Baktēriju paraugu šūnu dezagregācija ar ultraskaņu
Baktēriju paraugi reti ir īstas atsevišķu šūnu suspensijas. Kultūras aug ķēdēs un flokulās, no vides izdalītie izolāti veido agregātus, kurus saista ārpusšūnu polimēru vielas, un centrifugēšanas nogulsnes bieži ir grūti atkārtoti suspendēt pat pēc rūpīgas maisīšanas ar vorteksa maisītāju. Dzīvotspējīgo šūnu skaita noteikšana, optiskā blīvuma mērīšana, plūsmas citometrija un mikrobioma profilēšana balstās uz pieņēmumu, ka viena daļiņa atbilst vienai šūnai. Šūnu dezagregācija ar ultraskaņu novērš šo pretrunu: īsi, kontrolēti ultraskaņas apstrādes impulsi sadala agregātus atsevišķās šūnās, neizraisot to līzi.
Kāpēc šūnu agregācija mazina jūsu rezultātu ticamību
Agregācija ir bioloģiska īpašība, nevis paraugu sagatavošanas kļūda. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces un daudzas vides sugas aug ķēdēs, kopās vai bioplēves fragmentos, un ārpusšūnu DNS un polisaharīdi salīmē šūnas nogulsnēs un uztriepju eluātos. Analītiskās sekas ir sistemātiskas:
- Koloniju skaits tiek novērtēts par zemu, jo viens šūnu sakopojums veido vienu koloniju neatkarīgi no tajā esošo šūnu skaita.
- Optiskā blīvuma mērījumi un daļiņu skaitītāji uzrāda agregātus, nevis šūnas, tādējādi izkropļojot augšanas līknes.
- Plūsmas citometrijā un šūnu šķirošanā salipušu šūnu radītie notikumi tiek uzskaitīti nepareizi un izslēgti no analīzes.
- DNS un olbaltumvielu ekstrakcijas atspoguļo tikai agregāta virsmā esošās šūnas, izkropļojot mikrobioma un omikas datus.
Tradicionālās metodes ir lēnas, nepilnīgas vai izraisa ķīmiskas izmaiņas. Intensīva pipetēšana un maisīšana ar vorteksa maisītāju atstāj mikroagregātus. Disperģēšana ar enzīmiem vai helātveidotājiem izmaina šūnu virsmu, kuru jūs, iespējams, plānojat analizēt. Mehāniska dezagregācija ar kontrolētu kavitāciju iedarbojas dažu sekunžu laikā un neprasa piedevas.
Viens agregāts atbilst vienai kolonijai – un vienam nepareizam rezultātam. Uzziniet, kā dezagregācija ar ultraskaņu ļauj iegūt īstas atsevišķu šūnu suspensijas bez līzes, aerosoliem vai manipulācijām ar zondi. Pieprasiet papildu informāciju!
Vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīce VialTweeter bezkontakta paraugu sagatavošanai: dezagregējiet šūnu sakopojumus noslēgtās mēģenēs
Kā apstrāde ar ultraskaņu dezagregē šūnas, neizraisot to līzi
Šūnu dezagregācijā ar ultraskaņu izmanto mehāniskās izturības atšķirības. Baktēriju agregātus satur kopā samērā vājas starpšūnu saites un ārpusšūnu matrica, savukārt neskarts šūnas apvalks iztur ievērojami lielāku bīdes slodzi. Kalibrētai ultraskaņai nonākot suspensijā, akustiskā kavitācija rada mikroplūsmas, spiediena impulsus un bīdes spēkus, kas vispirms iedarbojas uz agregātu saskares virsmām. Bīdes spēki sašķeļ šūnu sakopojumus, ķēdes un bioplēves fragmentus (deaglomerācija), pirms tiek sasniegts enerģijas līmenis, pie kura plīst membrānas (līze).
Baktēriju šūnu sakopojumu dezagregācija ar ultraskaņu
Dezagregācija vai līze – ultraskaņas apstrādes parametru nozīme
Praksē tas nozīmē, ka dezagregāciju un līzi veic ar vienu un to pašu ierīci, izmantojot atšķirīgus parametrus. Pie mērenas amplitūdas, īsiem impulsu cikliem un kontrolētas temperatūras iegūst dzīvotspējīgu atsevišķu šūnu suspensiju. Palielinot amplitūdu, iedarbības laiku vai parauga temperatūru, process virzās uz pilnīgu šūnu sagraušanu intracelulāro mērķkomponentu iegūšanai. Hielscher ģeneratori ļauj precīzi iestatīt amplitūdu, jaudu, impulsus un ievadīto enerģiju, kā arī saglabāt metodi, tādējādi dezagregācijas posms ir reproducējams dažādiem paraugiem, operatoriem un apstrādes reizēm.
