고처리량 단백질 소화를 통한 단백질체학 워크플로

단백질체학은 생물학적 과정과 시스템을 이해하는 데 필수적인 분야이며, 단백질 소화는 그 워크플로에서 핵심적인 단계입니다. 전통적으로 단백질 소화는 라이신과 아르기닌 잔기의 펩타이드 결합을 특이적으로 가수분해하는 트립신과 같은 단백질 분해 효소를 사용하여 용액 내에서 수행합니다. 이 과정에서는 질량분석(MS) 응용 분야의 이온화와 단편화에 적합한 펩타이드가 생성됩니다. 그러나 기존 소화 방법은 완료까지 12–24시간이 걸려 단백질체학 워크플로에 상당한 병목 현상을 일으킵니다.
초음파 처리는 소화 시간을 수 시간에서 단 몇 분으로 대폭 단축하는 강력한 대안을 제공합니다. Hielscher CupHorn, VialTweeter 및 96웰 플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP와 같은 첨단 다중 시료 초음파 처리기와 결합하면 초음파 처리를 통해 신속한 고처리량 단백질체학 분석이 가능해집니다. 이러한 기술은 재현성이나 데이터 품질을 저하시키지 않으면서 시료 준비 시간을 줄이고 효율을 높여 워크플로를 간소화합니다.

단백질 소화에서 초음파 에너지의 역할

초음파 처리는 집속 초음파를 이용하여 캐비테이션을 발생시킵니다. 캐비테이션은 국소적인 미세 기포가 붕괴하면서 강력한 전단력을 발생시키는 현상입니다. 이 현상은 물질 전달을 향상하고 효소와 기질의 혼합을 촉진하며 단백질 구조를 펼쳐 트립신과 같은 단백질 분해 효소에 절단 부위를 노출합니다.
그 결과는 무엇일까요? 효율이나 재현성을 저하시키지 않으면서 소화 시간이 크게 단축됩니다.

초음파로 향상된 단백질 분해 소화: 방법 및 결과

소화 가속화 프로토콜

초음파 보조 소화는 단백질 분해 효소와 초음파 에너지를 결합하여 워크플로를 가속화합니다. 예를 들어 Hielscher UP200St-CupHorn(200 W, 26 kHz)을 사용하면 소화 워크플로는 다음과 같이 진행됩니다:

1. 환원: 중탄산암모늄 완충액(12.5 mM)에서 단백질 시료(0.5 mg/mL, 20 µL)를 DTT(2 µL, 110 mM)로 처리합니다. 50% 진폭으로 5분간 초음파 처리를 수행합니다.
2. 알킬화: IAA(2 µL, 400 mM)를 첨가한 후 동일한 조건에서 초음파 처리를 반복합니다.
3. 소화: 시료를 희석하고 트립신이 고정화된 나노입자와 함께 배양합니다. 마지막 초음파 처리(5분)로 소화를 완료합니다. 펩타이드를 분리하고 건조한 후 MS 분석을 위해 보관합니다.

이 초음파 방법은 총 준비 시간을 12시간에서 30분 미만으로 줄입니다. 과정이 가속화되었음에도 펩타이드 수율과 품질은 기존의 밤샘 처리 방법과 동등하게 유지됩니다.

초음파 단백질 소화의 효율

E. coli 단백질체를 이용한 비교 연구에서:

• 단백질 동정: 초음파로 소화한 시료에서는 5분 만에 777개의 단백질이 동정된 반면, 비교 방법에서는 12시간 동안 817개가 동정되었습니다. 두 방법에서 공통으로 동정된 단백질의 비율은 70%를 초과했습니다.
• 재현성: 반복 분석에서 각 방법 내 상관값이 98%를 초과하여 신뢰성이 입증되었습니다.
• 선택성: 각 방법은 특정 단백질을 우선적으로 소화했으며, 초음파 소화에서는 65개의 단백질이, 밤샘 소화에서는 54개의 단백질이 우선적으로 소화되었습니다. 이러한 미묘한 차이는 특정 응용 분야에서 초음파 처리가 지닌 고유한 잠재력을 부각합니다.

E. coli
시료에 첨가한 일곱 가지 단백질의 비표지 단백질 정량 결과. 다음 단백질을
“Theo Ratio”라는 이름의 열에 표시된 서로 다른 두 수준으로 첨가했습니다. Theo Ratio는 이
실험에 사용된 두 수준 간의 이론적 비율입니다. 소 혈청 알부민(ALBU), β-락토글로불린(LACB), α-S1 카제인(CASA1),
α-S2 카제인(CASA2), 시토크롬 c(CYC), 오브알부민(OVAL) 및 탄산무수화효소 2
(CAH2). 비율은 MaxQuant
분석에서 얻은 LFQ 단백질 강도를 사용하여 계산했습니다. 각 방법으로 얻은 값을 비교하기 위해 스튜던트 t 검정을 적용했습니다(p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
연구 및 그래픽: © Martins et al., 2019)

나노입자에 고정화된 트립신

고정화 트립신 나노입자(예: T-FMNPs)와 초음파 처리를 결합하면 단백질체학 워크플로를 더욱 개선할 수 있습니다. 이러한 나노입자는 효소와 기질 간 상호작용을 위한 넓은 표면적을 제공하여 효율을 높입니다. 이 결합 방법을 대장균과 같은 복잡한 단백질체에 적용하면 다음과 같은 결과를 얻을 수 있습니다:

• 속도: 5분 이내에 소화를 완료합니다.
• 정확도: 기존 방법과 동등한 수준의 단백질 정량 결과를 제공합니다(p > 0.01, n=3).
• 확장성: UIP400MTP와 같은 멀티웰 플랫폼에 적용하면 고처리량 처리가 가능합니다.

