
• Resuspendējiet šūnas 100 µL 2% nātrija lauroilsarkozināta (SLS) šķīduma un inkubējiet 95°C temperatūrā 15 minūtes.
• Apstrādājiet ar ultraskaņu, izmantojot VialTweeter Multi-Tube Sonicator, lai nodrošinātu pilnīgu šūnu līzi.
  – Ultraskaņas apstrādes iestatījumi: 100% amplitūda, 50 s IESLĒGTS / 10 s IZSLĒGTS, kopējais darbības laiks 10 min; turiet paraugus uz ledus.

4. Reducēšana un alkilēšana

• Pievienojiet 5 mM tris(2-karboksietil)fosfīnu (TCEP), lai reducētu disulfīdsaites, un inkubējiet 95°C temperatūrā 15 minūtes.
• Alkilējiet olbaltumvielas ar 10 mM jodacetamīdu 30 minūtes 25°C temperatūrā.

5. Olbaltumvielu kvantitatīvā noteikšana un šķelšana

• Centrifugējiet lizātus, lai atdalītu šūnu atliekas.
• Nosakiet kopējo olbaltumvielu saturu, izmantojot Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Šķeliet 50 µg kopējo olbaltumvielu ar 1 µg tripsīna šķīdumā, kas satur 2% SLS un 100 mM amonija hidrogēnkarbonāta.
• Inkubējiet šķelšanas reakcijas maisījumu visu nakti 30°C temperatūrā.

6. Peptīdu attīrīšana

• Izgulsnējiet SLS, pievienojot 1,5% trifluoretiķskābi (TFA), pēc tam centrifugējiet.
• Attīriet peptīdus, izmantojot C18 mikrocentrifugēšanas kolonnas.
• Izžāvējiet attīrītos peptīdus un resuspendējiet 0,1% TFA.

7. Šķidruma hromatogrāfija–masspektrometrija (LC-MS/MS)

• Analizējiet peptīdus ar Q-Exactive Plus masspektrometru, kas savienots ar Ultimate 3000 RSLC nano sistēmu.
• Atdaliet peptīdus, izmantojot apgrieztās fāzes HPLC kolonnu (75 µm × 42 cm), kas pildīta ar C18 sorbentu (2,4 µm).
• Izmantojiet šķīdinātāja B (acetonitrils ar 0,15% skudrskābes) gradientu no 2% līdz 35% 140 minūšu laikā.
• Iegūstiet datus, veicot augstas izšķirtspējas MS skenēšanu un pēc tās – 10 visintensīvāko jonu tandēma MS/MS skenēšanu.

8. Datu analīze

• Apstrādājiet neapstrādātos LC-MS datus, izmantojot Progenesis programmatūru.
• Eksportējiet .mgf failus un analizējiet tos ar MASCOT.
• Veiciet peptīdu kvantitatīvo noteikšanu, izmantojot SafeQuant kvalitātes kontrolei un kļūdaini pozitīvu atradumu korekcijai.
• Veiciet visus eksperimentus divos vai trijos atkārtojumos, lai nodrošinātu reproducējamību.

Vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes ierīces paraugu sagatavošanai ar lielu paraugu caurlaidspēju

Vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes ierīču modeļi VialTweeter un UIP400MTP ievērojami uzlabo eksperimentālo darbplūsmu precizitāti un efektivitāti, īpaši bioplēvju pētniecībā un proteomikā. To spēja vienmērīgi apstrādāt vairākus paraugus nodrošina lielu paraugu caurlaidspēju, nepasliktinot datu kvalitāti. Šīs priekšrocības kopā ar iepriekš aprakstītajām racionalizētajām darbplūsmām padara Hielscher vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes ierīces par būtiskiem instrumentiem mūsdienu bioloģiskajos pētījumos.

Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Vācijā radīta kvalitāte

Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces ir labi pazīstamas ar visaugstākajiem kvalitātes un projektēšanas standartiem. Izturība un vienkārša lietošana ļauj mūsu ultraskaņas apstrādes ierīces viegli integrēt rūpnieciskajās ražotnēs. Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces viegli tiek galā ar skarbiem apstākļiem un prasīgu darba vidi.

Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums, kas īpašu uzmanību pievērš augstas veiktspējas ultraskaņas apstrādes ierīcēm ar vismodernākajām tehnoloģijām un ērtu lietošanu. Protams, Hielscher ultraskaņas apstrādes ierīces atbilst CE prasībām un izpilda UL, CSA un RoHs prasības.