High-Throughput Protein Digestion을 통한 단백질체학 워크플로우

단백질체학은 생물학적 과정과 시스템을 이해하는 데 필수적인 분야이며, 단백질 분해는 워크플로우에서 중요한 단계를 형성합니다. 전통적으로 단백질 분해는 트립신과 같은 단백질 분해 효소를 사용하여 용액에서 수행되며, 트립신은 라이신과 아르기닌 잔기에서 펩타이드 결합을 특이적으로 가수분해합니다. 이 공정은 질량분석법(MS) 응용 분야에서 이온화 및 단편화에 적합한 펩타이드를 생성합니다. 그러나 기존의 분해 방법은 완료하는 데 12-24시간이 소요되어 단백질체 워크플로우에서 심각한 병목 현상을 일으킵니다.
초음파는 소화 시간을 몇 시간에서 단 몇 분으로 획기적으로 단축하는 강력한 대안을 제공합니다. Hielscher CupHorn, VialTweeter 및 96 웰 플레이트 초음파 발생기 UIP400MTP와 같은 고급 다중 샘플 초음파 발생기와 결합하면 초음파는 가속화 된 고 처리량 단백질체학을 가능하게합니다. 이러한 기술은 워크플로우를 간소화하여 재현성이나 데이터 품질을 손상시키지 않으면서 시료 전처리 시간을 단축하고 효율성을 높입니다.

단백질 소화에서 초음파 에너지의 역할

초음파는 집중 된 초음파를 사용하여 캐비테이션 (캐비테이션)을 생성하며, 강렬한 전단력을 생성하기 위해 붕괴되는 국부적 인 마이크로 버블입니다. 이 현상은 질량 전달을 향상시키고, 효소와 기질의 혼합을 촉진하며, 단백질 구조를 풀어 절단 부위를 트립신과 같은 단백질 분해 효소에 노출시킵니다.
그 결과는 어떠하였습니까? 효율성이나 재현성을 손상시키지 않고 분해 시간을 크게 단축합니다.

Ultrasonic-Enhanced Proteolytic Digestion: 방법론 및 결과

가속 분해 프로토콜(Accelerated Digestion Protocol)

초음파 보조 분해는 단백질 분해 효소와 초음파 에너지를 결합하여 워크플로우를 가속화합니다. 예를 들어, Hielscher UP200St-CupHorn (200W, 26kHz)을 사용하여 분해 워크 플로우는 다음과 같이 진행됩니다.

1. 환원: 단백질 샘플(0.5mg/mL, 20μL)은 중탄산암모늄 완충액(12.5mM)에서 DTT(2μL, 110mM)로 처리합니다. 초음파 처리는 5 분 동안 50 % 진폭으로 적용됩니다.
2. 알킬화 : IAA (2 μL, 400 mM)를 첨가 한 후 동일한 조건에서 초음파 처리를 반복합니다.
3. 분해: 시료를 고정화된 트립신 나노입자로 희석하고 배양합니다. 마지막 초음파 처리 (5 분)는 소화를 완료합니다. 펩타이드는 MS 분석을 위해 분리, 건조 및 보관됩니다.

이 초음파 방법은 총 준비 시간을 12 시간에서 30 분 미만으로 줄입니다. 가속화된 공정에도 불구하고 펩타이드 수율과 품질은 기존의 야간 분석법과 동일하게 유지됩니다.

초음파 단백질 분해의 효율성

E. coli 단백질체를 사용한 비교 연구에서:

• 단백질 식별: 초음파로 소화된 샘플은 5분 만에 777개의 단백질을 식별한 반면, 12시간 동안에는 817개의 단백질을 식별했습니다. 공유 단백질 식별은 70%를 초과했습니다.
• 재현성: 반복실험 분석에서는 각 방법 내에서 98% 이상의 상관 관계가 나타나 신뢰성을 입증했습니다.
• 선택성: 특정 단백질은 각 방법에 의해 우선적으로 소화되었으며, 초음파 소화는 65 개의 단백질을, 야간 소화는 54 개의 단백질을 선호했습니다. 이러한 미묘한 차이는 특정 응용 분야에 대한 초음파의 독특한 잠재력을 강조합니다.

E. coli에 스파이크된 7개의 단백질을 무표지 단백질로 정량화합니다.
견본. 다음 단백질은 열에 명시된 바와 같이 두 가지 다른 수준으로 추가되었습니다
"테오 비율"로 명명됩니다. Theo Ratio는 여기에 사용된 두 수준 간의 이론적 비율입니다
실험. 소 혈청 알부민(ALBU), β-락토글로불린(LACB), α-S1 카제인(CASA1),
α-S2 카제인(CASA2), 사이토크롬 c(CYC), 오브알부민(OVAL) 및 탄산 무수화효소 2
(CAH2). 비율은 MaxQuant에서 얻은 LFQ 단백질 강도를 사용하여 계산되었습니다
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
연구 및 그래픽: © Martins et al., 2019)

나노입자 고정화 트립신

고정화된 트립신 나노입자(예: T-FMNPs)와 초음파의 통합은 단백질체학 워크플로우를 더욱 향상시킵니다. 이러한 나노 입자는 효소-기질 상호 작용을 위한 높은 표면적을 제공하여 효율성을 높입니다. E. coli와 같은 복잡한 단백질체에 적용할 때 결합된 방법은 다음을 달성합니다.

