종양 조직의 초음파 처리 보조 단백질 추출 – 프로토콜

이 프로토콜은 조직 파쇄 중에 제어된 프로브 초음파 처리 단계를 추가하여 표준 CPTAC 요소 세포 용해 워크플로를 개선하는 종양 조직의 초음파 처리 보조 단백질 추출 방법을 설명합니다. 확립된 심층 CPTAC 단백질체 및 인산화 단백질체 시료 준비 전략을 바탕으로 한 이 변경은 세포와 세포 내 구조의 파쇄를 개선하고, 시료 점도를 낮추며, 일반적으로 요소 세포 용해만으로는 회수하기 어려운 단백질, 특히 막 결합 단백질과 DNA 결합 또는 핵 연관 단백질의 방출을 촉진합니다. 근거가 된 연구에서 초음파 처리 보조 워크플로는 후속 CPTAC 방식의 단백질 소화, TMT 표지, 분획화, 인산화 펩타이드 농축 및 LC-MS/MS 분석 파이프라인과의 호환성을 유지하면서 단백질과 인산화 펩타이드 모두의 검출을 증가시켰습니다.

심층 단백질체 및 인산화 단백질체 분석을 위한 종양 조직의 초음파 처리 보조 단백질 추출

다음 프로토콜은 극저온 분쇄한 종양 조직에서 8 M 요소 세포 용해 완충액을 사용하여 단백질을 추출하도록 최적화되었습니다. 프로브형 초음파 처리 단계를 추가하면 단백질 소화 및 후속 LC-MS/MS 분석 전에 회수하기 어려운 단백질군, 특히 막 연관 단백질과 DNA 또는 핵 연관 단백질의 회수율이 향상됩니다. 근거가 된 Li et al. (2025)의 연구에서는 초음파 처리를 추가하여 막 및 핵 연관 단백질의 검출이 증가했으며, 해당 워크플로에서 >12,000개의 단백질과 >25,000개의 인산화 펩타이드를 포괄하는 심층 분석이 가능했습니다.

프로토콜의 적용 분야

다음에 이 절차를 사용하십시오:

• 신선 동결 후 극저온 분쇄한 종양 조직
• 요소 기반 추출법이 이미 확립된 세포 펠릿 또는 기타 생물학적 검체
• 트립신 소화와 선택적 TMT 표지를 사용하는 전반적 단백질체학 및 인산화 단백질체학 워크플로

Li et al. (2025)의 연구에서는 이 워크플로를 세포주, 혈액, 소변 등 다른 유형의 검체에도 적용할 수 있지만, 시료 유형에 따라 최적화가 필요할 수 있다고 명시합니다.

초음파 처리 단계를 도입하여 최적화한 시료 준비 워크플로입니다. 최적화된 워크플로와 실험 설계는 전반적 단백질체 및 인산화 단백질체 분석을 위한 CPTAC 시료 준비 프로토콜을 기반으로 합니다.
연구 및 모식도: ©Li et al., 2025

작동 원리

원 연구에서는 표준 CPTAC 요소 세포 용해 워크플로에 초음파 처리를 추가하여 막 및 핵 연관 단백질의 검출이 개선된 것을 확인했습니다. 저자들은 시료 크기와 농도에 맞추어 소노트로드 크기, 에너지 투입량 및 펄스 타이밍을 선택함으로써 초음파 처리 매개변수를 미세 조정해야 한다고 명시합니다.

예를 들어 Hielscher UP200Ht 및 UP200St의 경우, 이는 다음을 의미합니다:

• 진폭과 펄스 모드를 주요 제어 변수로 사용하십시오
• 전체 과정에서 시료를 차갑게 유지하십시오(즉, 얼음 위에 두십시오)
• 보수적인 설정으로 시작하십시오
• 시료의 맑기, 온도, 단백질 수율 및 후속 단계의 펩타이드 품질을 기준으로 최적화하십시오

 
Hielscher의 200와트 초음파 처리기 모델인 UP200Ht와 UP200St는 모두 소량 및 중간 부피의 시료용으로 설계되었으며, 진폭과 펄스 설정을 조절할 수 있습니다. 두 초음파 균질기 모두 정밀한 매개변수 조정을 위한 디지털 터치스크린 제어, 자동 데이터 기록, 연결식 온도 센서, 원격 제어 및 시료 조명 기능을 제공합니다.
 