Efektīva bezkontakta apstrāde ar ultraskaņu
Apstrāde ultraskaņas vannā nevar nodrošināt šādu kontroli. Ultraskaņas tīrīšanas vannas un tvertnes nodrošina tikai zemu ultraskaņas enerģiju, tādēļ paraugu sagatavošana ir nepilnīga, un kavitācija notiek nevienmērīgi, tāpēc katras mēģenes apstrāde ir atkarīga no tās novietojuma vannā. VialTweeter vienlaikus pārvada intensīvus, fokusētus ultraskaņas spēkus tieši caur trauka sienu līdz pat 10 hermētiski noslēgtos paraugos. Apstrādes procesi, kuriem vannā nepieciešama ilgstoša, mainīga iedarbība, tiek pabeigti, izmantojot standartizētu impulsu secību.
Hielscher bezkontakta sonikatori pievada intensīvu, fokusētu ultraskaņu caur noslēgtu flakonu sienām. VialTweeter vienlaikus apstrādā līdz pat 10 flakoniem ar identisku intensitāti, bez zondes paraugā, bez savstarpējas kontaminācijas un bez aerosolu izdalīšanās. Ja to prasa paraugu apstrādes ražība, mikroplašu sonikatori UIP400MTP un UIP550MTP nodrošina tādu pašu kontrolētu enerģijas pārnesi arī daudziedobju platēs.
VialTweeter vienlaikus apstrādā ar ultraskaņu līdz pat 10 mazākiem flakoniem un līdz pat 5 lielākām mēģenēm.
Bezkontakta ultraskaņas dezagregācijas priekšrocības
- Nekādas savstarpējas kontaminācijas: Tā kā flakoni visu laiku paliek noslēgti un paraugā netiek iegremdēta zonde, savstarpēja kontaminācija un parauga zudumi tiek pilnībā novērsti. Starp paraugu apstrādes reizēm nekas nav jāsterilizē, un viens apstrādes cikls nevar ietekmēt nākamo.
- Aizsardzība pret aerosoliem: Apstrāde ar ultraskaņu, izmantojot zondi atvērtā traukā, rada infekciozus aerosolus un kontaminē ierīces virsmas. Hermētiski noslēgtu flakonu apstrādes laikā ar ultraskaņu paraugs paliek savā mēģenē, kas ir būtiski, strādājot ar patogēnām baktērijām, piemēram, Mycobacterium tuberculosis, un citiem BSL-2 vai BSL-3 bioloģiskajiem aģentiem.
- Nav uzgaļa erozijas: Darbības laikā no titāna zondēm paraugā var nonākt neliels daudzums mikrodaļiņu. Šīs daļiņas turpmākajos posmos maina optiskā blīvuma un daļiņu skaita mērījumus. Netieša apstrāde ar ultraskaņu caur trauka sienu pilnībā novērš šo cieto daļiņu avotu.
- Vienmērīga paraugu apstrādes ražība: VialTweeter nodrošina vienādu ultraskaņas intensitāti katrā no līdz pat 10 flakoniem, tāpēc apstrādes ar ultraskaņu rezultāti ir vienmērīgi un reproducējami. Izzūd novietojuma ietekme, kas rada problēmas vannās un atsevišķu paraugu apstrādē ar zondi, un sākotnējie rādītāji saglabājas salīdzināmi starp atkārtojumiem.
- Parauga integritāte: mēģenes visu apstrādes laiku paliek noslēgtas, tāpēc paraugs nevar tikt kontaminēts, sabojāties vai izgaist. Nelielus tilpumus var apstrādāt bez atšķaidīšanas, tostarp vērtīgas klīnisko paraugu nogulsnes, kurām papildu pārnešanas posms nav pieļaujams.
- Procesa kontrole: Amplitūda ir regulējama no 20 līdz 100%, impulsu režīms – no 0 līdz 100%, un sistēmas nodrošina temperatūras uzraudzību, lai temperatūra termojutīgiem celmiem un olbaltumvielām saglabātos zem bojājumus izraisošajām robežvērtībām.
Tipiski lietojumi
- Mikrobioma un zarnu satura analīze: Lactobacillus, Bifidobacterium un fēču paraugu disperģēšana pirms izsēšanas vai sekvenēšanas, lai šūnu sakopojumi nepazeminātu noteikto šūnu skaitu.
