Staphylococcus bioplēves kultivēšanas un atdalīšanas protokols

Standartizētas metodes ir būtiskas uzticamu pētījumu rezultātu iegūšanai. Šeit pieejams stafilokoku bioplēvju kultivēšanas un atdalīšanas protokols. Šajā protokolā galvenā uzmanība pievērsta efektīvai paraugu sagatavošanai ar augstu paraugu caurlaidspēju, izmantojot daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP efektīvai bioplēvju atdalīšanai 96 iedobju platēs ar augstu paraugu caurlaidspēju. Protokolā ietverti arī galvenie bioplēvju kultivēšanas, mazgāšanas un vizualizācijas posmi, īpašu uzmanību pievēršot mainīguma samazināšanai un reproducējamības nodrošināšanai.

Staphylococcus bioplēvju un antibiotiku izpēte

Staphylococcus bioplēvēm ir būtiska nozīme persistējošu infekciju gadījumā, jo tās ir izturīgas pret antibiotikām un imūnās sistēmas reakcijām. Bioplēves veidošanās nodrošina baktērijām aizsargājošu vidi, apgrūtinot infekciju ārstēšanu. Bioplēvju pētījumos bieži uzmanība tiek pievērsta to veidošanās, uzvedības un jutības pret pretmikrobu līdzekļiem izpratnei, īpaši uzsverot metodes ar augstu paraugu caurlaidspēju, lai racionalizētu eksperimentu darbplūsmas.
Daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP sniedz būtisku priekšrocību bioplēvju izpētē, nodrošinot ātru un efektīvu bioplēvju atdalīšanu no 96 iedobju platēm. Šī ierīce nodrošina vienmērīgu ultraskaņas enerģijas padevi visām iedobēm, tādējādi nodrošinot konsekventus rezultātus un samazinot mainīgumu.

Staphylococcus bioplēves kultivēšanas un atdalīšanas protokols

Tālāk sniegti detalizēti norādījumi par Staphylococcus bioplēves kultivēšanas un atdalīšanas procesu. Kā analītiskā posma piemēru parādām, kā spektrofotometriski noteikt izaudzētās biomasas daudzumu, izmantojot krāsošanu ar kristālvioleto.

Staphylococcus bioplēves kultivēšana

Nepieciešamie materiāli:

• Sterilas polistirola mikrotitrēšanas plates ar plakanu dibenu, 96 iedobēm un vākiem, kuru virsma apstrādāta audu kultivēšanai
• Triptona sojas buljons (TSB) ar 0,25% glikozes
• Bioloģiskās drošības skapis

Darbības:

1. Sagatavojiet sterilu darba vidi bioloģiskās drošības skapī, lai samazinātu piesārņojuma risku.
2. Iepildiet mikrotitrēšanas plates iedobēs TSB, kas satur 0,25% glikozes. TSB bez glikozes parasti neveicina bioplēves veidošanos, un nepieciešamības gadījumā tas jāizmanto tikai kā kontrole.
3. Inokulējiet iedobes ar baktēriju celmiem, kas sagatavoti, kā aprakstīts tālāk:
4. Sagatavojiet baktēriju suspensijas, nodrošinot, ka tajās nav jau izveidojušos šūnu sakopojumu; šim nolūkam homogenizējiet suspensijas ar ultraskaņu vai izjauciet sakopojumus ar 23. kalibra adatu un īslaicīgu maisīšanu virpuļmaisītājā.
5. Noslēdziet plati ar tās vāku un inkubējiet bioplēves veidošanai optimālos apstākļos (piemēram, 37°C temperatūrā 24 stundas).
6. Veiciet eksperimentu trijos atkārtojumos katram baktēriju celmam (trīs iedobes katram celmam), lai nodrošinātu rezultātu ticamību.
7. Katrā platē atvēliet sešas iedobes negatīvajām kontrolēm. Vienā 96 iedobju platē var pārbaudīt līdz 30 celmiem.

Bioplēves vizualizācija un mazgāšana

1. Pēc inkubācijas uzmanīgi izlejiet barotni, lai neizjauktu bioplēvi.
2. Izmazgājiet katru iedobi četras reizes ar fizioloģisko šķīdumu, lai noņemtu planktoniskās baktērijas.
3. Pārbaudiet, vai iedobju dibenā nav baltu plankumu, kas norāda uz bioplēves klātbūtni.

