종양 조직에서 초음파 처리 보조 단백질 추출 – 프로토콜
이 프로토콜은 조직 파괴 중에 제어된 프로브-초음파 단계를 추가하여 표준 CPTAC 요소 용해 워크플로우를 발전시키는 종양 조직의 초음파 처리 보조 단백질 추출 방법에 대해 설명합니다. 확립된 심층 CPTAC 프로테옴 및 인산화단백질 준비 전략을 기반으로 하는 이 수정은 세포 및 세포 하부 구조 파괴를 개선하고 시료 점도를 낮추며 요소 용해만으로는 일반적으로 회수하기 어려운 단백질, 특히 막 결합 및 DNA 결합 또는 핵 관련 단백질의 방출을 향상시킵니다. 기본 연구에서 초음파 처리 지원 워크플로는 단백질과 포스포펩타이드 모두의 검출을 증가시키면서 다운스트림 CPTAC 스타일 분해, TMT 라벨링, 분별, 포스포펩타이드 농축 및 LC-MS/MS 분석 파이프라인과의 호환성을 유지했습니다.
심층 단백질체 및 인산화단백질 분석을 위한 종양 조직에서 초음파 처리 보조 단백질 추출
The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.
초음파 프로브 UP200St 단백체학에서 단백질 추출을 위한
프로토콜 적용 분야
이 절차는 다음 경우에 사용합니다:
- 신선한 냉동, 동결 분쇄 종양 조직
- 요소 기반 추출이 이미 확립된 세포 펠렛 또는 기타 생물학적 표본
- 트립틱 분해 및 선택적 TMT 라벨링을 사용한 글로벌 단백질체학 및 인단백체학 워크플로우
Li 등(2025)의 연구에 따르면 이 워크플로는 세포주, 혈액, 소변 등 다른 시료 유형에도 적용할 수 있지만 시료 유형에 따라 최적화가 필요할 수 있다고 합니다.
초음파 처리 단계가 구현된 최적화된 시료 전처리 워크플로. 최적화된 워크플로우와 실험 설계는 글로벌 단백질체 및 인산화 단백질체 분석을 위한 CPTAC 샘플 준비 프로토콜을 기반으로 합니다.
연구 및 계획: ©Li et al., 2025
일 원리
원래 연구에서는 표준 CPTAC 요소 용해 워크플로우에 초음파 처리를 추가하여 막 및 핵과 관련된 단백질의 검출이 개선되었음을 발견했습니다. 저자는 시료 크기/농도와 관련하여 초음파 처리 매개변수를 미세 조정해야 한다고 말합니다. – 소노트로드 크기, 에너지 입력, 펄스 타이밍을 선택하면 됩니다.
예를 들어, Hielscher UP200Ht 및 UP200St의 경우 이는 다음을 의미합니다:
- 진폭 및 펄스 모드를 주요 제어 변수로 사용합니다.
- 시료를 전체적으로 차갑게 유지(예: 얼음 위에 보관)
- 보수적인 설정으로 시작
- 시료 선명도, 온도, 단백질 수율 및 다운스트림 펩타이드 품질에 대한 최적화
Hielscher 200와트 초음파 균질화기 모델 UP200Ht와 UP200St는 진폭 및 펄스 설정을 조정할 수 있는 중소형 시료 용도로 설계되었으며, 두 초음파 균질화기 모두 정밀한 파라미터 조정, 자동 데이터 기록, 플러그형 온도 센서, 원격 제어, 시료 조명을 위한 디지털 터치스크린 제어 기능을 갖추고 있습니다.
초음파 처리 보조 단백질 추출용 시약
요소 용해 버퍼
사용 직전에 신선하게 준비하세요:
- 8 M 요소
- 75mM NaCl
- 50mM 삼염수, pH 8.0
- 1mM EDTA
- 2 µg/mL 아프로티닌
- 루펩틴 10µg/mL
- 1mM PMSF
- 10mM NaF
- 20 µM PUGNAc
- 포스파타제 억제제 칵테일 2, 1:100(v/v)
- 포스파타제 억제제 칵테일 3, 1:100(v/v)
요소는 첨가제를 첨가하기 전에 완전히 녹여야 하고, 억제제는 사용 직전에 첨가해야 하며, 버퍼는 얼음 위에 보관해야 하고, 첨가제 첨가 후에는 격렬한 교반보다는 소용돌이 치는 것을 권장합니다.
추가 시약:
- BCA 단백질 분석 시약
- 50mM Tris-HCl, pH 8.0
- DTT
- 요오도아세타마이드
- LysC
- 트립신
- 포름산
- 다중 정량 프로테오믹스를 사용하는 경우 TMT 시약
- 포스포펩타이드 농축을 수행하는 경우 IMAC 시약
초음파 처리 보조 단백질 추출용 장비
필수
권장 프로브 선택
약 200-1000µL의 시료의 경우 소량의 직접 고강도 처리에 적합한 직경이 작은 소노트로드를 사용합니다. Hielscher는 다양한 소노트로드 직경을 제공하며, 팁 직경이 작을수록 팁에서 더 높은 강도를 제공합니다.