• 속도: 5분 이내에 소화를 완료합니다.
• 정밀: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• 확장성: UIP400MTP와 같은 멀티웰 플랫폼에 적응하면 고처리량 처리가 가능합니다.

단계별 지침이 포함된 자세한 프로토콜을 보려면 여기를 클릭하십시오!
(참조: Martins et al., 2019)

Hielscher 초음파 발생기를 사용한 고속 및 고처리량의 단백질 분해 분해

단백질체학을 위한 최고의 초음파 발생기 모델

Hielscher 초음파는 동시 다중 샘플 준비를위한 다양한 초음파 발생기 모델을 제공하여 고부하 워크 플로우를 용이하게합니다. 바이알, 시험관, 멀티웰 플레이트(예: 6웰, 24웰, 96웰 플레이트) 또는 페트리 접시로 작업하는지 여부 – 우리는 귀하의 실험에 이상적인 초음파 발생기를 제공합니다.

UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 발생기

최고의 처리량을 위해 이 UIP400MTP는 96웰 플레이트를 초음파로 처리할 수 있는 기능을 제공합니다. 모든 표준 마이크로플레이트와 호환되는 이 UIP400MTP은 고가의 독점 일회용품이 필요하지 않으며 연구에 가장 적합한 멀티웰 플레이트를 자유롭게 선택할 수 있습니다. 플레이트 전체에 균일한 에너지를 전달함으로써 단 1시간 만에 최대 200개의 복잡한 단백질체의 빠른 환원, 알킬화 및 분해를 가능하게 합니다. 이러한 수준의 자동화 및 효율성은 고처리량 단백질체학 및 임상 응용 분야에 매우 중요합니다. 멀티웰 플레이트 초음파 발생기에 대해 자세히 알아보십시오!

바이알트위터

VialTweeter는 최대 10 개의 바이알 또는 시험관의 동시 초음파 처리가 필요한 실험실에 적합합니다. 비침습적 접근 방식은 교차 오염 위험을 제거하는 동시에 재현성 있는 단백질 분해를 보장합니다. 이 장치는 제한된 양의 시료 또는 다양한 시료 유형을 다루는 연구자에게 이상적입니다.
VialTweeter 멀티 튜브 초음파 발생기에 대해 자세히 알아보십시오!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn 초음파 발생기는 밀폐 된 용기에서 여러 샘플을 동시에 처리하도록 설계된 강력한 장치입니다. 균일한 초음파 에너지 분포와 정확한 온도 제어를 보장합니다. 최대 5개의 시료를 동시에 처리할 수 있는 능력과 환원, 알킬화 및 분해 워크플로우와의 호환성이 결합된 CupHorn은 MS 기반 단백질체학을 위한 신뢰할 수 있는 도구입니다.
CupHorn SonoReactor에 대해 자세히 알아보세요!

Nanoparticle-Immobilized Trypsin을 사용한 초음파 보조 단백질 분해를 위한 단계별 프로토콜

Martins et al. (2019)의 이 프로토콜은 초음파 에너지와 나노입자 고정 트립신(T-FMNPs)을 사용하여 빠른 단백질 분해에 최적화되어 있습니다. 간략하게 설명된 단계는 질량 분석법(MS) 응용 분야에 적합한 효율적인 환원, 알킬화 및 단백질 분해를 보장합니다.
프로토콜 단계

1. 이황화 결합의 감소
   • AmBic 완충액의 20μL 단백질 샘플(0.5mg/mL)에 2μL의 DTT 용액(110mM)을 추가합니다.
   • 샘플 튜브를 초음파 증폭기 UP200St-CupHorn에 넣습니다.
   • 50% 진폭(200W, 26kHz)에서 2.5분 동안 샘플을 초음파 처리합니다.
   • 냉각을 위해 잠시 멈춘 다음 동일한 조건에서 2.5분 더 초음파 처리합니다.
2. 환원된 시스테인 잔기의 알킬화
   • 환원된 단백질 샘플에 2μL의 IAA 용액(400mM)을 추가합니다.
   • 알킬화를 촉진하기 위해 50% 진폭에서 2.5분 동안 초음파 처리합니다.
   • 냉각을 위해 일시 중지한 다음 추가로 2.5분 동안 초음파 처리합니다.

   참고: IAA 분해를 방지하기 위해 알킬화된 샘플의 빛에 대한 노출을 최소화하십시오.

3. 시료 희석
   • 4% 아세토니트릴(v/v)을 함유한 25mM AmBic 완충액을 사용하여 알킬화된 단백질 샘플을 최종 부피 100μL로 희석합니다.
   • 부드러운 피펫팅으로 철저히 섞습니다.
4. Nanoparticle-Immobilized Trypsin을 사용한 단백질 분해
   • 희석된 단백질 샘플에 20μL의 T-FMNP 용액(3mg/mL)을 추가합니다.
   • 50 % 진폭에서 2.5 분 동안 초음파 증폭기에서 혼합물을 초음파 처리합니다.
   • 냉각을 위해 일시 중지한 다음 동일한 조건에서 2.5분 더 초음파 처리합니다.
5. 트립신 나노입자의 분리
   • 자석을 사용하여 분해된 펩타이드를 함유한 상층액에서 T-FMNP를 분리합니다.
   • 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
6. MS 분석을 위한 펩타이드 준비
   • 펩타이드가 포함된 상층액을 진공 원심분리기에서 건조시킵니다.
   • 질량 분석법으로 추가 분석할 때까지 건조된 펩타이드를 -20°C에서 보관합니다.