Baktēriju paraugu šūnu sadalīšana ar ultraskaņu
Baktēriju paraugi reti tiek piegādāti kā patiesi vienšūnu suspensijas. Kultūras aug ķēdēs un pārslas, no vides izdalītie izolāti veido agregātus, kurus saista ekstracelulāras polimērās vielas, un centrifugētie nogulsnējumi bieži vien neļauj tos atkārtoti suspendēt pat pēc rūpīgas vortexēšanas. Dzīvotspējīgo šūnu skaitīšana, optiskā blīvuma mērīšana, plūsmas citometrija un mikrobioma profilēšana — visos šajos gadījumos tiek pieņemts, ka viena daļiņa atbilst vienai šūnai. Ultraskaņas šūnu sadalīšana atrisina šo pretrunu: īsi, kontrolēti ultraskaņas impulsi sadala agregātus atsevišķās šūnās, tās nelizējot.
Kāpēc šūnu agregācija ietekmē jūsu rezultātus
Agregācija ir bioloģiska parādība, nevis parauga sagatavošanas kļūda. Stafilokoki, streptokoki, laktobacilli, aktinomicēti un daudzas vides sugas aug ķēdēs, kopās vai biofilmas fragmentos, un ekstracelulārā DNS un polisaharīdi salīmē šūnas kopā granulās un tamponu eluātos. Analītiskās sekas ir sistemātiskas:
- Koloniju skaits tiek novērtēts par zemu, jo viens kopums veido vienu koloniju neatkarīgi no tā, cik daudz šūnu tajā ir.
- Optiskā blīvuma un daļiņu skaitītāji reģistrē agregātus, nevis šūnas, tādējādi izkropļojot augšanas līknes.
- Plūsmas citometrija un šūnu šķirošana nepareizi uzskaita salipušos notikumus un izslēdz tos no analīzes.
- DNS un proteīnu ekstrakcijas attiecas tikai uz šūnām uz agregāta virsmas, tādējādi izkropļojot mikrobioma un omikas datus.
Tradicionālās metodes ir lēnas, nepilnīgas vai izraisa ķīmiskas izmaiņas. Intensīva pipetēšana un vorteksēšana atstāj mikroagregātus. Enzīmu vai helatoru izmantošana dispersijas procesā maina šūnu virsmu, kuru, iespējams, plānojat analizēt. Mehāniska dezagregācija, izmantojot kontrolētu kavitāciju, notiek dažu sekunžu laikā un neprasa nekādas piedevas.
Viens agregāts atbilst vienai kolonijai – un viens nepareizs rezultāts. Uzziniet, kā ultraskaņas sadalīšana ļauj iegūt patiesas vienšūnu suspensijas bez šūnu līzes, aerosolu veidošanās vai zondes lietošanas. Pieprasiet papildu informāciju!
Daudzcauruļu sonikators VialTweeter bezkontakta parauga sagatavošanai: izšķaidiet šūnu pikučus noslēgtās mēģenēs
Kā ultraskaņas iedarbība sadala šūnas, tās nelizējot
Ultraskaņas šūnu sadalīšana izmanto mehāniskās izturības atšķirības. Baktēriju agregātus kopā tur salīdzinoši vājas starpšūnu saites un ekstracelulārā matrice, savukārt neskartā šūnas apvalka izturība pret šķērsspēku ir ievērojami lielāka. Kad kalibrēts ultraskaņas vilnis nonāk suspensijā, akustiskā kavitācija rada mikrostraumes, spiediena impulsus un šķēres spēkus, kas vispirms iedarbojas uz agregātu saskares virsmām. Pūlīši, ķēdes un biofilmas fragmenti tiek atdalīti (deaglomerācija), pirms tiek sasniegts enerģijas līmenis, kurā notiek membrānu plīsumi (līze).
Baktēriju šūnu kopu ultraskaņas sadalīšana
Sadalīšana vai līze – Kāda nozīme ir ultraskaņas parametriem
Praktiskā sekas ir tāda, ka disagregācija un līze ir viens un tas pats instruments, ko ekspluatē ar atšķirīgiem parametriem. Pie mērenas amplitūdas, īsiem impulsu cikliem un kontrolētas temperatūras tiek iegūta dzīvotspējīga vienšūnu suspensija. Palielinot amplitūdu, iedarbības laiku vai parauga temperatūru, process virzās uz pilnīgu šūnu sadalīšanu, lai sasniegtu intracelulāros mērķus. Hielscher ģeneratori ļauj precīzi iestatīt amplitūdu, jaudu, impulsu un enerģijas patēriņu, kā arī saglabāt metodi, tādējādi nodrošinot, ka disaggregācijas posms ir reproducējams visiem paraugiem, operatoriem un eksperimentu sērijām.