실용적인 참고 사항: 과도한 거품이나 용기 벽 접촉 없이 효율적으로 혼합할 수 있는 가장 작은 프로브를 사용하세요.
동시에 여러 샘플로 작업하는 경우 다음을 고려할 수 있습니다. 멀티 튜브 소닉레이터 바이알트위터 또는 마이크로 플레이트 소닉레이터 UIP400MTP!
단계별 지침: 초음파 처리 보조 단백질 추출 절차
A. 예냉 및 준비
- 원심분리기를 4°C로 식힙니다.
- 신선한 요소 용해 완충액을 준비하여 얼음에 보관합니다.
- UP200Ht 또는 UP200St를 사운드 인클로저 내부의 스탠드에 설치합니다.
- 샘플 튜브를 똑바로 세우고 안정적으로 보관할 수 있을 만큼 충분히 큰 얼음 욕조를 준비합니다.
신선한 버퍼 준비와 저온 취급은 매우 중요합니다.
B. 초기 요소 추출
- 동결 건조된 티슈는 얼음에 보관하세요.
- 50mg 습윤 티슈당 200µL의 차가운 요소 용해 완충액을 추가합니다.
- 고속으로 5~10초 동안 소용돌이칩니다.
- 4°C에서 15분간 배양합니다.
- 보텍스 플러스 인큐베이션 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 4°C에서 10분간 20,000g으로 원심분리합니다.
- 용해물/상층액을 깨끗한 저결합 튜브로 옮깁니다.
C. UP200Ht 또는 UP200St를 사용한 초음파 처리
초음파 처리 시작 조건
- 진폭: 20~30%에서 시작
- 펄스 길이: 5초 켜짐
- 냉각: 펄스 사이에 얼음에 2분간 놓아두기
- 주기 수입니다: 4주기
- 총 활성 초음파 처리 시간: 20초
- 냉각을 포함한 총 프로세스 시간: 약 8-10분
초음파 처리 단계
- 용해물을 초음파 처리에 적합한 튜브로 옮깁니다. 열 교환이 잘되고 프로브를 안전하게 담글 수 있는 좁고 벽이 얇은 튜브를 사용합니다.
- 튜브를 얼음 욕조에 넣습니다. 이 논문에서는 열 손상을 방지하기 위해 초음파 처리 중 냉각이 중요하다고 설명합니다.
- 프로브 팁을 시료에 담급니다. 안정적인 캐비테이션을 위해 팁을 충분히 담그되 튜브 벽이나 바닥에 닿지 않도록 합니다.
- 시작 진폭에서 5초 펄스를 한 번 실행합니다.
- 즉시 샘플을 얼음에 완전히 돌려 2분간 보관합니다.
- 4주기가 완료될 때까지 반복합니다.
- 사이클 후 용해물을 검사합니다.
- 필요한 경우에만 한 번에 한 번씩 5초 펄스를 추가로 사용하고 항상 완전히 식힌 후에 계속합니다.
- 용해물이 더 균일해지고 끈적임/점성이 줄어들면 중단합니다.
엔드포인트는 연속적인 점성 흐름이 아닌 방울을 형성하는 반투명 용해물입니다. - 4°C에서 약 16,000g으로 15분간 원심분리합니다.
- 투명해진 상청액을 새 튜브로 옮기고 단백질 농도를 측정합니다.
초음파 처리된 샘플과 그렇지 않은 샘플 간의 글로벌 단백질체학 및 인산화단백질체학 비교.
a. 초음파 처리 유무에 관계없이 모든 PDX 종양 조직에서 확인된 단백질(글로벌 프로테오믹스)의 수. b. 초음파 처리 유무에 관계없이 모든 PDX 종양 조직에서 확인된 포스포펩타이드(IMAC 농축)의 수. b. 초음파 처리 유무에 관계없이 모든 PDX 종양 조직에서 확인된 포스포펩타이드의 수. 풍부도 비율이 25번째 백분위수 이상인 단백질과 포스포펩타이드만 계산되었습니다. 풍부도 비율은 동일한 유형의 샘플 간에 계산되었습니다.
연구 및 그래프: ©Li et al., 2025
다운스트림 소화 및 분석
초음파 처리 및 정화 후 원래 CPTAC 스타일 워크플로에 설명된 대로 진행합니다:
- 용해물을 1:3(v/v)으로 희석하고 50mM Tris-HCl pH 8.0으로 희석하여 요소를 다음과 같이 환원합니다. <2 M.
- 단백질 50µg당 1mAU의 LysC를 추가하고 25°C에서 2시간 배양합니다.
- 트립신을 효소:기질(w/w) 1:49로 첨가하고 25°C에서 하룻밤 동안 소화합니다.
- 포름산으로 최종 1%까지 담금질합니다.
- 필요에 따라 탈염, TMT 라벨링, 분별, 포스포펩타이드 농축 및 LC-MS/MS를 계속 진행합니다.
