Liela skaita FFPE paraugu sagatavošana: olbaltumvielu ekstrakcija un nukleīnskābju fragmentēšana ar bīdes spēkiem

Biežāk uzdotie jautājumi
Tālāk mēs atbildam uz biežāk uzdotajiem jautājumiem par FFPE audu sagatavošanu un FFPE paraugu apstrādi ar ultraskaņu.

Kā sagatavo FFPE audus?

FFPE audu sagatavošanas posmi: Rūpīga apiešanās ar svaigiem audiem un to apstrāde ir izšķiroši svarīga augstas kvalitātes FFPE paraugu iegūšanai. Šūnu arhitektūras, nukleīnskābju un olbaltumvielu saglabāšana ir būtiska precīzai turpmākai analīzei. Katrs posms – no audu iegūšanas līdz ieguldīšanai parafīnā – prasa precizitāti, lai saglabātu parauga integritāti dažādām analīzēm, tostarp histoloģiskai izmeklēšanai, imūnhistoķīmijai un molekulāriem pētījumiem. Pareizi veikts fiksācijas un ieguldīšanas process nodrošina, ka saglabātie audi precīzi atspoguļo in vivo stāvokli, ļaujot iegūt uzticamus diagnostikas un pētniecības rezultātus.
Mēs iepazīstinām ar 6 galvenajiem FFPE audu paraugu ieguldīšanas procesa posmiem.

• Audu iegūšana
  Gan biopsijas no dzīviem zīdītājiem, gan audu kultūras ir piemēroti avoti svaigu audu iegūšanai FFPE paraugu sagatavošanai.
  Ir svarīgi izmantot aseptisku tehniku: Izmantojiet sterilus instrumentus un cimdus, lai izvairītos no piesārņojuma. Ideālā gadījumā iegūstiet audus sterilā vidē, piemēram, operāciju zālē vai laminārās plūsmas skapī.
  Tā kā paraugs ir ļoti trausls, ar to jārīkojas saudzīgi: Samaziniet apstrādes aizkavēšanos līdz minimumam un sāciet turpmāko audu apstrādi tūlīt pēc izgriešanas. Tas ir izšķiroši svarīgi autolīzes un noārdīšanās novēršanai. Turiet audus istabas temperatūrā; izvairieties no sasaldēšanas, jo tā var izraisīt ledus kristālu veidošanos un audu bojājumus.
• Audu fiksācija
  Vispirms audus apstrādā ar fiksatora šķīdumu: Izmantojiet 10% neitrāli buferētu formalīnu (NBF), kas atbilst 4% formaldehīda šķīdumam ūdenī, kas buferēts līdz neitrālam pH.
  Pilnībā iegremdējiet audus formalīnā. Nodrošiniet fiksatora un audu tilpuma attiecību vismaz 10:1. Fiksācijas laiks parasti ir no 6 līdz 24 stundām atkarībā no audu veida un izmēra. Ir svarīgi, lai fiksators varētu pilnībā iesūkties audos. Tomēr pārmērīga fiksācija var izraisīt šķērssaišu veidošanos, kas apgrūtina antigēnu atmaskošanu, savukārt nepietiekama fiksācija var pasliktināt audu saglabāšanos.
• Audu apgriešana
  Otrkārt, apgrieziet audus līdz aptuveni 3–5 mm biezumam, lai nodrošinātu pietiekamu fiksatora iesūkšanos. Nodrošiniet pareizu audu orientāciju, lai ietvertu attiecīgās histoloģiskās struktūras. Tas atvieglo ekstrakcijas procesu, kad audus vēlāk izmanto analīzei.
• Fiksētā parauga apstrāde
  Tagad fiksētie audi ir jāatūdeņo: Pēc fiksācijas audi ir jāatūdeņo, lai nodrošinātu pilnīgu parafīna iesūkšanos. Lai atdalītu ūdeni, secīgi ievietojiet audus pieaugošas koncentrācijas etanola šķīdumos (70%, 80%, 90% un 100%).
  Dzidrināšana ar ksilolu: Parafīns nešķīst ūdenī, bet šķīst ksilolā. Tādēļ ūdens audos ir jāaizstāj ar ksilolu. Tomēr pats ksilols nešķīst ūdenī, bet šķīst spirtā, tāpēc ir nepieciešams starpposms, kurā ūdeni vispirms aizstāj ar spirtu. Iegremdējiet audus ksilolā vai ksilola aizstājējā, lai atdalītu etanolu un sagatavotu audus piesūcināšanai ar parafīnu.
  Piesūcināšana ar parafīnu: Ieguldiet audus izkausētā parafīnā, nodrošinot pilnīgu piesūcināšanu. Šajā posmā parafīnu parasti nomaina vairākas reizes, lai nodrošinātu rūpīgu piesūcināšanu.
• Audu ieguldīšana
  Šajā posmā audus iestrādā audu blokā: Ievietojiet audus veidnē vēlamajā orientācijā un pārlejiet tos ar izkausētu parafīnu. Ļaujiet parafīnam sacietēt, atdzesējot istabas temperatūrā vai uz aukstas plāksnes.
• Griezumu sagatavošana un novietošana uz priekšmetstikliņiem
  Mikrotomija: Lai sagrieztu ieguldītos audus, ar mikrotomu izveidojiet plānus griezumus (parasti 4–5 mikrometrus biezus) no parafīna bloka. Pēc tam paraugu nostiprina, novietojot griezumus uz priekšmetstikliņiem turpmākai krāsošanai un mikroskopiskai analīzei.
  Visbeidzot pārbaudiet histoloģisko preparātu kvalitāti: Novērtējiet pirmos griezumus mikroskopā, lai pārliecinātos par pareizu fiksāciju un apstrādi. Pēc vajadzības pielāgojiet protokolus, ņemot vērā audu veidu un novēroto kvalitāti.