Efektīva bezkontakta ultraskaņas apstrāde
Tīrīšana ar ultraskaņu vannā nevar līdzināties šai kontrolei. Ultraskaņas tīrīšanas vannas un tvertnes nodrošina tikai nelielu ultraskaņas enerģiju, kas izraisa nepilnīgu paraugu sagatavošanu, un kavitācija notiek nevienmērīgi, tāpēc katra mēģene tiek apstrādāta atbilstoši tās novietojumam vannā. „VialTweeter” vienlaikus pārraida intensīvu, fokusuētu ultraskaņas enerģiju tieši caur trauka sienu līdz pat 10 aizzīmogotiem paraugiem. Apstrādes, kurām nepieciešama ilga un mainīga iedarbība vannā, tiek pabeigtas saskaņā ar standartizētu impulsu shēmu.
Hielscher bezkontakta ultraskaņas iekārtas pievada intensīvu, fokusuētu ultraskaņu caur slēgtu flakonu sienām. VialTweeter vienlaikus apstrādā līdz pat 10 flakoniem ar vienādu intensitāti, neievietojot zondi paraugā, novēršot savstarpēju piesārņojumu un aerosola izdalīšanos. Ja to prasa ražīgums, mikroplates ultraskaņas iekārtas UIP400MTP un UIP550MTP nodrošina tādu pašu kontrolētu enerģijas pārnesi uz daudzbedrīšu platēm.
The VialTweeter vienlaicīgi sonikē līdz pat 10 mazākām flakoniem un līdz pat 5 lielākām mēģenēm.
Bezkontakta ultraskaņas sadalīšanas priekšrocības
- Pilnīgi nekāda savstarpējā piesārņošana: Tā kā flakoni paliek pastāvīgi aizvērtā stāvoklī un paraugā netiek iegremdēts neviens zondes gals, tiek pilnībā novērsta savstarpējā piesārņošana un parauga zudums. Starp paraugiem nav nekas, kas būtu jāsterilizē, un viens eksperiments nevar ietekmēt nākamo.
- Aerosola aizsardzība: Ultraskaņas apstrāde ar atvērtu zondi rada infekciozus aerosolus un piesārņo instrumentu virsmas. Ultraskaņas apstrāde slēgtā mēģenē ierobežo parauga izplatīšanos pašu mēģenes iekšienē, kas ir svarīgi, strādājot ar patogēnām baktērijām, piemēram, Mycobacterium tuberculosis, un citiem BSL-2 vai BSL-3 līmeņa ģenētiski bīstamiem aģentiem.
- Nav dzeramnaudas samazināšanās: Titāna zondes darbības laikā paraugā var nonākt neliels daudzums mikrodalīņu. Šīs dalīņas ietekmē optisko blīvumu un dalīņu skaitu turpmākajā procesā. Netieša ultraskaņas apstrāde caur trauka sienu pilnībā novērš šo cieto vielu avotu.
- Vienmērīga caurlaidspēja: VialTweeter nodrošina vienādu ultraskaņas intensitāti katram no līdz pat 10 flakoniem, tādējādi ultraskaņas apstrādes rezultāti ir vienmērīgi un reproducējami. Izgaist pozicionēšanas ietekme, kas raksturīga ultraskaņas vannām un viena parauga izpētei, un jūsu sākotnējie rādītāji paliek salīdzināmi visos atkārtojumos.
- Parauga integritāte: caurules paliek aizvērtas visā apstrādes laikā, tādējādi paraugs nevar tikt piesārņots, sabojāts vai iztvaicēts. Neliela tilpuma paraugus var apstrādāt bez atšķaidīšanas, tostarp vērtīgus klīniskos nogulsnējumus, kuriem nav iespējams veikt papildu pārnesšanas posmu.
- Procesa kontrole: Amplitūdu var regulēt diapazonā no 20 līdz 100 %, impulsu režīmu — no 0 līdz 100 %, un sistēmas atbalsta temperatūras uzraudzību, lai termiski jutīgie celmi un proteīni nepārsniegtu kaitīgās robežvērtības.
Tipiski lietojumi
- Mikrobioma un zarnu satura analīze: Lactobacillus, Bifidobacterium un fekāļu paraugu izkliedēšana pirms izsēšanas uz barotnes vai sekvencēšanas, lai kopējais skaits netiktu samazināts sakarā ar sablīvēšanos.