- Pārtikas un ūdens mikrobioloģija: floku dezagregācija uztriepju paraugos, noskalojumos un bagātināšanas buljonos precīzai koloniju skaita un dzīvotspējas noteikšanai.
- Bioplēvju pētniecība: šūnu iegūšana no nesējiem un virsmām atsevišķu šūnu suspensiju veidā bez fermentatīvas apstrādes, kas noņemtu virsmas olbaltumvielas.
- Klīniskā diagnostika: krēpu, strutu un uztriepju eluātu atkārtota suspendēšana ierobežotas izplatīšanās apstākļos.
- Šūnu kultivēšana: sakopotu zīdītāju, kukaiņu un CHO šūnu agregātu atdalīšana pirms skaitīšanas un pasāžas.
- Sagatavošana visai darbplūsmai: tā pati ierīce, kas veic dezagregāciju pie zemas amplitūdas, ar augstākiem iestatījumiem nodrošina pilnīgu šūnu sagraušanu, tāpēc līze, olbaltumvielu ekstrakcija un DNS fragmentācija var sekot bez paraugu pārnešanas citās mēģenēs.
Daudziedobju plašu sonikators UIP400MTP šūnu sakopojumu deaglomerācijai ar augstu paraugu apstrādes ražību
Mikroplašu sonikatoru modeļi UIP400MTP un UIP550MTP ir paredzēti ne tikai daudziedobju platēm – tie apstrādā arī mēģeņu statīvus.
Atrodiet savai dezagregācijas darbplūsmai piemērotāko sonikatoru
VialTweeter vairāku mēģeņu sonikators
Ieteicamā metode sterilai dezagregācijai noslēgtos flakonos. VialTweeter darbina 200 vatu UP200St procesors ar 26 kHz frekvenci un automātisku noskaņošanu; tas netieši pārnes ultraskaņu caur līdz pat 10 noslēgtu flakonu sieniņām vienlaikus, nodrošinot līdz pat 10 W katrā mēģenē un vienmērīgus, reproducējamus rezultātus bez savstarpējas kontaminācijas un parauga zudumiem. Titāna VialTweeter sonotrode ir autoklavējama, un amplitūdu un impulsu režīmu var regulēt un saglabāt, nodrošinot dezaglomerācijas protokolam nepieciešamās vadības iespējas. Standarta sonotrodē ar 10 pozīcijām var ievietot automātiskā paraugu padevēja flakonus, mikrocentrifūgas mēģenes un Eppendorf vai Nunc mēģenes ar tilpumu no 1 līdz 5 mL. VialPress iespīlēšanas ierīcē var nostiprināt līdz pat 5 lielākiem traukiem ar diametru līdz 20 mm.
Ir pieejami īpaši vienas mēģenes VialTweeter modeļi Falcon mēģenēm un atsevišķiem flakoniem, kas pielāgoti trauka izmēram. Noņemot bloka sonotrodi, UP200St pamatierīce darbojas kā parasts zondes tipa ultraskaņas apstrādes aparāts maza līdz vidēja tilpuma paraugu tiešai apstrādei.
Mikroplašu ultraskaņas apstrādes aparāti
Pārejiet uz lielas paraugu caurlaidspējas sagatavošanu ar daudziedobju plašu apstrādi ar ultraskaņu: darba procesos, kuros izmanto plates, mikroplašu ultraskaņas apstrādes aparāti UIP400MTP un UIP550MTP paplašina vienmērīgu bezkontakta apstrādi ar ultraskaņu no desmit mēģenēm līdz veselai platei.
400 vatu UIP400MTP apstrādā standarta mikrotitrēšanas un daudziedobju plates, tostarp 96 iedobju formātus, nodrošinot precīzu amplitūdas, jaudas un impulsu režīma vadību, kā arī taimeri, temperatūras zondi un dzesēšanu ūdens vannā. Bioplēvju atdalīšana un baktēriju kultūru apstrāde ir plaši izmantoti UIP400MTP mikroplašu ultraskaņas apstrādes aparāta lietojumi.
550 vatu UIP550MTP ir jaudīgākā izvēle – ideāli piemērota sarežģītākiem lietojumiem.
