초음파 필터 지원 샘플 준비(FASP): 고급 초음파 처리를 통한 프로테오믹스 워크플로우 개선

초음파 필터를 이용한 시료 전처리(FASP)는 현대 프로테오믹스 분야에서 매우 효율적이고 재현 가능한 방법으로 부상하고 있습니다. 연구자들은 제어된 초음파 처리를 기존 FASP 워크플로우에 통합함으로써 단백질 추출, 분해 효율 및 전반적인 데이터 품질을 크게 개선할 수 있습니다. 높은 처리량과 재현 가능한 샘플 준비에 대한 수요가 증가함에 따라 마이크로플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP와 같은 집중 초음파 처리기가 과학적이고 실용적인 관련성을 얻고 있습니다.

과학적 맥락: 단백질체학에서 FASP가 중요한 이유

필터를 이용한 샘플 준비(FASP)는 세제, 염분 및 기타 오염 물질을 제거하면서 효율적인 효소 분해를 가능하게 하는 능력으로 인해 상향식 프로테오믹스 분야에서 황금 표준으로 자리 잡았습니다. 하지만 기존의 FASP 프로토콜은 불완전한 용해, 일관되지 않은 소화, 샘플 가변성과 관련된 한계에 직면하는 경우가 많습니다. – 특히 복잡하거나 탄력적인 생물학적 세포나 조직을 다룰 때 유용합니다.
집중된 초음파 에너지(초음파 처리)가 결정적인 이점을 제공하는 곳입니다. 초음파 처리는 기계적 전단력과 캐비테이션을 도입하여 단백질 무결성을 손상시키지 않으면서 FASP 워크플로우의 여러 중요한 단계를 개선합니다.

초음파 FASP에서 초음파 처리의 긍정적 효과

초음파 처리로 제어된 음향 캐비테이션 도입 – 미세한 기포 형성 및 붕괴 – 국부적인 전단력과 마이크로 스트리밍을 생성합니다.
초음파 처리는 질량 전달을 개선하고 반응 동역학을 가속화하여 초음파 FASP의 알킬화 및 소화 단계를 모두 향상시킵니다. 초음파 에너지를 적용하면 캐비테이션이 발생하여 국부적인 마이크로 스트리밍과 일시적인 전단력이 발생하여 시약이 단백질 매트릭스 또는 필터 환경으로 빠르게 혼합되고 효율적으로 침투할 수 있도록 촉진합니다. 알킬화 과정에서 요오도아세타미드에 의해 시스테인 잔류물이 보다 균일하고 빠르게 변형됩니다. 소화 단계에서 초음파 처리는 단백질 분해 절단 부위의 접근성을 높이고 효소-기질 상호 작용을 개선하여 트립신 활성을 가속화하고 소화 효율을 향상시킵니다. 전반적으로 초음파 처리는 처리 시간을 단축하는 동시에 반응 완전성과 재현성을 유지하거나 개선합니다.

프로테오믹스 샘플 준비에서 초음파 FASP는 다음과 같이 해석됩니다:

• 단단한 조직이나 미생물 시료에서도 보다 효율적인 세포 파괴 및 단백질 추출
• 단백질 가용성 향상
• 소화 중 효소 접근성 개선
• 처리 시간 단축 및 재현성 향상

기존의 기계적 또는 화학적 용해 방법과 달리 초음파 처리는 고도로 제어 가능하고 확장 가능하므로 표준화된 프로테오믹스 워크플로우에 특히 적합합니다.

