Minimālās inhibējošās koncentrācijas (MIC) pārbaudes protokols

Uz bioplēvi balstītais minimālās inhibējošās koncentrācijas (MIC) tests ir būtiska metode, lai novērtētu antimikrobiālo līdzekļu efektivitāti pret mikroorganismiem, kas saistīti ar bioplēvi un kuriem ir paaugstināta rezistence to aizsargājošās ekstracelulārās matricas dēļ. Būtisks solis šajā testā ir bioplēves struktūru izjaukšana, lai atbrīvotu iegultās šūnas precīzai dzīvotspējas novērtēšanai. UIP400MTP vairāku urbumu plāksnes ultraskaņas apstrādātājs atvieglo šo procesu, izmantojot fokusētu ultraskaņu, lai radītu kontrolētu kavitāciju, efektīvi atdalot bioplēves šūnas un izkliedējot tās vienotā suspensijā. Šis precīzais un reproducējamais bioplēves traucējums uzlabo MIC testu uzticamību un caurlaidspēju, padarot UIP400MTP par būtisku instrumentu bioplēves pētniecības veicināšanā.

Ultraskaņas apstrāde bioplēves atdalīšanai

Uz bioplēvi balstītais MIC tests parasti mēra baktēriju dzīvotspēju vai augšanas inhibīciju, izmantojot tādas metodes kā pārklāšana, koloniju skaitīšana vai optiskā blīvuma mērījumi. Ultraskaņas apstrāde ir kritisks solis uz bioplēvi balstītos MIC testos, novērtējot ar bioplēvi saistīto mikroorganismu antimikrobiālo jutību. Tās primārā funkcija ir atdalīt un izkliedēt bioplēves matricā iestrādātās šūnas vienotā suspensijā precīzai analīzei.
Bioplēves ir ievērojami izturīgākas pret pretmikrobu līdzekļiem, salīdzinot ar planktona šūnām, tāpēc precīzai analīzei ir ļoti svarīga pareiza atdalīšanās. Šī procesa laikā ultraskaņas viļņi rada kontrolētu kavitāciju, sadalot bioplēves matricu un atbrīvojot iegultās šūnas vienotā suspensijā reģenerācijas vidē. Šis solis ļauj precīzi novērtēt bioplēvē disperģēto šūnu dzīvotspēju, izmantojot tādas metodes kā uzsēšana, atšķaidīšana un koloniju skaitīšana. Pareizi bioplēves traucējumi, izmantojot ultraskaņu, novērš atlikušo matricas komponentu ekranēšanu no šūnu ekranēšanas, kas citādi varētu izraisīt antimikrobiālās aktivitātes nepietiekamu novērtēšanu. Vairāku urbumu plates ultraskaņas UIP400MTP ir īpaši piemērots šim nolūkam, piedāvājot precīzus un reproducējamus ultraskaņas apstākļus, lai nodrošinātu uzticamu un augstas caurlaidspējas pārbaudes plākšņu sagatavošanu.

Kāpēc ultraskaņas apstrāde ir nepieciešama uz bioplēvēm balstītos minimālās inhibīcijas koncentrācijas testos

Dzīvotspējas mērījumiem un šūnu skaitīšanai ir nepieciešama pilnīga un uzticama atsevišķu šūnu atdalīšanās un izkliede. UIP400MTP veicina vienmērīgu, nekaitīgu bioplēves atslāņošanos un šūnu dispersiju, lai iegūtu stabilus testa rezultātus.

• Bioplēves sarežģītība: Bioplēves ir strukturētas mikrobu kopienas, kas ietvertas ekstracelulārās polimēru vielas (EPS) matricā, kas aizsargā mikroorganismus un padara tos izturīgākus pret antimikrobiāliem līdzekļiem.
• Vienmērīga dispersija: Lai precīzi izmērītu bioplēvē iegulto šūnu dzīvotspēju vai to jutību pret pretmikrobu līdzekļiem, bioplēve vispirms jāizjauc un jāsadala viendabīgā suspensijā.

Uz bioplēvi balstīts minimālās inhibējošās koncentrācijas pārbaudes protokols

Minimālās inhibējošās koncentrācijas (MIC) tests nosaka zemāko pretmikrobu līdzekļa koncentrāciju, kas nepieciešama, lai kavētu mikroorganismu redzamo augšanu. Šis protokols ir paredzēts ar bioplēvi saistītiem mikroorganismiem, izmantojot UIP400MTP vairāku urbumu plates ultraskaņu bioplēves traucējumiem.

1. solis: Baktēriju sējmateriāla sagatavošana

1. Sagatavojiet baktēriju suspensiju:
   Audzējiet baktērijas atbilstošā vidē līdz logaritmiskajai fāzei.
   Kultūru atšķaida, lai sasniegtu standartizētu šūnu blīvumu (piemēram, 0,5 McFarland standarts vai OD600 ~ 0,1).
2. Sagatavojiet pretmikrobu šķīdumus:
   Pretmikrobu līdzekli atšķaida piemērotā vidē, lai izveidotu koncentrāciju diapazonu (piemēram, divkāršus sērijveida atšķaidījumus).
3. Iedodiet 96well platē:
   Pievieno antimikrobiālos šķīdumus standarta 96 iedobju plates iedobēs ar gala urbuma tilpumu ~150–200 μL.
   Ietver augšanas kontroli (bez antimikrobiāliem līdzekļiem) un sterilitātes kontroli (bez baktēriju sējmateriāla).

