Staphylococcus bioplēves audzēšanas un atdalīšanas protokols

Standartizētas metodes ir būtiskas ticamiem pētījumu rezultātiem. Šeit jūs varat atrast stafilokoku biofilmu audzēšanas un atdalīšanas protokolu. Šis protokols koncentrējas uz racionalizētu augstas caurlaidspējas paraugu sagatavošanu UIP400MTP izmantojot vairāku urbumu plākšņu ultraskaņu efektīvai, augstas caurlaidspējas bioplēves atdalīšanai 96 urbumu plāksnēs. Protokols ietver arī galvenos soļus bioplēves audzēšanai, mazgāšanai un vizualizācijai, koncentrējoties uz mainīguma samazināšanu un reproducējamības nodrošināšanu.

Staphylococcus bioplēves un antibiotiku izpēte

Staphylococcus biofilmām ir izšķiroša loma pastāvīgās infekcijās, jo tās ir izturīgas pret antibiotikām un imūnreakcijām. Bioplēves veidošanās nodrošina aizsargājošu vidi baktērijām, padarot infekcijas grūti ārstējamas. Biofilmu pētījumi bieži koncentrējas uz izpratni par to veidošanos, uzvedību un jutību pret antimikrobiālajiem līdzekļiem, uzsvaru liekot uz augstas caurlaidspējas metodēm, lai racionalizētu eksperimentālās darbplūsmas.
UIP400MTP vairāku urbumu plākšņu sonikators piedāvā ievērojamas priekšrocības bioplēves pētniecībā, ļaujot ātri un efektīvi atdalīt bioplēves no 96 urbumu plāksnēm. Šī ierīce nodrošina vienmērīgu ultraskaņas enerģiju visām akām, nodrošinot konsekventus rezultātus, vienlaikus samazinot mainīgumu.

Staphylococcus bioplēves kultivēšanas un atdalīšanas protokols

Zemāk mēs sniedzam jums soli pa solim norādījumus par stafilokoku bioplēves kultivēšanas un atdalīšanas procesu. Kā paraugu analītiskajam solim mēs parādīsim, kā spektrofotometriski kvantificēt kultivēto biomasu ar kristālvioletu krāsošanu.

Staphylococcus bioplēves audzēšana

Nepieciešamie materiāli:

• Sterilas plakandibena 96 iedobju polistirola audu kultūras apstrādātas mikrotitrēšanas plates ar vākiem
• Triptiskais sojas buljons (TSB) ar 0,25% glikozes
• Bioloģiskās drošības kabinets

Darbības:

1. Sagatavojiet sterilu darba vidi bioloģiskās drošības skapī, lai samazinātu piesārņojumu.
2. Pievienojiet TSB, kas satur 0,25% glikozes, mikrotitrēšanas plates iedobēm. TSB bez glikozes parasti neatbalsta bioplēves veidošanos, un to drīkst izmantot tikai kā kontroli, ja nepieciešams.
3. Iedobes apsēj ar baktēriju celmiem, kas sagatavoti, kā aprakstīts turpmāk:
4. Sagatavojiet baktēriju suspensijas, nodrošinot, ka nav iepriekš esošu šūnu klasteru, homogenizējot suspensijas, izmantojot ultraskaņu, vai sadalot klasterus ar 23 gabarītu adatu un īsu virpuļošanu.
5. Noslēdz plati ar vāku un inkubē apstākļos, kas ir optimāli bioplēves veidošanai (piemēram, 37°C 24 stundas).
6. Katram baktēriju celmam eksperimentu veic trijos eksemplāros (trīs iedobes katram celmam), lai nodrošinātu ticamību.
7. Katrai platei iedala sešas iedobes negatīvajām kontrolēm. Uz 96 iedobju plāksnēm var pārbaudīt līdz 30 celmiem.

Bioplēves vizualizācija un mazgāšana

1. Pēc inkubācijas uzmanīgi izmetiet barotni, lai izvairītos no bioplēves traucējumiem.
2. Katru iedobi četras reizes nomazgājiet ar fizioloģisko šķīdumu, lai noņemtu planktona baktērijas.
3. Pārbaudiet, vai iedobju dibenā nav baltu plankumu, kas norāda uz bioplēves klātbūtni.