 
FFPE audus var izmantot RNS, DNS un olbaltumvielu iegūšanai, kā arī vēža vai citu slimību pazīmju atklāšanai. Tos var uzglabāt gadiem ilgi, un tiem ir būtiska nozīme audu paraugu izmantošanā diagnostikā un pētniecībā, ko veic pētnieki un ārsti.

Kādas ir biežākās problēmas un grūtības darbā ar FFPE audiem?

Formalīnā fiksētu, parafīnā ieguldītu (FFPE) audu paraugus plaši izmanto pētniecībā un diagnostikā, taču to izmantošana ir saistīta ar vairākām grūtībām un bieži sastopamām problēmām:

• Biomolekulu degradācija: Ilgstoša fiksācija var izraisīt DNS, RNS un olbaltumvielu degradāciju, apgrūtinot augstas kvalitātes nukleīnskābju vai olbaltumvielu ekstrakciju turpmākai izmantošanai. Pareiza fiksācija (izvairoties no nepietiekamas un pārmērīgas fiksācijas) ir būtiska audu saglabāšanai.

Šķērssaišu veidošanās: Fiksācija formalīnā izraisa šķērssaišu veidošanos starp olbaltumvielām un nukleīnskābēm, kas var kavēt molekulāro analīzi un ietekmēt imūnhistoķīmijas un citu analīžu precizitāti.

• Antigēnu maskēšana: Fiksācijas process var maskēt antigēnās vietas, samazinot antivielu saistīšanās efektivitāti imūnhistoķīmijā un citās imunoloģiskajās analīzēs. Tādēļ bieži ir nepieciešama antigēnu atsegšana – procedūra, kurā tiek novērsta epitopa maskēšana un atjaunota epitopa un antivielas saistīšanās. Tomēr pilnīgu antigenitāti ne vienmēr ir iespējams atjaunot.
• Mainīga fiksācijas kvalitāte: Fiksācijas ilguma un apstākļu atšķirības var radīt nevienmērīgu paraugu kvalitāti, ietekmējot rezultātu reproducējamību un salīdzināmību. Izmantojiet uzticamus fiksācijas protokolus un izvairieties no nepietiekamas un pārmērīgas fiksācijas.
• DNS bojājumi un fragmentācija: FFPE paraugu fiksācija formalīnā var izraisīt dažāda veida DNS bojājumus, tostarp citozīna deamināciju (C aizvietošanu ar T), oksidatīvus bojājumus (piemēram, 8-oksoguanīna veidošanos, kas izraisa G aizvietošanu ar T), kā arī fiziskus bojājumus, piemēram, vienpavediena pārrāvumus, iztrūkumus un vietas bez slāpekļa bāzes, kas kavē DNS polimerāzes aktivitāti. Fiksācijas process formalīnā var izraisīt DNS fragmentāciju, apgrūtinot ģenētiskās un genomiskās analīzes, piemēram, PCR un sekvenēšanu.
• RNS kvalitāte: No FFPE audiem ekstrahētā RNS bieži ir fragmentēta un ķīmiski modificēta, tādēļ ir grūti veikt augstas kvalitātes transkriptomiskās analīzes.
• Olbaltumvielu modifikācijas: Formalīns var izraisīt ķīmiskas modifikācijas olbaltumvielās, ietekmējot to struktūru un funkciju, kas var traucēt proteomiskās analīzes.
• Paraugu apstrādes artefakti: Ieguldīšanas un griezumu sagatavošanas procesā mehāniskais spriegums un siltums var radīt artefaktus un izraisīt papildu audu bojājumus.
• Atšķirības starp partijām: Atšķirības fiksācijas un ieguldīšanas protokolos starp dažādām partijām var izraisīt būtisku rezultātu mainīgumu, apgrūtinot pētījumu salīdzināšanu.
• Uzglabāšanas problēmas: Ilgstoša FFPE bloku uzglabāšana laika gaitā var izraisīt papildu degradāciju un nukleīnskābju integritātes zudumu, ietekmējot arhīva paraugu piemērotību retrospektīviem pētījumiem.