2. solis: bioplēves veidošanās uz tapas vāka

• Pievienojiet tapas vāku:
  Novietojiet specializēto tapas vāku uz inokulētajām akām, nodrošinot, ka tapas ir pilnībā iegremdētas baktēriju suspensijā.
• Inkubē plati:
  Inkubē piemērotā temperatūrā (piemēram, 37°C) noteiktu laiku (piemēram, 24 stundas) statiskos apstākļos, lai uz tapām veidotos bioplēve.

3. darbība: pretmikrobu iedarbība

• Izskalojiet tapas:
  Noņemiet baktērijas suspensijas tapas vāciņu un viegli noskalojiet sterilā fizioloģiskajā šķīdumā vai fosfāta buferšķīdumā, lai atdalītu brīvi pielipušās planktona šūnas.
• Pakļaujiet pretmikrobu līdzekļu iedarbībai:
  Pārliek tapas vāciņu jaunā 96well platē, kurā ir iepriekš sagatavoti pretmikrobu atšķaidījumi.
  Inkubē noteiktu laika posmu (piemēram, 24 stundas) statiskos apstākļos, lai pretmikrobu līdzeklis varētu iedarboties uz bioplēvēm.

4. solis: ultraskaņas apstrāde ar Sonicator mikroplati UIP400MTP

Ultraskaņas apstrādes solis ir kritisks, lai atdalītu bioplēves no tapu vākiem, lai novērtētu dzīvotspēju. Izpildiet šīs darbības, lai iegūtu UIP400MTP sonikatoru:

1. Sagatavojiet iestatījumus:
   Katrā iedobē iepildiet svaigu 96 iedobju plati ar reģenerācijas vidi (piemēram, neitralizējošu buljonu vai sterilu augšanas vidi).
2. Pārsūtiet tapas vāku:
   Noņemiet tapas vāciņu no pretmikrobu apstrādes plāksnes.
   Izskalojiet tapas vāciņu sterilā fizioloģiskajā šķīdumā vai PBS, lai noņemtu pretmikrobu līdzekļu atlikumus.
3. Novietojiet plāksni ultraskaņas katorā:
   Pievienojiet tapas vāku reģenerācijas vides platei.
   Ievietojiet reģenerācijas līdzekļa plāksni UIP400MTP sonikatorā, nodrošinot, ka plāksne atrodas centrēta un stabila, kā aprakstīts aprakstītajā rokasgrāmatā.
4. Pielāgojiet ultraskaņas apstrādes parametrus:
   Iestatiet ultraskaņas apstrādes parametrus UIP400MTP (iestatījumus var pielāgot biofilmai):
   Amplitūda: 70–100%.
   Ultraskaņas apstrādes laiks: 1–3 minūtes (pielāgojiet, pamatojoties uz bioplēves struktūru) cikla režīmā.
5. Sonicate:
   Sāciet ultraskaņas procesu. Ultraskaņas viļņi izjauks bioplēves matricu un novirzīs šūnas atveseļošanās vidē.
6. Pārraugiet procesu:
   Izmantojiet pievienojamu temperatūras sensoru, lai uzraudzītu parauga temperatūru iedobēs. UIP400MTP var savienot ar laboratorijas dzesētāju dzesēšanai.
7. Apstrāde pēc ultraskaņas apstrādes:
   Reģenerācijas vidi, kas satur atdalītas bioplēves, nekavējoties pārnes uz svaigu sterilu plati turpmākai analīzei.

A) plate, kas satur TSB ar 2% glikozi, ko izmanto bioplēves veidošanai, šūnu reģenerācijai un MIC un MBEC noteikšanai; B) Vāks ar tapām stafilokoku biofilmu veidošanai.
Bioplēves šūnas, kas veidojas uz tapām, tika atdalītas ar ultraskaņu (Hielscher Ultraskaņas tehnoloģija) 5 min 96 iedobju plāksnēs, kas satur svaigu kultūras barotni šūnu atgūšanai.
(Attēls un pētījums: ©de Oliveira et al., 2016)

4. darbība: dzīvotspējas novērtējums

Plātņu un kultūru atdalītas bioplēves:

1. Veic reģenerācijas vides un plates sērijveida atšķaidīšanu uz agara, lai uzskaitītu koloniju veidojošās vienības (KVV).
2. Novērtējiet MIC:
   Noteikt MIC kā zemāko antimikrobiālo koncentrāciju, kas pilnībā kavē redzamo mikrobu augšanu reģenerācijas vidē.

MIC minimālā inhibējošā koncentrācija: mikrotitrēšanas plates piemērs un mikrodilucijas rezultātu interpretācija.
(Pētījums un attēls: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Kvalitāte ražots Vācijā

Hielscher ultrasonikatori ir labi pazīstami ar saviem augstākajiem kvalitātes un dizaina standartiem. Robustums un viegla darbība ļauj vienmērīgi integrēt mūsu ultrasonikatorus rūpnieciskajās iekārtās. Hielscher ultraskaņas apstrādātāji viegli apstrādā neapstrādātus apstākļus un prasīgu vidi.

Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums un īpašu uzsvaru liek uz augstas veiktspējas ultrasonikatoriem, kas piedāvā vismodernākās tehnoloģijas un lietotājdraudzīgumu. Protams, Hielscher ultrasonikatori atbilst CE prasībām un atbilst UL, CSA un RoHs prasībām.

Lasiet šeit, kā UIP400MTP tiek izmantots bioplēves atdalīšanai ASTM E2799 protokolā – Dezinfekcijas līdzekļa efektivitātes pārbaude pret Pseudomonas aeruginosa bioplēvi, izmantojot MBEC testu.