Bioplēves atdalīšanās, izmantojot vairāku urbumu plāksnes Sonicator UIP400MTP

Ierīces iestatīšana un parametri:

• UIP400MTP vairāku urbumu plāksnes sonikators
• Darbības iestatījumi: 60% amplitūda, cikla režīms ar 60 sekunžu ieslēgšanu / 30 sekunžu izslēgšanu

Darbības:

1. Novietojiet mazgāto mikrotitrēšanas plati uz UIP400MTP platformas.
2. Ultraskaņas paraugus sonicate ieteicamajos iestatījumos (60% amplitūda, 60 sekundes IESLĒGTS, 30 sekundes IZSLĒGTS). Pielāgojiet iestatījumus baktēriju celmam.
3. Sāciet ultraskaņas procesu, lai atdalītu bioplēvi. Ultraskaņas viļņi traucē bioplēves matricu, atbrīvojot pielipušās baktērijas.
4. UIP400MTP nodrošina vienmērīgu ekspozīciju visās iedobēs, lai iegūtu konsekventus atdalīšanās rezultātus.

Analītiskais posms: atdalītas Stafilokoku bioplēves biomasas kvantificēšana, izmantojot kristālvioleto (CV)

Nepieciešamie materiāli:

• 0.1% kristālvioletais (CV) šķīdums
• 95% etanols vai 30% etiķskābe (šķīdināšanai)
• Mikroplates lasītājs, kas spēj nolasīt pie 570 nm
• Sterilas mikrotitrēšanas plāksnes krāsošanai

Darbības:

1. Krāsošanas plāksnes sagatavošana: Pārnesiet 100 μL atdalītās bioplēves suspensijas no katras sonikētās plāksnes iedobes atbilstošās tīras, sterilas 96 iedobju mikrotitrēšanas plāksnes iedobēs. Tas nodrošina skaidru un vienmērīgu vidi krāsošanai.
2. Atdalītās bioplēves iekrāsošana: katrai iedobei, kurā ir atdalītā bioplēves suspensija, pievieno 150 μl 0,1% kristālvioletā šķīduma. Viegli pipetē, lai nodrošinātu vienmērīgu bioplēves suspensijas un kristālvioletā sajaukšanos.
3. Inkubācija: ļauj platei inkubēties istabas temperatūrā 15 minūtes, lai kristālvioletais varētu efektīvi iekrāsot biomasu.
4. Mazgāšana: Pēc inkubācijas uzmanīgi izmetiet kristālvioleto šķīdumu no akām, netraucējot biomasu. Katru iedobi trīs reizes nomazgājiet ar sterilu fizioloģisko šķīdumu, lai noņemtu nesaistīto traipu.
5. Žāvēšana: Ļaujiet plāksnei nožūt istabas temperatūrā vai zem sterila gaisa plūsmas pārsega. Izvairieties no karsēšanas, jo tas var mainīt rezultātus.
6. Šķīdināšana: katrai iedobei pievieno 200 μL 95% etanola (vai 30% etiķskābes, atkarībā no laboratorijas standarta prakses), lai izšķīdinātu saistīto kristālvioleto. Viegli samaisa, pipetējot vai kratot plati 10 minūtes istabas temperatūrā.
7. Mērīšana: izmēra izšķīdušā kristālvioletā šķīduma optisko blīvumu (OB) pie 570 nm, izmantojot mikroplates lasītāju.
8. Datu analīze: no eksperimentālajiem iedobēm atņem negatīvo kontroļu vidējo OD570 vērtību (iedobes ar TSB, bet bez baktēriju sējmateriāla), lai ņemtu vērā fona iekrāsošanos. Ierakstiet un analizējiet datus.

Piezīme: katram stāvoklim eksperimentu veic trijos eksemplāros, lai nodrošinātu reproducējamību. Nodrošiniet pareizu rīcību ar kristālvioleto un etanolu, ievērojot drošības un iznīcināšanas protokolus.
 

Galvenie UIP400MTP ieguvumi īsumā:

• Augstas caurlaidspējas apstrāde: Īpaši izstrādāts vairāku urbumu plāksnēm, ļaujot vienlaikus apstrādāt vairākus paraugus.
• Vienots ultraskaņas sadalījums: Nodrošina vienādu ultraskaņas intensitāti visās akās, nodrošinot konsekventus rezultātus visos paraugos.
• Izmantojiet jebkuru standarta plāksni: UIP400MTP var apstrādāt jebkuras standarta vairāku urbumu plāksnes, Petri traukus un cauruļu plauktus. Nav nepieciešamas dārgas patentētas plāksnes!
• Lietotājam draudzīgs interfeiss: Viegli uzstādīt un kontrolēt, padarot to par lielisku rīku laboratorijas produktivitātes palielināšanai. Programmējami iestatījumi un automatizācija atvieglo procesu standartizāciju!