Protokols, izmantojot Hielscher vairāku paraugu ultraskaņas aparātus bioplēves un proteomikas analīzē

Vairāku paraugu ultraskaņas aparātu, piemēram, VialTweeter Multi-Tube Sonicator un UIP400MTP Microplate Sonicator, izmantošana racionalizē laboratorijas darbplūsmas augstas caurlaidspējas lietojumiem. Abas ierīces ļauj precīzi un vienmērīgi apstrādāt ultraskaņas vairākus paraugus, samazinot mainīgumu un uzlabojot reproducējamību. Tas ir īpaši izdevīgi eksperimentos, kuros nepieciešama konsekventa parauga līze, bioplēves atdalīšanās, olbaltumvielu ekstrakcija vai proteolītiskā šķelšana, kur manuālās vai viena parauga metodes ir mazāk efektīvas un pakļautas nekonsekvencei.

Racionalizējiet darbplūsmas, izmantojot vairāku paraugu skanētājus

Piemēram, UIP400MTP ļauj vienlaicīgi apstrādāt mikroplates akas, nodrošinot vienmērīgu biofilmu vai šūnu materiāla atdalīšanu. Tikmēr VialTweeter piedāvā precīzu vairāku cauruļu paraugu līzi un homogenizāciju bez savstarpējas piesārņošanas. Šie ultraskaņas apstrādātāji ievērojami samazina apstrādes laiku, uzlabo eksperimentālo reproducējamību un saglabā augstu paraugu integritāti, padarot tos par neaizstājamiem instrumentiem mikrobioloģijā, proteomikā un molekulārās bioloģijas pētījumos.
Zemāk ir detalizēts protokols, kas ilustrē Hielscher vairāku paraugu ultraskaņas modeļu, VialTweeter Multi-Tube Sonicator un Microplate Sonicator UIP400MTP izmantošanu pētījumā, kurā iesaistīta E. coli bioplēves veidošanās un turpmākā proteomikas analīze.

Protokols: Bioplēves veidošanās, atdalīšanās un proteomiskā analīze, izmantojot Hielscher vairāku paraugu sonikatorus

1. Baktēriju kultūras sagatavošana

• Kultūra E. coli baktērijas (celms W3110) 30°C temperatūrā, kas ir labvēlīga E. coli bioplēves veidošanai, triptona buljona (TB) barotnē, kas satur:
  – 10 g/l triptona
  – 5 g/l NaCl
• Pēc vajadzības papildiniet ar antibiotikām, lai nodrošinātu plazmīdu aizturi.
• Mikroskopijas un promotora aktivitātes pētījumiem izmantojiet W3110 E. coli celmu ar genoma uzlabotu GFP (eGFP) reportieri rplL promotora kontrolē.
• Izmantojiet GFP reportiera plazmīdas dažādiem veicinātājiem (piemēram, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ), lai novērtētu veicinātāju darbības.

2. Bioplēves kultivēšana un atdalīšana

• Sēklas 1,5 ml atšķaidītas baktēriju kultūras vienā iedobē 12 iedobju platē (CellStar 12 iedobju plates, Greiner Bio-One).
• Inkubēt, lai varētu veidoties bioplēve.
• Rūpīgi noņemiet planktonisko (nepiederošo) kultūru.

– Katru iedobi nomazgā ar 500 μL PBS.
– Atvienojiet pievienotās šūnas, apstrādājot 12 iedobju plāksni UIP400MTP mikroplates sonikatorā. UIP400MTP nodrošina vienmērīgu atdalīšanos, nodrošinot konsekventu ultraskaņas enerģiju visās akās.
– Ultraskaņas iestatījumi: 60% amplitūda, cikla režīms: 60 sekundes ON / 30 sek OFF.

3. Šūnu novākšana un līze

• Atdalītās bioplēves šūnas 5 minūtes centrifugē 4 500 g g.
• Mazgāt granulētās šūnas ar fosfātu buferšķīdumu.
• Atkārtoti suspendēt šūnas 100 μl 2% nātrija lauroila sarkosināta (SLS) un inkubēt 95°C temperatūrā 15 minūtes.
• Sonicate, izmantojot VialTweeter Multi-Tube Sonicator, lai nodrošinātu pilnīgu šūnu līzi.
  – Ultraskaņas iestatījumi: 100% amplitūda, 50 s ON / 10 s OFF 10 minūšu kopējais darbības laiks; glabāt paraugus uz ledus.