- Pārtikas un ūdens mikrobioloģija: flokulu sadalīšana no paraugiem, skalošanas šķidrumiem un bagātināšanas barotnēm, lai precīzi noteiktu koloniju skaitu un dzīvotspēju.
- Biofilmu pētījumi: šūnu atdalīšana no nesējiem un virsmām kā vienšūnu suspensijas, neizmantojot fermentatīvu apstrādi, kas noņemtu virsmas proteīnus.
- Klīniskā diagnostika: krēpu, strutas un uztriepes eluātu atkārtota suspendēšana izolācijas apstākļos.
- Šūnu kultūra: zīdītāju, kukaiņu un CHO šūnu salipušo agregātu atdalīšana pirms skaitīšanas un pārstādīšanas.
- Visa darba procesa sagatavošana: tas pats instruments, kas zemas amplitūdas režīmā veic sadalīšanu, augstākos iestatījumos nodrošina pilnīgu šūnu sadalīšanu, tādējādi līze, proteīnu ekstrakcija un DNS fragmentācija notiek bez nepieciešamības pārvietot paraugus starp mēģenēm.
Sonikators UIP400MTP ar daudz iedobju plašu sonikatoru šūnu pārslu deaglomerācijai ar augstu caurlaidspēju
Mikroplākšņu ultraskaņas apstrādes iekārtu modeļi UIP400MTP un UIP550MTP ir piemēroti ne tikai daudzkameru plāksnēm, bet arī mēģenu turētāju apstrādei.
Atrodiet sev piemērotu ultraskaņas iekārtu jūsu disaggregācijas darba procesam
VialTweeter Multi-Tube Sonicator
Vislabākā metode sterilu, aizzīmogotu flakonu satura sadalīšanai. Darbojas ar 200 vatu jaudas UP200St procesoru, kas darbojas 26 kHz frekvencē ar automātisko regulēšanu, VialTweeter vienlaikus netieši pārraida ultraskaņu caur līdz pat 10 slēgtu flakonu sienām, ar jaudu līdz 10 W uz vienu flakonu, nodrošinot vienmērīgus un reproducējamus rezultātus bez savstarpējās piesārņošanas un parauga zuduma. Titāna VialTweeter sonotrods ir sterilizējams autoklāvā, un tā amplitūda un impulsa ilgums ir regulējami un saglabājami, kas atbilst deaglomerācijas protokola nepieciešamajam regulēšanas diapazonam. Standarta 10 pozīciju sonotrods ir piemērots automātiskā paraugu ņēmēja flakoniem, mikrocentrifūgas mēģenēm un Eppendorf vai Nunc mēģenēm ar tilpumu no 1 līdz 5 ml. VialPress fiksācijas ierīce var apstrādāt līdz pat 5 lielākiem traukiem ar diametru līdz 20 mm.
Speciāli izstrādāti viencauruļu „VialTweeter” modeļi ir pieejami gan „Falcon” caurulēm, gan atsevišķām kolbām, kas pielāgotas trauka izmēriem. Izjauciet bloka sonotrodu, un UP200St pamatvienība darbosies kā parasts zondes ultraskaņas aparāts mazu un vidēja izmēra paraugu tiešai apstrādei.
Mikroplākšņu ultraskaņas iekārtas
Pāreja uz augstas caurlaidspējas paraugu sagatavošanu, izmantojot ultraskaņas apstrādi ar daudzkameru plāksnēm: plāksņu bāzētiem darba procesiem mikroplāksņu ultraskaņas iekārtas UIP400MTP un UIP550MTP ļauj paplašināt bezkontakta, vienmērīgu ultraskaņas apstrādi no desmit mēģenēm uz visu plāksni.
400 vatu jaudas UIP400MTP ir paredzēts standarta mikrotiteru un daudzbedrīšu plākšņu apstrādei, tostarp 96 bedrīšu formātiem, un tam ir precīza amplitūdas, jaudas un impulsu vadība, kā arī taimeris, temperatūras zonde un dzesēšana ūdens vannā. Biofilmas noņemšana un baktēriju kultūru apstrāde ir visplašāk izmantotie UIP400MTP mikroplākšņu ultraskaņas apstrādes ierīces pielietojumi.
550 vatu UIP550MTP ir jaudīgākais variants – ideāli piemērots sarežģītākām lietošanas jomām.
