Minimālās inhibējošās koncentrācijas (MIC) noteikšanas protokols

Uz bioplēvēm balstīts minimālās inhibējošās koncentrācijas (MIC) tests ir būtiska metode, lai novērtētu pretmikrobu līdzekļu efektivitāti pret ar bioplēvēm saistītiem mikroorganismiem, kuru paaugstināto rezistenci nodrošina aizsargājošā ārpusšūnu matrica. Būtisks šī testa posms ir bioplēves struktūru atdalīšana, lai atbrīvotu tajās ieslēgtās šūnas precīzai dzīvotspējas novērtēšanai. Daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP atvieglo šo procesu, izmantojot fokusētu ultraskaņu kontrolētas kavitācijas radīšanai, efektīvi atdalot bioplēves šūnas un izkliedējot tās viendabīgā suspensijā. Šī precīzā un reproducējamā bioplēves sagraušana uzlabo MIC testu uzticamību un paraugu apstrādes ražīgumu, padarot UIP400MTP par būtisku instrumentu bioplēvju pētniecības attīstībā.

Kāpēc MIC testos izmantot apstrādi ar ultraskaņu?

• Precīzi, reproducējami dati: Iegūstiet viendabīgas šūnu suspensijas, kurās ir novērsta matricas aizsargājošā iedarbība, nodrošinot, ka koloniju skaitīšanas rezultāti un optiskā blīvuma rādījumi patiesi atspoguļo pretmikrobu iedarbības efektivitāti.
• Efektivitāte ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu: Apstrādājiet visu 96 iedobju plati vienlaikus tikai 1–3 minūtēs, aizstājot lēnu manuālu nokasīšanu, kas dod nevienmērīgus rezultātus, ar optimizētu darbplūsmu.
• Saglabāta šūnu dzīvotspēja: Saudzīgi atdaliet bioplēvē ieslēgtās šūnas, neradot nokasīšanai raksturīgos fiziskos bojājumus un saglabājot augstāku šūnu izdzīvotību uzticamiem MIC/MBEC aprēķiniem.
• Nekāds savstarpējas kontaminācijas risks: Izmantojiet bezkontakta kausveida ultraskaņas pārveidotāja konstrukcijas priekšrocības, kas nodrošina vienmērīgu visu iedobju apstrādi, zondēm nepieskaroties atsevišķiem paraugiem vai iedobēm.
• Atbilstība standartu prasībām: Saskaņojiet savu metodiku ar validētiem nozares protokoliem, piemēram, ASTM E2799-22, palielinot savu datu ticamību normatīvās atbilstības vai publicēšanas vajadzībām.
• Uzticams zāļu un ārstēšanas metožu skrīnings: Paļaujieties uz saviem jutības noteikšanas rezultātiem, lai pieņemtu pārdomātākus lēmumus par pretmikrobu iedarbības efektivitāti, rezistences profila noteikšanu vai terapijas izstrādi.

Apstrāde ar ultraskaņu bioplēves atdalīšanai

Uz bioplēvēm balstītā MIC testā parasti nosaka baktēriju dzīvotspēju vai augšanas inhibīciju, izmantojot tādas metodes kā uzsēšana uz barotnes, koloniju skaitīšana vai optiskā blīvuma mērījumi. Apstrāde ar ultraskaņu ir būtisks posms uz bioplēvēm balstītos MIC testos, kuros novērtē ar bioplēvēm saistītu mikroorganismu jutību pret pretmikrobu līdzekļiem. Tās galvenā funkcija ir atdalīt bioplēves matricā ieslēgtās šūnas un izkliedēt tās viendabīgā suspensijā precīzai analīzei.
Bioplēves ir ievērojami rezistentākas pret pretmikrobu līdzekļiem nekā planktoniskās šūnas, tāpēc pareiza atdalīšana ir būtiska precīzai analīzei. Šajā procesā ultraskaņas viļņi rada kontrolētu kavitāciju, sagraujot bioplēves matricu un atbrīvojot tajā ieslēgtās šūnas, kas atgūšanas barotnē veido viendabīgu suspensiju. Šis posms ļauj precīzi novērtēt no bioplēves izkliedēto šūnu dzīvotspēju, izmantojot tādas metodes kā uzsēšana uz barotnes, atšķaidīšana un koloniju skaitīšana. Pareiza bioplēves sagraušana ar ultraskaņu neļauj atlikušajiem matricas komponentiem aizsargāt šūnas, jo šāda aizsardzība citādi varētu izraisīt pretmikrobu aktivitātes novērtēšanu par zemu. Daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP ir īpaši piemērota šim nolūkam, jo tā nodrošina precīzus un reproducējamus ultraskaņas apstrādes apstākļus, garantējot uzticamu testa plašu sagatavošanu ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu.