4. Reducēšana un alkilēšana

• Pievieno 5 mM tris(2-karboksietil)fosfīnu (TCEP), lai samazinātu disulfīdu saites, un inkubē 95°C temperatūrā 15 minūtes.
• Alkilāta olbaltumvielas ar 10 mM jodoacetamīdu 30 minūtes 25°C temperatūrā.

5. Olbaltumvielu kvantitatīvā noteikšana un gremošana

• Centrifūgas lizāti, lai notīrītu gružus.
• Kvantificējiet kopējo olbaltumvielu saturu, izmantojot Pierce BCA proteīnu testa komplektu.
• Kopējo olbaltumvielu 50 μg ar 1 μg tripsīna šķeļ šķīdumā, kas satur 2% SLS un 100 mM amonija bikarbonāta.
• Fermentatīvās hidrolīzes reakciju inkubē pa nakti 30°C temperatūrā.

6. Peptīdu attīrīšana

• Izgulsnē SLS, pievienojot 1,5% trifluoretiķskābi (TFA), pēc tam centrifugē.
• Attīrīt peptīdus, izmantojot C18 microspin kolonnas.
• Izžāvējiet attīrītus peptīdus un atkārtoti saskalojiet 0,1% TFA.

7. Šķidruma hromatogrāfija-masspektrometrija (LC-MS/MS)

• Analizējiet peptīdus Q-Exactive Plus masspektrometrā kopā ar Ultimate 3000 RSLC nano sistēmu.
• Atsevišķus peptīdus, izmantojot apgrieztās fāzes HPLC kolonnu (75 μm × 42 cm), kas pildīta ar C18 sveķiem (2,4 μm).
• Uzklājiet gradientu no 2% līdz 35% šķīdinātāja B (acetonitrils ar 0,15% skudrskābi) 140 minūšu laikā.
• Iegūstiet datus, izmantojot augstas izšķirtspējas MS skenēšanu, kam seko tandēma MS/MS skenēšana ar 10 visintensīvākajiem joniem.

8. Datu analīze

• Apstrādājiet neapstrādātus LC-MS datus, izmantojot Progenesis programmatūru.
• Eksportējiet .mgf failus un analizējiet tos, izmantojot MASCOT.
• Veiciet peptīdu kvantificēšanu, izmantojot SafeQuant kvalitātes kontrolei un viltus atklāšanas pielāgošanai.
• Visus eksperimentus veic divos eksemplāros vai trijos eksemplāros, lai nodrošinātu reproducējamību.

Vairāku paraugu ultraskaņas aparāti augstas caurlaidspējas paraugu sagatavošanai

Vairāku paraugu ultraskaņas modeļi VialTweeter un UIP400MTP ievērojami uzlabo eksperimentālo darbplūsmu precizitāti un efektivitāti, īpaši biofilmu pētījumos un proteomikā. To spēja apstrādāt vairākus paraugus vienmērīgi nodrošina augstu caurlaidspējas jaudu, neapdraudot datu kvalitāti. Šīs priekšrocības apvienojumā ar iepriekš aprakstītajām racionalizētajām darbplūsmām padara Hielscher vairāku paraugu ultraskaņas aparātus par būtiskiem instrumentiem mūsdienu bioloģiskajiem pētījumiem.

Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Kvalitāte ražots Vācijā

Hielscher ultrasonikatori ir labi pazīstami ar saviem augstākajiem kvalitātes un dizaina standartiem. Robustums un viegla darbība ļauj vienmērīgi integrēt mūsu ultrasonikatorus rūpnieciskajās iekārtās. Hielscher ultrasonikatori viegli apstrādā neapstrādātus apstākļus un prasīgu vidi.

Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums un īpašu uzsvaru liek uz augstas veiktspējas ultrasonikatoriem, kas piedāvā vismodernākās tehnoloģijas un lietotājdraudzīgumu. Protams, Hielscher ultrasonikatori atbilst CE prasībām un atbilst UL, CSA un RoHs prasībām.