단계별 지침이 포함된 상세 프로토콜을 보려면 여기를 클릭하세요!
(Martins et al., 2019 참조)

Hielscher 초음파 처리기를 이용한 고속 및 고처리량 단백질 소화

단백질체학을 위한 최고의 초음파 처리기 모델

Hielscher Ultrasonics는 여러 시료를 동시에 전처리하여 고처리량 워크플로를 구현할 수 있는 다양한 초음파 처리기 모델을 제공합니다. 바이알, 시험관, 멀티웰 플레이트(예: 6웰, 24웰, 96웰 플레이트) 또는 페트리 접시 중 무엇을 사용하든 – 실험에 이상적인 초음파 처리기를 제공합니다.

UIP400MTP 멀티웰 플레이트 초음파 처리기

최고의 처리량을 위해 UIP400MTP는 96웰 플레이트를 초음파로 처리할 수 있는 기능을 제공합니다. 모든 표준 마이크로플레이트와 호환되는 UIP400MTP는 고가의 전용 소모품이 필요하지 않으며, 연구에 가장 적합한 멀티웰 플레이트를 자유롭게 선택할 수 있도록 합니다. 플레이트 전체에 균일한 에너지를 전달하여 단 1시간 만에 최대 200개의 복잡한 단백질체를 신속하게 환원, 알킬화 및 소화할 수 있습니다. 이러한 수준의 자동화와 효율은 고처리량 단백질체학 및 임상 응용 분야에 매우 중요합니다. 멀티웰 플레이트 초음파 처리기에 대해 자세히 알아보세요!

VialTweeter

VialTweeter는 최대 10개의 바이알 또는 시험관을 동시에 초음파 처리해야 하는 실험실에 맞춰 설계되었습니다. 비침습적 방식으로 교차 오염 위험을 제거하면서 재현성 있는 단백질 소화를 보장합니다. 이 장치는 제한된 시료 부피나 다양한 시료 유형을 다루는 연구자에게 이상적입니다.
VialTweeter 다중 튜브 초음파 처리기에 대해 자세히 알아보세요!

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn 초음파 처리기는 밀봉된 용기에 담긴 여러 시료를 동시에 처리하도록 설계된 강력한 장치입니다. 균일한 초음파 에너지 분포와 정밀한 온도 제어를 보장합니다. 최대 다섯 개의 시료를 동시에 처리할 수 있는 기능과 환원, 알킬화 및 소화 워크플로와의 호환성을 갖춘 CupHorn은 MS 기반 단백질체학을 위한 신뢰할 수 있는 도구입니다.
CupHorn SonoReactor에 대해 자세히 알아보세요!

나노입자에 고정화된 트립신을 이용한 초음파 보조 단백질 소화의 단계별 프로토콜

Martins et al. (2019)의 이 프로토콜은 초음파 에너지와 나노입자에 고정화된 트립신(T-FMNPs)을 이용한 신속한 단백질 소화에 최적화되어 있습니다. 제시된 단계는 질량 분석법(MS) 응용에 적합한 효율적인 환원, 알킬화 및 단백질 분해를 보장합니다.
프로토콜 단계

1. 이황화 결합의 환원
   • AmBic 완충액에 담긴 20 µL의 단백질 시료(0.5 mg/mL)에 DTT 용액(110 mM) 2 µL를 첨가합니다.
   • 시료 튜브를 초음파 반응기 UP200St-CupHorn에 넣습니다.
   • 진폭 50%에서 시료를 2.5분 동안 초음파 처리합니다(200 W, 26 kHz).
   • 냉각되도록 잠시 중단한 다음, 동일한 조건에서 2.5분 동안 추가로 초음파 처리합니다.
2. 환원된 시스테인 잔기의 알킬화
   • 환원된 단백질 시료에 IAA 용액(400 mM) 2 µL를 첨가합니다.
   • 알킬화를 촉진하기 위해 진폭 50%에서 2.5분 동안 초음파 처리합니다.
   • 냉각을 위해 중단한 다음, 2.5분 동안 추가로 초음파 처리합니다.

   참고: IAA의 분해를 방지하기 위해 알킬화된 시료의 빛 노출을 최소화합니다.

3. 시료 희석
   • 4% 아세토니트릴(v/v)이 함유된 25 mM AmBic 완충액을 사용하여 알킬화된 단백질 시료를 최종 부피 100 µL로 희석합니다.
   • 부드럽게 피펫팅하여 충분히 혼합합니다.
4. 나노입자에 고정화된 트립신을 이용한 단백질 소화
   • 희석된 단백질 시료에 T-FMNP 용액(3 mg/mL) 20 µL를 첨가합니다.
   • 초음파 반응기에서 혼합물을 50% 진폭으로 2.5분 동안 초음파 처리합니다.
   • 냉각을 위해 잠시 중단한 다음, 동일한 조건에서 추가로 2.5분 동안 초음파 처리합니다.
5. 트립신 나노입자 분리
   • 자석을 사용하여 소화된 펩타이드가 포함된 상층액에서 T-FMNPs를 분리합니다.
   • 상층액을 새 미세원심분리 튜브로 옮깁니다.
6. MS 분석을 위한 펩타이드 준비
   • 펩타이드가 포함된 상층액을 진공 원심분리기에서 건조합니다.
   • 건조된 펩타이드는 후속 질량분석을 수행할 때까지 -20°C에서 보관합니다.