Optimizētu protokolu izmantošana, rūpīga apiešanās ar paraugiem un progresīvu metožu lietošana palīdz uzlabot no FFPE audiem iegūto datu kvalitāti un uzticamību.

Kāda ir atšķirība starp FFPE un sasaldētiem audiem?

FFPE (formalīnā fiksētus, parafīnā ieguldītus) audus saglabā, fiksējot tos formalīnā un pēc tam ieguldot parafīnā, kas ļauj tos ilgstoši uzglabāt istabas temperatūrā, saglabājot audu morfoloģiju. Savukārt sasaldētus audus ātri iekonservē sasaldējot, kas labāk saglabā nukleīnskābju un olbaltumvielu integritāti, taču prasa uzglabāšanu ļoti zemā temperatūrā.

Kādas ķīmiskās vielas izmanto FFPE ieguldīšanai?

FFPE ieslēgšanai izmantotās ķīmiskās vielas parasti ir formalīns fiksācijai un parafīns ieslēgšanai. Veicot FFPE ieslēgšanu, audus parasti fiksē ar 10% (v/v) neitrāli buferētu formalīnu (FA) vai svaigi pagatavotu 4% (w/v) formaldehīda šķīdumu (PFA), kas iegūts no paraformaldehīda pulvera. Formalīnu, kas ir formaldehīda šķīdums ūdenī, buferē līdz neitrālam pH, lai saglabātu audu morfoloģiju un novērstu pārmērīgu šķērssaišu veidošanos. Arī šķīdums uz paraformaldehīda bāzes nodrošina efektīvu fiksāciju, veidojot šķērssaites starp olbaltumvielām un tādējādi stabilizējot audu struktūru turpmākai ieslēgšanai parafīnā. Šīs ķīmiskās vielas ir būtiskas audu integritātes un morfoloģijas saglabāšanai fiksācijas un ieslēgšanas procesā.

Kā no FFPE paraugiem noņem parafīnu?

Lai no FFPE paraugiem noņemtu parafīnu, audu griezumus parasti vairākkārt mazgā ar ksilolu un pēc tam rehidratē, secīgi izmantojot spirtu šķīdumus ar pakāpeniski mainīgu koncentrāciju un visbeidzot ūdeni. Tā kā ksilols ir ļoti toksisks un rada veselības apdraudējumus, piemēram, elpošanas traucējumus, ādas kairinājumu un iespējamu ilgtermiņa ietekmi atkārtotas iedarbības gadījumā, parafīna noņemšana ar ultraskaņu daudzās laboratorijās kļūst par daudzsološu alternatīvu. Šajā metodē izmanto intensīvus ultraskaņas viļņus, lai efektīvi un droši noņemtu parafīnu bez nepieciešamības izmantot toksiskus šķīdinātājus, piemēram, ksilolu, tādējādi mazinot risku laboratorijas personālam un radot drošāku darba vidi.

Cik ilgi jāfiksē audi, lai iegūtu labas kvalitātes FFPE paraugus?

Vispārīgie ieteikumi par fiksācijas ilgumu parasti paredz audu paraugus formalīnā fiksēt 24 līdz 48 stundas. Šāds ilgums parasti ir pietiekams, lai saglabātu audu morfoloģiju un šūnu struktūras, vienlaikus mazinot pārmērīgu fiksāciju, kas var izraisīt pārmērīgu šķērssaišu veidošanos un nukleīnskābju un olbaltumvielu noārdīšanos. Tomēr optimālais fiksācijas laiks var atšķirties atkarībā no audu izmēra un veida, un mazākiem vai trauslākiem paraugiem nepieciešams īsāks fiksācijas laiks. Ir būtiski nodrošināt pietiekamu fiksāciju, lai novērstu audu autolīzi un noārdīšanos, vienlaikus izvairoties no ilgstošas fiksācijas, kas varētu sarežģīt turpmākās molekulārās analīzes.