Ekstracelulārās matrices ekstrakcija ar 96 iedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP

Tradicionālās ekstracelulārās matrices (EM) ekstrakcijas metodes bieži ietver vairākus posmus bioplēves matrices sagraušanai. Tomēr šīs metodes var būt laikietilpīgas un nenodrošināt vienmērīgus rezultātus, tādējādi radot rezultātu mainīgumu. Izmantojot 96 iedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP, EM ekstrakcijas process tiek ievērojami atvieglots, nodrošinot ļoti efektīvu, precīzu un vienmērīgu bioplēves sagraušanu formātos ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu. UIP400MTP izmanto fokusētu ultraskaņu, lai radītu kontrolētu kavitāciju, kas efektīvi sašķeļ bioplēves matrici, vienlaikus saglabājot bioplēvē ietverto šūnu dzīvotspēju un integritāti. UIP400MTP izmantošana uzlabo turpmāko analīžu, piemēram, metabolomikas un proteomikas analīžu, dzīvotspējas testu un pretmikrobu līdzekļu jutības pētījumu, reproducējamību un precizitāti. Vienkāršojot EM ekstrakciju, UIP400MTP ļauj pētniekiem iegūt konsekventus un kvalitatīvus rezultātus, sniedzot padziļinātu izpratni par bioplēvju dinamiku un mijiedarbību ar ārējiem aģentiem.

Ekstracelulārās matrices ekstrakcija

Ekstracelulārā matrice (EM) ir būtiska tādu mikroorganismu kā Candida albicans veidoto bioplēvju sastāvdaļa. EM sastāv no polisaharīdiem, olbaltumvielām, lipīdiem un ekstracelulārās DNS; tā nodrošina strukturālo integritāti, veicina adhēziju pie virsmām un būtiski sekmē rezistenci pret pretmikrobu līdzekļiem. EM ekstrakcija un analīze ir būtiska, lai izprastu bioplēvju bioloģiju, noskaidrotu zāļu rezistences mehānismus un identificētu jaunus terapeitiskos mērķus.

Protokols ekstracelulārās matrices (EM) ekstrakcijai no Candida albicans bioplēvēm, izmantojot UIP400MTP

Šis protokols ir paredzēts ekstracelulārās matrices (EM) ekstrakcijai no statiskām Candida albicans bioplēvēm. Tajā tiek integrēta ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP, lai aizstātu tradicionālos nokasīšanas vai enzīmu izmantošanas posmus un uzlabotu efektivitāti un reproducējamību.