Abas bezkontakta ultraskaņas apstrādes sistēmas uzticami apstrādā 6-, 12-, 24-, 48-, 96- un 384-bedrīšu plāksnes, kā arī mēģenu turētājus un Petrī šķīvjus. Hielscher mikroplākšņu ultraskaņas iekārtas darbojas ar jebkuru standarta plāksni, tādējādi izvairoties no dārgiem patentētiem palīgmateriāliem. Pateicoties programmējamiem temperatūras ierobežojumiem, ultraskaņas apstrāde automātiski apturējas, sasniedzot maksimālo parauga temperatūru, un atsākas pēc atdzesēšanas, tādējādi nodrošinot dzīvotspēju atkārtotos ciklos. Vieds un uzticams paraugu sagatavošanas process ar lielu caurlaidspēju, kas nodrošina atkārtojamus rezultātus.
Zemāk esošajā tabulā ir sniegts pārskats par aptuveno apstrādes jaudu mūsu laboratorijas paraugu ultraskaņas iekārtām, kuras tiek izmantotas dzīvības zinātnēs, genomikā, proteomikā un diagnostikā:
| Ieteicamās ierīces | Partijas apjoms | Plūsmas ātrums |
|---|---|---|
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator | 00,5–1,5 ml flakoni | n.p. |
| UIP400MTP ultraskaņas apstrādes iekārta daudzbedrīšu platēm (440 vati) | vairāku iedobju / mikrotitru plāksnes | n.p. |
| UIP550MTP ultraskaņas iekārta ar vairākiem aknu laukiem (550 vati) | vairāku iedobju / mikrotitru plāksnes | n.p. |
| Ultraskaņas CupHorn | CupHorn flakoniem vai vārglāzei | n.p. |
| UP100H 100 vatu zondes tipa ultraskaņas ģenerators | 1 līdz 500 ml | 10 līdz 200 ml/min |
| UP200Ht, UP200St 200 vatu zondes tipa ultraskaņas iekārtu modeļi | 10 līdz 1000 ml | 20 līdz 200 ml/min |
| UP400St 400 vatu zondes tipa ultraskaņas iekārta | 10 līdz 2000 ml | 20 līdz 400 ml/min |
| GDmini2 | sterils ultraskaņas mikrostraumes reaktors | n.p. |
| Ultraskaņas sieta kratītājs | n.p. | n.p. |
Bieži uzdotie jautājumi par šūnu sadalīšanu ar ultraskaņu
Kāda ir atšķirība starp šūnu sadalīšanu un šūnu līzi?
Disagregācija, ko sauc arī par deaglomerāciju, sadala salipušās šūnas vienšūnu suspensijā, šūnām paliekot neskartām un dzīvotspējīgām. Līze pārrauj šūnu apvalku un atbrīvo intracelulāro saturu. Abus procesus virza kavitācijas griezes spēks, un atšķirība ir enerģijas patēriņā. Ar optimizētiem amplitūdas, impulsa un temperatūras iestatījumiem ultraskaņas apstrāde panāk disagregāciju zem līzes sliekšņa.
Kāpēc ultraskaņas vannas nav piemērotas standartizētai sadalīšanai?
Vannas nodrošina tikai nelielu ultraskaņas enerģiju, kas izraisa nepilnīgu sagatavošanu, un kavitācija tvertnē attīstās ļoti nevienmērīgi, tāpēc katrs paraugs tiek apstrādāts atšķirīgi atkarībā no tā novietojuma. Mikrobioloģiskie rādītāji un salīdzinošie pētījumi ir atkarīgi no salīdzināmības. Bezkontakta ultraskaņas iekārtas, piemēram, daudzcauruļu ultraskaņas iekārta „VialTweeter”, kā arī mikroplates ultraskaņas iekārtu modeļi „UIP400MTP” un „UIP550MTP”, apstrādā visus traukus saskaņā ar noregulētiem ultraskaņas apstākļiem, kas uzlabo rezultātu atkārtojamību starp atkārtojumiem.
Vai ultraskaņas iedarbība var bojāt šūnas?
Jā, ja parametri netiek kontrolēti. Pārmērīga ultraskaņas iedarbība vai nekontrolēta sasilšana var bojāt šūnas, un atbrīvotā DNS padara paraugus viskozus un veicina atkārtotu agregāciju. Tāpēc process ir jāizstrādā apdomīgi: mērena amplitūda, impulsu cikli, dzesēšana un ierīces ar temperatūras ierobežojumu nodrošina, ka apstrāde notiek līknes dezagregācijas pusē.
Visi Hielscher digitālie ultraskaņas ģeneratori nodrošina precīzi regulējamus parametrus, pievienojamus temperatūras sensorus, programmējamus iestatījumus un automatizētu datu reģistrēšanu, lai nodrošinātu uzticamu paraugu sagatavošanu.