초음파 처리 보조 단백질 추출용 시약

요소 세포 용해 완충액

사용 직전에 새로 준비하십시오:

• 8 M 요소
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8.0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL 아프로티닌
• 10 µg/mL 류펩틴
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• 포스파타아제 억제제 칵테일 2, 1:100 (v/v)
• 포스파타아제 억제제 칵테일 3, 1:100 (v/v)

첨가물을 넣기 전에 요소를 완전히 용해해야 합니다. 억제제는 사용 직전에 첨가해야 하며, 완충액은 얼음 위에 보관해야 합니다. 첨가물을 넣은 후에는 강하게 볼텍싱하기보다 용기를 부드럽게 돌려 혼합하는 것이 권장됩니다.
 

추가 시약:

• BCA 단백질 정량 시약
• 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
• DTT
• 아이오도아세트아마이드
• LysC
• 트립신
• 포름산
• 다중화 정량 단백질체학을 사용하는 경우 TMT 시약
• 인산화 펩타이드 농축을 수행하는 경우 IMAC 시약

초음파 보조 단백질 추출용 장비

필수 장비

권장 프로브 선택

약 200–1000 µL의 시료에는 소량 시료의 직접 고강도 처리에 적합한 소구경 소노트로드를 사용하십시오. Hielscher는 다양한 직경의 소노트로드를 제공하며, 팁 직경이 작을수록 팁에서 더 높은 강도를 제공합니다.

실용적인 참고 사항: 과도한 거품 발생이나 용기 벽과의 접촉 없이 효율적인 혼합이 가능한 가장 작은 프로브를 사용하십시오.

여러 시료를 동시에 처리하는 경우 다중 튜브 초음파 처리기 VialTweeter 또는 마이크로플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP를 고려해 볼 수 있습니다!

단계별 지침: 초음파 보조 단백질 추출 절차

A. 사전 냉각 및 준비

1. 원심분리기를 4°C로 냉각하십시오.
2. 요소 세포 용해 완충액을 사용 직전에 새로 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.
3. 방음함 내부의 스탠드에 UP200Ht 또는 UP200St를 설치하십시오.
4. 시료 튜브를 똑바로 안정적으로 세워 둘 수 있을 만큼 충분히 큰 얼음 수조를 준비하십시오.

완충액을 사용 직전에 새로 준비하고 저온에서 취급하는 것이 매우 중요합니다.

B. 초기 요소 추출

1. 극저온 분쇄한 조직을 얼음 위에 보관하십시오.
2. 습윤 조직 50 mg당 냉각한 요소 세포 용해 완충액 200 µL를 첨가하십시오.
3. 고속으로 5–10 s 동안 보텍싱하십시오.
4. 4°C에서 15 min 동안 반응시키십시오.
5. 보텍싱과 반응 단계를 한 번 더 반복하십시오.
6. 4°C에서 20,000g로 10 min 동안 원심분리하십시오.
7. 세포 용해액/상층액을 깨끗한 저흡착성 튜브로 옮기십시오.

C. UP200Ht 또는 UP200St를 사용한 초음파 처리

초음파 처리의 시작 조건

• 진폭: 20–30%에서 시작
• 펄스 길이: 5 s 켜짐
• 냉각: 펄스 사이에 얼음 위에서 2 min
• 주기 수: 4주기
• 총 실제 초음파 처리 시간: 20 s
• 냉각을 포함한 총 공정 시간: 약 8–10 min