Abas bezkontakta ultraskaņas apstrādes sistēmas droši apstrādā 6, 12, 24, 48, 96 un 384 iedobju plates, kā arī mēģeņu statīvus un Petri traukus. Hielscher mikroplašu ultraskaņas apstrādes aparāti darbojas ar jebkuru standarta plati, ļaujot izvairīties no dārgiem, tikai konkrētajai sistēmai paredzētiem palīgmateriāliem. Pateicoties programmējamām temperatūras robežvērtībām, apstrāde ar ultraskaņu automātiski tiek pārtraukta, sasniedzot maksimālo parauga temperatūru, un atsākas pēc atdzesēšanas, saglabājot dzīvotspēju atkārtotos ciklos. Vieda un uzticama paraugu sagatavošana ar lielu paraugu caurlaidspēju atkārtojamiem rezultātiem.
Tālāk redzamajā tabulā sniegts pārskats par mūsu laboratorijas paraugu ultraskaņas apstrādes aparātu aptuveno apstrādes jaudu; šos aparātus izmanto dzīvības zinātnēs, genomikā, proteomikā un diagnostikā:
| Ieteicamās ierīces | Partijas tilpums | Plūsmas ātrums |
|---|---|---|
| VialTweeter ultraskaņas apstrādes aparāts vairākām mēģenēm | flakoni ar tilpumu no 0,5 līdz 1,5mL | n.a. |
| UIP400MTP ultraskaņas apstrādes aparāts daudziedobju platēm (440 vati) | daudziedobju / mikrotitrēšanas plates | n.a. |
| UIP550MTP ultraskaņas apstrādes aparāts daudziedobju platēm (550 vati) | daudziedobju / mikrotitrēšanas plates | n.a. |
| Ultraskaņas CupHorn | CupHorn flakoniem vai vārglāzei | n.a. |
| UP100H 100 vatu zondes tipa ultraskaņas apstrādes aparāts | no 1 līdz 500mL | no 10 līdz 200mL/min |
| UP200Ht, UP200St 200 vatu zondes tipa ultraskaņas apstrādes aparātu modeļi | no 10 līdz 1000mL | no 20 līdz 200mL/min |
| UP400St 400 vatu zondes tipa ultraskaņas apstrādes aparāts | no 10 līdz 2000mL | no 20 līdz 400mL/min |
| GDmini2 | sterils ultraskaņas mikroplūsmas reaktors | n.a. |
| Ultraskaņas sietu kratītājs | n.a. | n.a. |
Bieži uzdotie jautājumi par šūnu dezagregāciju ar ultraskaņu
Kāda ir atšķirība starp šūnu dezagregāciju un šūnu līzi?
Dezagregācija, ko sauc arī par dezaglomerāciju, atdala salipušas šūnas, veidojot atsevišķu šūnu suspensiju, vienlaikus saglabājot šūnas neskartas un dzīvotspējīgas. Līze pārrauj šūnas apvalku un atbrīvo intracelulāro saturu. Abus procesus izraisa kavitācijas radītā bīde, un atšķirība ir ievadītās enerģijas daudzumā. Ar optimizētiem amplitūdas, impulsu režīma un temperatūras iestatījumiem apstrāde ar ultraskaņu nodrošina dezagregāciju, nepārsniedzot līzes slieksni.
Kāpēc ultraskaņas vannas nav piemērotas standartizētai dezagregācijai?
Vannas nodrošina tikai zemu ultraskaņas enerģiju, tāpēc paraugu sagatavošana ir nepilnīga, un kavitācija tvertnē attīstās ļoti nevienmērīgi, tādēļ katrs paraugs tiek apstrādāts atšķirīgi atkarībā no tā novietojuma. Mikrobioloģiskās uzskaites un salīdzinošo pētījumu rezultāti ir atkarīgi no salīdzināmības. Bezkontakta ultraskaņas apstrādes ierīces, piemēram, vairāku mēģeņu ultraskaņas apstrādes ierīce VialTweeter, kā arī mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīču modeļi UIP400MTP un UIP550MTP apstrādā visus traukus pielāgotos ultraskaņas apstākļos, kas uzlabo rezultātu reproducējamību atkārtojumos.
Vai apstrāde ar ultraskaņu var bojāt šūnas?
Jā, ja parametri netiek kontrolēti. Pārmērīga apstrāde ar ultraskaņu vai nekontrolēta uzkaršana var bojāt šūnas, un izdalītā DNS padara paraugus viskozus un veicina atkārtotu agregāciju. Tāpēc process jāizstrādā pārdomāti: mērena amplitūda, impulsu cikli, dzesēšana un ierīces ar temperatūras ierobežošanu nodrošina, ka apstrāde paliek līknes dezagregācijas daļā.
Visas Hielscher digitālās ultraskaņas apstrādes ierīces piedāvā precīzi kontrolējamus parametrus, pievienojamus temperatūras sensorus, programmējamus iestatījumus un automatizētu datu reģistrēšanu uzticamai paraugu sagatavošanai.