기존 접근 방식에 비해 초음파 FASP의 장점

초음파 처리를 FASP 프로토콜에 통합하면 다운스트림 질량 분석 결과에 직접적인 영향을 미치는 측정 가능한 이점을 얻을 수 있습니다.
초음파 FASP는 특히 섬유 조직이나 생물막과 같은 까다로운 시료에서 보다 완벽한 단백질 회수를 가능하게 합니다. 균일한 에너지 분포로 복제본 전체에 걸쳐 일관된 처리를 보장하여 변동성을 줄입니다. – 정량적 단백질체학의 필수 요건입니다.
또한 초음파 처리는 효소-기질 상호작용을 개선하여 소화 동역학을 가속화합니다. 그 결과 서열 커버리지를 유지하면서 소화 시간이 단축되고 펩타이드 수율이 높아지는 경우가 많습니다.
워크플로 관점에서 초음파 시스템은 수동 개입을 줄이고 공격적인 화학 처리의 필요성을 없애 시료 무결성을 보존하고 프로토콜 표준화를 간소화합니다.

오버나이트 FASP와 비교했을 때 초음파 FASP로 확인된 단백질의 증가된 수를 보여주는 벤 다이어그램
이미지 및 연구: ©Carvalho et al., 2020

프로토콜: UIP400MTP를 사용한 고처리량 초음파 FASP

대규모 샘플 코호트를 처리하는 실험실의 경우 UIP400MTP 마이크로 플레이트 초음파 처리기를 사용하면 표준 다중 웰 플레이트(예: 96웰 플레이트)를 동시에 초음파 처리하여 처리량과 재현성을 크게 높일 수 있습니다.
이 형식에서는 초여과 또는 다운스트림 처리와 호환되는 마이크로 플레이트에서 샘플(일반적으로 웰당 50-200µL)을 직접 준비합니다. 용해 버퍼는 표준 FASP 프로토콜에서 사용되는 것과 유사합니다.

UIP400MTP는 모든 웰에 균일한 초음파 에너지를 적용합니다. 초음파 처리는 일반적으로 시료 유형에 따라 60-80% 진폭에서 2-4분 동안 수행됩니다. 플러그형 온도 센서를 사용하여 온도를 모니터링합니다. 펄스 초음파 처리 및 선택적으로 실험실 냉각기를 사용합니다.

모범적인 프로토콜입니다:

1. 알킬화 단계에서는 마이크로 플레이트 초음파 처리기(UIP400MTP)를 사용하여 샘플을 40% 진폭으로 7주기(30초 켜기, 15초 끄기, 총 초음파 처리 시간: 5분 45초) 동안 초음파 처리합니다.
2. 초음파 처리 후 원심분리를 통해 요오도아세타마이드(IAA) 용액을 제거합니다. 트립신 분해 전에 효소 활성을 억제하는 강력한 카오트로픽 물질인 잔류 요소를 제거하기 위해 시료를 세척해야 합니다. 따라서 시료를 25mM 중탄산암모늄(AmBic) 200μL로 두 번 세척합니다.
3. 그 후, 12.5mM 중탄산암모늄으로 제조된 트립신 용액(효소 대 단백질 비율 1:30) 100μL를 첨가합니다. 그런 다음 동일한 초음파 처리 조건(40% 진폭, 7주기, 30초 켜기/15초 끄기, 총 시간: 5분 45초)에서 UIP400MTP를 사용하여 단백질 분해를 수행합니다.
4. 초음파 처리 후 샘플을 필터 플레이트로 옮기거나 플레이트 기반 FASP 시스템을 사용하여 처리합니다. 환원 및 알킬화 단계는 플레이트 내에서 수행되므로 간소화된 워크플로우를 유지할 수 있습니다.
5. 트립신 분해는 통제된 조건(예: 37°C, 4-16시간)에서 수행되며, 효소 활성을 가속화하고 펩타이드 수율을 개선하기 위해 짧은 초음파 자극을 선택할 수 있습니다.
6. 펩타이드는 원심분리를 통해 회수되며 LC-MS/MS 분석을 위해 준비됩니다.

이 시스템의 주요 장점은 모든 웰에서 동일한 처리 조건을 제공하여 배치 효과를 최소화하고 대규모 프로테오믹스 연구에서 강력한 정량적 비교를 가능하게 한다는 점입니다.

설계, 제조 및 컨설팅 – 독일에서 만든 품질

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문헌 / 참고문헌