Nepieciešamie materiāli

EM ekstrakcijas norādījumi soli pa solim

1. Statiskas bioplēves veidošana
   Lai iegūtu statiskas bioplēves, inokulējiet C. albicans 96 iedobju plates iedobēs, izmantojot RPMI-1640 barotni. Katrā iedobē jābūt vienādam inokulāta tilpumam (piemēram, 200 µL katrā iedobē).
   Inkubējiet plati 37°C temperatūrā statiskos apstākļos 24 stundas, lai uz iedobju virsmām varētu izveidoties bioplēve.
2. Bioplēves sagatavošana ekstrakcijai
   Pēc inkubācijas uzmanīgi aspirējiet un izmetiet izlietoto barotni no katras iedobes, netraucējot bioplēvi.
   Uzmanīgi izskalojiet katru iedobi ar sterilu PBS (piemēram, 200 µL), lai noņemtu vāji piesaistītās šūnas un planktoniskās atliekas. Atkārtojiet šo darbību divas reizes.
   Katrā iedobē pievienojiet svaigu PBS vai ekstrakcijas buferšķīdumu (piemēram, 200 µL), lai sagatavotu paraugus apstrādei ar ultraskaņu.
3. Apstrāde ar ultraskaņu, izmantojot UIP400MTP
   Ievietojiet 96 iedobju plati, kas satur PBS vai ekstrakcijas buferšķīdumu, UIP400MTP ultraskaņas apstrādes ierīces paplātē. Lai pareizi novietotu daudziedobju plati, ievērojiet lietošanas rokasgrāmatas norādījumus.
   Apstrādājiet ar ultraskaņu 5–6 minūtes saudzīgā režīmā (60% amplitūda, impulsu režīms), nodrošinot vienmērīgu bioplēves struktūras sagraušanu un EM komponentu atbrīvošanu.
   Izmantojiet UIP400MTP ultraskaņas apstrādes ierīces temperatūras kontroli (temperatūras sensoru un iestatījumus), lai izvairītos no pārmērīgas uzkaršanas vai paraugu bojājumiem.
4. Apstrāde ar katjonu apmaiņas sveķiem (CER)
   Pārnesiet ar ultraskaņu apstrādāto šķidrumu no katras iedobes uz jaunu 96 iedobju plati.
   Katrā iedobē pievienojiet divkāršu CER suspensijas tilpumu (suspensiju sagatavo PBS vai buferšķīdumā) (piemēram, kopējais tilpums katrā iedobē ir 400 µL).
   Noslēdziet plati un inkubējiet to uz plašu kratītāja vai rotatora ar ātrumu 400 rpm 3 stundas, lai nodrošinātu EM komponentu saistīšanos un izolēšanu.
5. Atdalīšana un filtrēšana
   Centrifugējiet plati pie 2 000 × g 10 minūtes, lai atdalītu sveķus un šūnas no supernatanta.
   Uzmanīgi pārnesiet EM saturošo supernatantu no katras iedobes uz jaunu 96 iedobju plati.
   Filtrējiet supernatantu caur 0,22 µm filtru, izmantojot platēm paredzētu vakuuma kolektora sistēmu vai līdzvērtīgu sistēmu, lai iegūtu tīru EM ekstraktu.
6. EM analīze
   Lai raksturotu EM komponentus, izmantojiet tādas metodes kā UPLC-Q-TOF-MS nemērķētai metabolītu profilēšanai vai specifiskas analīzes (piemēram, BCA olbaltumvielu noteikšanai, triglicerīdu un ogļhidrātu kvantitatīvās noteikšanas komplektus).

Ekstracelulārās matrices ekstrakcija ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu

Ekstracelulārās matrices (EM) ekstrakcijas augstā efektivitāte, izmantojot ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP, ir radikāli pārveidojusi paraugu sagatavošanu analīzēm, kurās nepieciešama precīza bioplēves īpašību analīze. UIP400MTP izmanto ultraskaņas viļņus, lai precīzi un vienmērīgi sagrautu bioplēves matrici, nodrošinot efektīvu EM komponentu atbrīvošanu, vienlaikus saglabājot šūnu dzīvotspēju un integritāti. Šī pieeja ievērojami uzlabo tādu analīžu uzticamību kā bioplēves dzīvotspējas testi, proteomikas un metabolomikas pētījumi un pretmikrobu līdzekļu jutības novērtējumi.

Bioplēves atgūšanas analīzēs, piemēram, koloniju veidojošo vienību (CFU) skaitīšanā, EM ekstrakcija ar UIP400MTP nodrošina reaģentu netraucētu piekļuvi bioplēvē ietvertajām šūnām. Tāpat proteomikas un metabolomikas analīzēm, piemēram, UPLC-Q-TOF-MS, priekšrocības sniedz olbaltumvielu, lipīdu un metabolītu izolēšana ar augstu iznākumu. UIP400MTP nodrošina arī precīzu jutības testēšanu pret pretmikrobu līdzekļiem, ļaujot precīzi noteikt bioplēves MIC un MBEC vērtības. Turklāt UIP400MTP nodrošinātā efektīvā ekstrakcija palīdz enzīmu aktivitātes analīzēs, komponentu kvantitatīvajā noteikšanā un struktūras pētījumos, sniedzot vērtīgu izpratni par ekstracelulāro matricu lomu bioplēves arhitektūrā, adhēzijā un rezistences mehānismos.

Šī reproducējamā ekstrakcijas metode ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu optimizē EM sagatavošanu, nodrošinot izcilus rezultātus dažādās ar bioplēvēm saistītās analīzēs.