Vai paraugs ir jāpārnes uz citu trauku?
Nē. Vialas un plāksnes tiek apstrādātas to oriģinālajos, aizvērtos iepakojumos. Netiešā ultraskaņas apstrāde novērš gan pārvietošanas zudumus, gan pārnesumu, kas saistīts ar zondes lietošanu.
Kādus flakonu formātus var apstrādāt ar VialTweeter?
Standarta 10-pozīciju sonotrods ir piemērots automātiskā paraugu ņemšanas ierīces flakoniem, mikrocentrifūgas mēģenēm un Eppendorf vai Nunc mēģenēm ar tilpumu no 1 līdz 5 ml. VialPress piederums ļauj izmantot līdz pat 5 lielākiem traukiem ar diametru līdz 20 mm. Pieejami speciāli „VialTweeter” modeļi ar vienu cauruli, kas paredzēti „Falcon” caurulēm, kā arī pielāgoti vienai caurulei vai lielākiem formātiem.
Vai ar vienu ierīci varu veikt paraugu sadalīšanu un šūnu lizēšanu?
Jā. Tā pati iekārta, kas vidējā amplitūdā veic deagregāciju, augstākā amplitūdā un ilgākā iedarbības laikā nodrošina pilnīgu šūnu sadalīšanu, tādējādi vienšūnu suspensijas sagatavošanu un turpmāko ekstrakciju var veikt secīgi, nemainot platformas.
Vai MBEC analīzēs tiek izmantota ultraskaņas apstrāde?
Ultraskaņošana ir plaši izmantota un lielākoties standarta procedūra. MBEC testā ar tapu vāciņiem, pēc tam, kad biofilmas ir izaudzētas uz polistirola tapām un pakļautas antibiotikas iedarbībai, tapas pārnes uz svaigu barotni un pakļauj vorteksēšanai un ultraskaņošanai, lai atdalītu un deagregētu pieķērušās biofilmas šūnas, pārvēršot tās planktoniskā suspensijā, pirms veic sērijveida atšķaidīšanu un dzīvotspējīgo šūnu skaitīšanu (MBEC tiek definēts kā zemākā koncentrācija, kas samazina iegūtos skaitļus par ≥3 log10 salīdzinājumā ar neapstrādātu biofilmu). Ultraskaņas apstrāde ievērojami uzlabo dispersijas kvalitāti: nepilnīga iegultu šūnu atbrīvošana no EPS matricas novājina iznīcināšanas novērtējumu un pārspīlē MBEC vērtības. Mērķtiecīga PEG turētāju bedrīšu ultraskaņošana visās analīzes plāksnēs, izmantojot mikroplāksnes ultraskaņotāju UIP400MTP, novērš tradicionālās vannas ultraskaņošanas vājās puses – proti, nevienmērīga enerģijas sadale, pārkaršana un aerosola/krusteniskās piesārņošanas risks.
Uzziniet, kā bezkontakta mikropateņu ultraskaņas iekārta UIP400MTP atvieglo MBEC analīžu veikšanu!
Vai ultraskaņas apstrāde tiek izmantota MIC noteikšanas testos?
Ultraskaņas apstrādi izmanto dažādos ar MIC saistītos darba procesos, lai uzlabotu efektivitāti un reproducējamību:
- mikobakterioloģijā, kur krēpas un citi viskozā konsistences paraugi pirms jutības testēšanas parasti tiek dezinficēti un homogenizēti, dažkārt izmantojot ultraskaņas apstrādi, un mikobaktēriju inokulātiem, kas veido sablīvējumus, īslaicīga dispersija nodrošina precīzākus MIC rādītājus;
- organismi, kam raksturīga agregācija (piemēram, streptokoki, stafilokoki granulās), kur mikroagregāti izkropļo inokulāta blīvumu; un
- kombinēta diagnostika, piemēram, implanta ultraskaņas apstrāde un šķidruma kultivēšana, kam seko jutības pārbaude protezēto locītavu infekciju gadījumā (MBEC tipa, nevis klasiskā MIC, pielietojums).
Literatūra / Atsauces
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Izvēlies savu šķīvi! Mikroplates ultraskaņas apstrādes iekārta UIP550MTP izšķir baktēriju paraugus jebkurā standarta daudzkameru plāksnē.
Hielscher vairāku paraugu sonikatoru modeļi UIP400MTP mikroplatēm, VialTweeter un Cuphorn: ātrdarbīga un augstas veiktspējas paraugu sagatavošana