TMT 표지 MS에서 포스포펩타이드의 차별적 발현.
a. 초음파 처리되지 않은 샘플과 비교하여 초음파 처리된 샘플에서 상향 조절된 일부 인간 포스포펩티드(단백질 서열 시작 및 끝)를 강조하는 기저 아형. b. 초음파 처리되지 않은 샘플과 비교하여 초음파 처리된 샘플에서 상향 조절된 일부 인간 포스포펩티드(단백질_서열 시작 및 끝)를 강조하는 루멘 하위 유형. c. 초음파 처리된 종양의 기저 아형에서 상향 조절된 포스포펩타이드의 단백질을 기반으로 한 강화된 KEGG 경로. d. 초음파 처리된 종양의 루멘 아형에서 상향 조절된 포스포펩타이드의 단백질을 기반으로 한 강화된 KEGG 경로.
연구 및 그래프: ©Li et al., 2025
설계, 제조 및 컨설팅 – 독일에서 만든 품질
Hielscher 초음파는 최고의 품질과 디자인 표준으로 잘 알려져 있습니다. 견고 함과 쉬운 작동으로 초음파를 산업 시설에 원활하게 통합 할 수 있습니다. 거친 조건과 까다로운 환경은 Hielscher 초음파기로 쉽게 처리 할 수 있습니다.
Hielscher 초음파는 ISO 인증 회사이며 최첨단 기술과 사용자 친화성을 갖춘 고성능 초음파에 특히 중점을 둡니다. 물론, Hielscher 초음파는 CE를 준수하며 UL, CSA 및 RoHs의 요구 사항을 충족합니다.
멀티웰 플레이트 초음파 발생기 UIP400MTP 시료에서 고처리량 단백질 추출을 위해
문헌 / 참고문헌
- Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
- Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
- Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.
자주 묻는 질문
식물 조직과 포유류 조직에서 단백질을 추출하는 것의 차이점은 무엇인가요?
식물 세포는 셀룰로오스가 풍부한 단단한 세포벽, 풍부한 다당류, 페놀 화합물, 색소, 단백질 가용화를 방해하거나 추출물을 오염시키거나 단백질 분해를 촉진할 수 있는 활성 내인성 효소를 가지고 있기 때문에 식물 조직에서 단백질 추출은 일반적으로 포유류 조직보다 더 어렵습니다. 반면 포유류 조직은 세포벽이 없고 일반적으로 화학적 파괴가 더 쉽지만 지질, 세포 외 기질, 프로테아제가 더 많이 포함되어 있어 여전히 추출을 복잡하게 만들 수 있습니다. 따라서 식물 프로토콜은 일반적으로 더 강력한 기계적 파괴, 저온 분쇄, PVPP, 환원제 또는 페놀 기반 세척제와 같은 첨가제가 필요한 반면, 포유류 조직은 RIPA 또는 요소 기반 용해 시스템과 같은 세제 기반 완충제를 사용하여 성공적으로 처리하는 경우가 더 많습니다. 식물 조직과 포유류 조직 모두 초음파 처리를 통해 효율적으로 용해할 수 있습니다!
RIPA 버퍼를 사용하여 조직에서 단백질 추출을 개선하는 방법은 무엇입니까?
RIPA 버퍼를 사용한 조직에서 단백질 추출은 시료의 파괴와 보호를 최적화하여 개선할 수 있습니다. 가장 중요한 조치는 조직과 버퍼를 차갑게 유지하고, 새로 준비한 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 사용하고, 용해 전에 조직을 완전히 다지거나 분쇄하고, 적절한 버퍼 대 조직 비율을 유지하고, 균질화 또는 짧은 프로브 초음파 처리와 같은 기계적 파괴 단계를 추가하여 밀도가 높은 조직을 분해하고 점도를 낮추는 것입니다. 또한 용해물을 얼음 위에서 간헐적으로 혼합하면서 배양한 다음 고속 냉장 원심분리하여 불용성 이물질을 제거하면 추출 효율이 향상됩니다. 섬유질, 지질이 풍부하거나 고도로 구조화된 조직의 경우 추출을 한 번 반복하거나 세제 노출 시간을 늘리면 회수율이 향상될 수 있지만 과도한 초음파 처리나 장시간 실온 취급은 단백질 변성 또는 단백질 분해를 증가시킬 수 있으므로 피해야 합니다.
초음파 단백질 추출 시 어떤 안전 요건을 유지해야 하나요?
방음 상자 또는 적절한 청력 보호구를 착용하고 프로브 초음파 처리를 수행합니다. 소스 프로토콜은 초음파 처리 중에 발생하는 유해한 가청 소음에 대해 구체적으로 경고합니다.
보안경, 실험실 가운, 장갑을 착용하세요.
프로브를 피부에 닿지 않는 곳에 보관하고 물 튀김 방지 장치 없이 열린 용기에 초음파 처리를 하지 마십시오.
현지 화학물질 안전 규칙에 따라 PMSF 및 기타 억제제를 취급하세요.
열로 인한 단백질 손상을 줄이기 위해 샘플을 얼음에 보관하세요. 이 논문에서는 온도 관리가 중요하다고 반복해서 강조합니다.