초음파 처리 단계

1. 세포 용해액을 초음파 처리에 적합한 튜브로 옮기십시오. 열교환이 원활하고 프로브를 안전하게 담글 수 있는 폭이 좁고 벽이 얇은 튜브를 사용하십시오.
2. 튜브를 얼음 수조에 넣으십시오. 해당 논문은 초음파 처리 중 냉각이 열 손상을 방지하는 데 매우 중요하다고 명시합니다.
3. 프로브 팁을 시료에 담그십시오. 안정적인 캐비테이션이 발생하도록 팁을 충분히 잠긴 상태로 유지하되, 튜브 벽이나 바닥에 닿지 않도록 하십시오.
4. 시작 진폭에서 5 s 펄스를 한 번 가하십시오.
5. 즉시 시료 전체를 다시 얼음으로 충분히 냉각하는 상태로 되돌려 2 min 동안 유지하십시오.
6. 4주기가 완료될 때까지 반복하십시오.
7. 주기 후에 세포 용해액을 확인하십시오.
8. 필요한 경우에만 한 번에 5 s 펄스를 하나씩 추가하여 계속 진행하고, 매번 반드시 충분히 냉각하십시오.
9. 세포 용해액이 더 균일해지고 실처럼 늘어지는 성질/점성이 줄어들면 중단하십시오.
   종말점은 더 반투명해진 세포 용해액이 연속적인 점성 흐름 대신 방울을 형성하는 상태입니다.
10. 4°C에서 약 16,000g로 15 min 동안 원심분리하십시오.
11. 청징된 상층액을 새 튜브로 옮기고 단백질 농도를 측정하십시오.

초음파 처리 시료와 비처리 시료 간의 전체 단백질체학 및 인산화 단백질체학 비교.
a. 초음파 처리 여부에 따른 모든 PDX 종양 조직에서 동정된 단백질 수(전체 단백질체학). b. 초음파 처리 여부에 따른 모든 PDX 종양 조직에서 동정된 인산화 펩타이드 수(IMAC 농축). 존재량 비율이 제25백분위수 이상인 단백질과 인산화 펩타이드만 계수했습니다. 존재량 비율은 동일한 유형의 시료 간에 계산했습니다.
연구 및 그래프: ©Li et al., 2025

후속 단백질 소화 및 분석

초음파 처리 및 청징 후에는 원래 CPTAC 방식의 작업 흐름에 설명된 대로 진행하십시오:

1. 50 mM Tris-HCl pH 8.0으로 세포 용해액을 1:3 (v/v)으로 희석하여 요소 농도를 <2 M로 낮추십시오.
2. 단백질 50 µg당 LysC 1 mAU를 첨가하고 25°C에서 2 h 동안 반응시키십시오.
3. 효소:기질 비율이 1:49 (w/w)가 되도록 트립신을 첨가하고 25°C에서 하룻밤 동안 소화하십시오.
4. 최종 농도가 1%가 되도록 포름산을 첨가하여 반응을 중지하십시오.
5. 필요에 따라 탈염, TMT 표지, 분획화, 인산화 펩타이드 농축 및 LC-MS/MS를 계속 진행합니다.

TMT 표지 MS에서 나타난 인산화 펩타이드의 차등 발현.
a. 기저형 아형에서 초음파 비처리 시료에 비해 초음파 처리 시료에서 상향 조절된 일부 인간 인산화 펩타이드(protein-sequence 시작 및 끝)를 강조하여 표시한 결과. b. 관강형 아형에서 초음파 비처리 시료에 비해 초음파 처리 시료에서 상향 조절된 일부 인간 인산화 펩타이드(protein_sequence 시작 및 끝)를 강조하여 표시한 결과. c. 초음파 처리된 기저형 종양 아형에서 상향 조절된 인산화 펩타이드의 단백질을 기반으로 한 KEGG 경로 농축 분석 결과. d. 초음파 처리된 관강형 종양 아형에서 상향 조절된 인산화 펩타이드의 단백질을 기반으로 한 KEGG 경로 농축 분석 결과.
연구 및 그래프: ©Li et al., 2025

설계, 제조 및 컨설팅 – 독일에서 만든 품질

Hielscher 초음파 처리기는 최고의 품질 및 설계 기준으로 잘 알려져 있습니다. 견고함과 간편한 조작 덕분에 당사의 초음파 처리기를 산업 시설에 원활하게 통합할 수 있습니다. Hielscher 초음파 처리기는 열악한 조건과 까다로운 환경에도 쉽게 대응합니다.

Hielscher Ultrasonics는 ISO 인증 기업으로, 최첨단 기술과 사용자 편의성을 갖춘 고성능 초음파 처리기에 특히 중점을 둡니다. 물론 Hielscher 초음파 처리기는 CE 규정을 준수하며 UL, CSA 및 RoHs의 요구 사항을 충족합니다.

문헌 / 참고문헌

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.