Vai paraugs jāpārnes citā traukā?
Nē. Flakoni un plates tiek apstrādāti to sākotnējos, noslēgtajos traukos. Netieša apstrāde ar ultraskaņu novērš gan zudumus pārnešanas laikā, gan pārnesi starp paraugiem, kas saistīta ar zondes lietošanu.
Kādu formātu flakonus var apstrādāt ar VialTweeter?
Standarta 10 pozīciju sonotrodē var ievietot automātiskā paraugu padevēja flakonus, mikrocentrifūgas mēģenes un Eppendorf vai Nunc mēģenes ar tilpumu no 1 līdz 5 mL. VialPress piederumā var ievietot līdz 5 lielākiem traukiem ar diametru līdz 20 mm. Ir pieejami īpaši vienas mēģenes VialTweeter modeļi Falcon mēģenēm, kā arī individuāli pielāgotiem viena flakona vai lielākiem formātiem.
Vai ar vienu ierīci var veikt gan dezagregāciju, gan līzi?
Jā. Tā pati iekārta, kas pie mērenas amplitūdas veic dezagregāciju, pie lielākas amplitūdas un ilgākas iedarbības veic pilnīgu šūnu sagraušanu, tāpēc atsevišķu šūnu suspensijas iegūšanu un turpmāko ekstrakciju var veikt secīgi, nemainot platformu.
Vai MBEC testos izmanto apstrādi ar ultraskaņu?
Apstrāde ar ultraskaņu ir nostiprinājusies un lielā mērā standarta sastāvdaļa. MBEC testā ar tapu vāku pēc bioplēvju izaudzēšanas uz polistirola tapām un pakļaušanas antibiotikas iedarbībai tapas pārnes svaigā barotnē un pakļauj maisīšanai ar vorteksa maisītāju un apstrādei ar ultraskaņu, lai atdalītu un dezagregētu pieķērušās bioplēves šūnas, iegūstot planktonisku suspensiju pirms sērijveida atšķaidīšanas un dzīvotspējīgo šūnu skaita noteikšanas (MBEC nosaka kā zemāko koncentrāciju, kas samazina atgūto šūnu skaitu par ≥3 log10 salīdzinājumā ar neapstrādātu bioplēvi). Apstrāde ar ultraskaņu būtiski uzlabo dispersijas kvalitāti: nepilnīga ieslēgto šūnu atbrīvošana no EPS matricas liek novērtēt izskaušanu par zemu un mākslīgi paaugstina MBEC vērtības. Mērķēta tapu turētāja iedobju apstrāde ar ultraskaņu visās testa platēs, izmantojot mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīci UIP400MTP, novērš tradicionālos ultraskaņas vannu trūkumus – proti, nevienmērīgu enerģijas sadalījumu, uzkaršanu un aerosolu veidošanās un savstarpējas kontaminācijas risku.
Uzziniet, kā bezkontakta mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP400MTP atvieglo MBEC testu veikšanu!
Vai MIC testos izmanto apstrādi ar ultraskaņu?
Apstrādi ar ultraskaņu izmanto dažādos ar MIC saistītos darbplūsmas posmos, lai uzlabotu efektivitāti un reproducējamību:
- mikobakterioloģijā, kur krēpas un citus viskozus paraugus pirms jutības noteikšanas regulāri dekontaminē un homogenizē, dažkārt izmantojot apstrādi ar ultraskaņu, un īslaicīga dispersija uzlabo salipumus veidojošu mikobaktēriju inokulātu piemērotību precīzu MIC vērtību noteikšanai;
- organismiem ar noslieci uz agregātu veidošanos (piemēram, streptokokiem un stafilokokiem nogulsnēs), kuriem mikroagregāti izkropļo inokulāta blīvumu; un
- kombinētā diagnostikā, piemēram, kultivējot šķidrumu, kas iegūts implanta apstrādē ar ultraskaņu, un pēc tam nosakot jutību locītavas protēzes infekcijas gadījumā (MBEC līdzīgs pielietojums, nevis klasisks MIC pielietojums).
Literatūra / Atsauces
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Izvēlieties savu plati! Mikroplašu ultraskaņas apstrādes ierīce UIP550MTP dezagregē baktēriju paraugus jebkurā standarta daudziedobju platē.
Hielscher vairāku paraugu ultraskaņas apstrādes ierīču modeļi UIP400MTP mikroplatēm, VialTweeter un CupHorn: ātra paraugu sagatavošana ar augstu paraugu apstrādes ražīgumu