Bioplēves atdalīšana, izmantojot daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP

Ierīces iestatīšana un parametri:

• Daudziedobju plašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP
• Darbības iestatījumi: 60% amplitūda, ciklisks režīms ar 60 sekundēm IESLĒGTS / 30 sekundēm IZSLĒGTS

Darbības:

1. Novietojiet izmazgāto mikrotitrēšanas plati uz UIP400MTP platformas.
2. Apstrādājiet paraugus ar ultraskaņu, izmantojot ieteiktos iestatījumus (60% amplitūda, 60 sekundes IESLĒGTS, 30 sekundes IZSLĒGTS). Pielāgojiet iestatījumus baktēriju celmam.
3. Sāciet apstrādi ar ultraskaņu, lai atdalītu bioplēvi. Ultraskaņas viļņi sagrauj bioplēves matricu, atbrīvojot pieķērušās baktērijas.
4. UIP400MTP nodrošina vienmērīgu iedarbību visās iedobēs, lai iegūtu konsekventus atdalīšanas rezultātus.

Analītiskais posms: atdalītās Staphylococcus bioplēves biomasas kvantitatīva noteikšana, izmantojot kristālvioleto (CV)

Nepieciešamie materiāli:

• 0,1% kristālvioletā (CV) šķīdums
• 95% etanols vai 30% etiķskābe (solubilizācijai)
• Mikroplašu lasītājs, kas spēj veikt mērījumus pie 570 nm
• Sterilas mikrotitrēšanas plates krāsošanai

Darbības:

1. Krāsošanas plates sagatavošana: pārnesiet 100 µL atdalītās bioplēves suspensijas no katras ar ultraskaņu apstrādātās plates iedobes uz atbilstošajām tīras, sterilas 96 iedobju mikrotitrēšanas plates iedobēm. Tas nodrošina tīru un vienmērīgu vidi krāsošanai.
2. Atdalītās bioplēves krāsošana: katrā iedobē, kurā ir atdalītās bioplēves suspensija, pievienojiet 150 µL 0,1% kristālvioletā šķīduma. Saudzīgi pipetējiet, lai nodrošinātu vienmērīgu bioplēves suspensijas un kristālvioletā sajaukšanos.
3. Inkubācija: inkubējiet plati istabas temperatūrā 15 minūtes, lai kristālvioletais varētu efektīvi iekrāsot biomasu.
4. Mazgāšana: pēc inkubācijas uzmanīgi izlejiet kristālvioletā šķīdumu no iedobēm, neizkustinot biomasu. Katru iedobi trīs reizes mazgājiet ar sterilu fizioloģisko šķīdumu, lai noņemtu nesaistīto krāsvielu.
5. Žāvēšana: ļaujiet platei nožūt gaisā istabas temperatūrā vai skapī ar sterilu gaisa plūsmu. Izvairieties no karsēšanas, jo tā var mainīt rezultātus.
6. Solubilizācija: katrā iedobē pievienojiet 200 µL 95% etanola (vai 30% etiķskābes atkarībā no laboratorijas standarta prakses), lai izšķīdinātu saistīto kristālvioleto. Saudzīgi maisiet, pipetējot vai kratot plati 10 minūtes istabas temperatūrā.
7. Mērīšana: izmantojot mikroplašu lasītāju, izmēriet izšķīdinātā kristālvioletā šķīduma optisko blīvumu (OD) pie 570 nm.
8. Datu analīze: no eksperimentālo iedobju vērtībām atņemiet negatīvo kontroļu (iedobju ar TSB, bet bez baktēriju inokulāta) vidējo OD570 vērtību, lai ņemtu vērā fona iekrāsojumu. Reģistrējiet un analizējiet datus.

Piezīme: veiciet eksperimentu trijos atkārtojumos katram nosacījumam, lai nodrošinātu reproducējamību. Nodrošiniet pareizu rīcību ar kristālvioleto un etanolu, ievērojot drošības un atkritumu apsaimniekošanas protokolus.
 

UIP400MTP galvenās priekšrocības īsumā:

• Apstrāde ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu: Īpaši izstrādāts vairāku iedobju platēm, ļaujot vienlaikus apstrādāt vairākus paraugus.
• Vienmērīgs ultraskaņas sadalījums: Nodrošina vienādu ultraskaņas intensitāti visās iedobēs, sniedzot konsekventus rezultātus visiem paraugiem.
• Izmantojiet jebkuru standarta plati: UIP400MTP var apstrādāt jebkuras standarta vairāku iedobju plates, Petri traukus un mēģeņu statīvus. Nav nepieciešamas dārgas, tikai šai ierīcei paredzētas plates!
• Lietotājam draudzīga saskarne: Viegli iestatāms un vadāms, tāpēc tas ir lielisks rīks laboratorijas darba ražīguma palielināšanai. Programmējami iestatījumi un automatizācija atvieglo procesa standartizāciju!