Kāpēc apstrāde ar ultraskaņu ir nepieciešama uz bioplēvēm balstītos minimālās inhibējošās koncentrācijas testos

Dzīvotspējas mērījumiem un šūnu skaitīšanai nepieciešama pilnīga un uzticama atsevišķu šūnu atdalīšana un izkliedēšana. UIP400MTP veicina vienmērīgu bioplēves atdalīšanu un šūnu izkliedēšanu, neradot bojājumus, lai iegūtu uzticamus testa rezultātus.

• Bioplēves sarežģītība: Bioplēves ir strukturētas mikroorganismu kopienas, ko ietver ārpusšūnu polimērvielu (EPS) matrica, kas aizsargā mikroorganismus un padara tos izturīgākus pret pretmikrobu līdzekļiem.
• Vienmērīga disperģēšana: Lai precīzi noteiktu bioplēvē ieslēgto šūnu dzīvotspēju vai to jutību pret pretmikrobu līdzekļiem, bioplēve vispirms jāatdala un jāsadala, iegūstot homogēnu suspensiju.

Uz bioplēvi balstītas minimālās inhibējošās koncentrācijas analīzes protokols

Minimālās inhibējošās koncentrācijas (MIC) analīzē nosaka zemāko pretmikrobu līdzekļa koncentrāciju, kas nepieciešama, lai inhibētu redzamu mikroorganismu augšanu. Šis protokols ir paredzēts ar bioplēvi saistītiem mikroorganismiem, bioplēves izjaukšanai izmantojot daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP.

1. solis: baktēriju inokulāta sagatavošana

1. Sagatavojiet baktēriju suspensiju:
   Audzējiet baktērijas piemērotās barotnēs līdz logaritmiskās augšanas fāzes vidum.
   Atšķaidiet kultūru, lai sasniegtu standartizētu šūnu blīvumu (piemēram, 0,5 pēc Makfārlenda standarta vai OD600 ~0,1).
2. Sagatavojiet pretmikrobu līdzekļu šķīdumus:
   Atšķaidiet pretmikrobu līdzekli piemērotā barotnē, lai iegūtu dažādas koncentrācijas (piemēram, veicot secīgus divkāršus atšķaidījumus).
3. Iepildiet 96 iedobju platē:
   Iepildiet pretmikrobu līdzekļu šķīdumus standarta 96 iedobju plates iedobēs tā, lai galīgais tilpums katrā iedobē būtu ~150–200 µL.
   Iekļaujiet augšanas kontroles paraugus (bez pretmikrobu līdzekļa) un sterilitātes kontroles paraugus (bez baktēriju inokulāta).

2. solis: bioplēves veidošanās uz vāka ar tapām

• Uzlieciet vāku ar tapām:
  Uzlieciet specializēto vāku ar tapām uz inokulētajām iedobēm, nodrošinot, ka tapas ir pilnībā iegremdētas baktēriju suspensijā.
• Inkubējiet plati:
  Inkubējiet piemērotā temperatūrā (piemēram, 37°C) noteiktu laiku (piemēram, 24 stundas) statiskos apstākļos, lai uz tapām varētu veidoties bioplēve.

3. solis: pretmikrobu līdzekļu iedarbība

• Noskalojiet tapas:
  Izņemiet vāku ar tapām no baktēriju suspensijas un saudzīgi noskalojiet sterilā fizioloģiskajā šķīdumā vai PBS, lai noņemtu vāji piesaistītās planktoniskās šūnas.
• Pakļaujiet pretmikrobu līdzekļu iedarbībai:
  Pārvietojiet vāku ar tapām uz jaunu 96 iedobju plati, kurā ir iepriekš sagatavotie pretmikrobu līdzekļu atšķaidījumi.
  Inkubējiet noteiktu laiku (piemēram, 24 stundas) statiskos apstākļos, lai pretmikrobu līdzeklis varētu iedarboties uz bioplēvēm.

4. solis: apstrāde ar ultraskaņu, izmantojot mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP

Apstrāde ar ultraskaņu ir būtisks solis bioplēvju atdalīšanai no vākiem ar tapām, lai novērtētu dzīvotspēju. Izmantojot ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP, veiciet šādas darbības:

1. Sagatavojiet aprīkojumu:
   Katrā jaunas 96 iedobju plates iedobē iepildiet šūnu atgūšanas barotni (piemēram, neitralizējošu buljonu vai sterilu augšanas barotni).
2. Pārvietojiet vāku ar tapām:
   Noņemiet vāku ar tapām no plates, kurā veikta apstrāde ar pretmikrobu līdzekli.
   Noskalojiet vāku ar tapām sterilā fizioloģiskajā šķīdumā vai PBS, lai noņemtu pretmikrobu līdzekļu atliekas.
3. Ievietojiet plati ultraskaņas apstrādes ierīcē:
   Uzlieciet vāku ar tapām uz plates ar šūnu atgūšanas barotni.
   Ievietojiet plati ar šūnu atgūšanas barotni ultraskaņas apstrādes ierīcē UIP400MTP, nodrošinot, ka plate ir novietota centrā un stabili, kā aprakstīts rokasgrāmatā.
4. Pielāgojiet ultraskaņas apstrādes parametrus:
   Iestatiet UIP400MTP ultraskaņas apstrādes parametrus (iestatījumus var pielāgot bioplēvei):
   Amplitūda: 70–100%.
   Ultraskaņas apstrādes laiks: 1–3 minūtes (pielāgojiet atbilstoši bioplēves struktūrai) cikliskajā režīmā.
5. Apstrādājiet ar ultraskaņu:
   Sāciet apstrādi ar ultraskaņu. Ultraskaņas viļņi izjauks bioplēves matricu un atdalīs šūnas, izdalot tās šūnu atgūšanas barotnē.
6. Uzraugiet procesu:
   Izmantojiet pieslēdzamo temperatūras sensoru, lai uzraudzītu paraugu temperatūru iedobēs. Dzesēšanai UIP400MTP var savienot ar laboratorijas dzesētāju.
7. Darbības pēc apstrādes ar ultraskaņu:
   Nekavējoties pārnesiet šūnu atgūšanas barotni, kurā ir atdalītās bioplēves, uz jaunu sterilu plati turpmākai analīzei.

(A) Plate ar TSB, kas satur 2% glikozes un ko izmanto bioplēves veidošanai, šūnu atgūšanai un MIC un MBEC noteikšanai; (B) vāks ar tapām stafilokoku bioplēvju veidošanai.
Uz tapām izveidojušās bioplēves šūnas tika atdalītas, 5 min apstrādājot ar ultraskaņu (Hielscher Ultrasound Technology) 96 iedobju platēs, kas saturēja svaigu kultivēšanas barotni šūnu atgūšanai.
(Attēls un pētījums: ©de Oliveira et al., 2016)

4. solis: dzīvotspējas novērtēšana

Izsējiet un kultivējiet atdalītās bioplēves:

1. Veiciet šūnu atgūšanas barotnes sērijveida atšķaidīšanu un izsējiet uz agara, lai noteiktu kolonijas veidojošo vienību (CFU) skaitu.
2. Novērtējiet MIC:
   Nosakiet MIC kā zemāko antimikrobiālā līdzekļa koncentrāciju, kas pilnībā kavē redzamu mikroorganismu augšanu šūnu atgūšanas barotnē.

MIC – minimālā inhibējošā koncentrācija: mikrotitrēšanas plates piemērs un mikroatšķaidīšanas rezultātu interpretācija.
(Pētījums un attēls: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Kam apstrāde ar ultraskaņu sniedz ieguvumus MIC testos?

• Medicīnisko ierīču ražotājiem: Lai pārbaudītu virsmu pārklājumu efektivitāti un validētu tīrīšanas protokolus ierīcēm, uz kurām mēdz veidoties bioplēves.
• Klīniskajiem mikrobiologiem: Lai precīzi diagnosticētu ar implantiem saistītas infekcijas (piemēram, PJI), atgūstot baktērijas no medicīniskajiem implantiem.
• Farmaceitisko preparātu izstrādātājiem: Lai novērtētu jaunu antimikrobiālo līdzekļu efektivitāti pret izturīgiem, bioplēvē ieslēgtiem patogēniem.
• Akadēmiskajiem pētniekiem: Lai veiktu reproducējamus pētījumus ar lielu paraugu apstrādes ražīgumu par bioplēvju bioloģiju un antimikrobiālās rezistences mehānismiem.
• Rūpnieciskās kvalitātes kontroles komandām: Lai novērtētu bioloģisko apaugumu un dezinfekcijas līdzekļu efektivitāti rūpnieciskā vidē (piemēram, izmantojot ASTM E2799-22 standartus).

Projektēšana, ražošana un konsultācijas – Vācijā radīta kvalitāte

Hielscher ultraskaņas iekārtas ir labi pazīstamas ar visaugstākajiem kvalitātes un projektēšanas standartiem. Izturība un vienkārša lietošana ļauj mūsu ultraskaņas iekārtas viegli integrēt rūpnieciskajās ražotnēs. Hielscher ultraskaņas iekārtas viegli tiek galā ar skarbiem apstākļiem un prasīgu darba vidi.

Hielscher Ultrasonics ir ISO sertificēts uzņēmums, kas īpašu uzmanību pievērš augstas veiktspējas ultraskaņas iekārtām ar vismodernākajām tehnoloģijām un ērtu lietošanu. Protams, Hielscher ultraskaņas iekārtas atbilst CE prasībām un izpilda UL, CSA un RoHs prasības.

Lasiet šeit, kā UIP400MTP izmanto bioplēves atdalīšanai ASTM E2799 protokolā – dezinfekcijas līdzekļu efektivitātes pārbaudē pret Pseudomonas aeruginosa bioplēvi, izmantojot MBEC testu.