• DNA와 RNA 전단 도중, DNA 분자는 더 작은 조각으로 나뉩습니다. DNA/RNA 단편화는 차세대 시퀀싱(NGS)에 대한 라이브러리를 만드는 데 필요한 중요한 샘플 준비 단계 중 하나입니다.
• 초음파 DNA 전단은 음향 캐비테이션의 힘을 이용하여 DNA 나 RNA를 100 개 조각으로 나눕니다. – 5kb bp.
• 초음파 전단은 정확한 DNA 단편화 및 원하는 DNA 길이에 대한 적응을 허용합니다.

초음파를 이용한 DNA 전단

Hielscher Ultrasonics는 DNA, RNA 및 염색질 전단을위한 다양한 초음파 기반 솔루션을 제공합니다. 마이크로 팁을 사용하여 직접 초음파 처리를위한 프로브 유형 초음파기 (예 : UP100H) 중에서 선택하거나 다양한 샘플의 간접 DNA 준비를 위해 VialTweeeter 또는 초음파 cuphorn을 사용하십시오. Hielscher는 귀하의 요구를 고려한 이상적인 장치를 제공합니다 : 1 또는 최대 10 개의 샘플을 보유하고 있으며, 마이크로 리터에서 리터 볼륨까지 – Hielscher 초음파 프로세서는 DNA, RNA 및 염색질 조각을 올바른 길이로 준비하기위한 요구 사항을 충족합니다. 재현성, 쉬운 작동 및 정밀한 제어로 차세대 시퀀싱을위한 신뢰할 수있는 라이브러리를 제공합니다.
효소 DNA 단편화와 달리, 초음파 전단은 화학 물질을 추가하지 않고 순수 기계적 전단력을 적용합니다. 공정 매개 변수의 정확한 설정에 의해 초음파 전단은 고 분자량 DNA 단편 (플라스미드 및 게놈 DNA)을 생산합니다.
정제 된 핵산은 단편화 단계 이전 또는 이후에 증폭 될 수있다.
Sonication 매개 변수 (전력, 펄스주기 / 버스트, 시간 및 온도)는 소프트웨어 설정을 통해 안전하게 제어 할 수 있습니다.

초음파 DNA 절단을위한 프로토콜

크로마 틴 면역 침전 분석

간략하게, 세포를 60mm 직경 접시 (접시 당 400,000 개)에 플레이 팅하고, RhoA siRNA로 트랜 스펙 션 하였다 (기재된 바와 같이). 72 시간 후 37 ℃에서 10 분간 포름 알데히드 (최종 농도, 1 %)와 함께 항온 배양하여 단백질을 DNA에 가교 결합시켰다. 가교 결합 반응을 1.25 mol / L 글리신의 10 분의 1 부피 첨가로 켄칭시켜 최종 농도 125 mmol / L를 얻었다. 세포를 얼음 냉각 된 PBS로 2 회 세척하고, 방사 면역 침전 분석 완충액 [150 mmol / L NaCl, 1 % NP40, 0.5 % 데 옥시 콜레이트, 0.1 % SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0 )] 1 밀리몰 / L 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드, 1 Ag / mL 아프로 티닌 및 1 Ag / mL 펩 스타틴 A를 함유하고, 빙상에서 30 분간 유지 하였다. 그런 다음, 세포 용 해물을 히엘 샤 UP200S 교차 결합 된 크로 미틴이 전단되어 200 및 1,000 bp 사이의 DNA 단편을 생성 할 때까지 초음파 초음파기 (3 x 40 s, 진폭 40 %, 사이클 1, Hielscher Ultrasonics GmbH)에 넣었다. 전체 용 해물의 10 분의 1이 다른 샘플에 존재하는 DNA의 양을 정량하는데 사용되었고 “총 입력 DNA”. 상등액을 비특이적 배경을 줄이기 위해 연어 정자 DNA / 단백질 아가 로즈 - 50 % 슬러리와 함께 배양 하였다. Immunoprecipitation은 항 -NF-nB p65 (Upstate) 5㎍ 또는 항체가없는 대조군 (negative control)으로 4 ℃에서 밤새 처리 하였다. 이 상등액에 5 mol / L NaCl을 보충하고 65 ° C에서 밤새 가열하여 단백질 -DNA 가교 결합을 되 돌렸다. 면역 복합체를 DNase- 및 RNase-free 프로 테이나 제 K로 처리하고, DNA를 페놀 / 클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제 하였다. PCR은 인간 iNOS 유전자의 프로모터 영역 내의 서열 (p1 프라이머 : 5 ㎍-GAGGGCTTTCCCA-GAACCAAG-3 ㎍, p2 프라이머 : GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3 ¶)에 상응하는 특정 프라이머로 수행 하였다. (Doublier et al., 2008)

EGFP 발현 연구

발현 연구를 위해, EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), 염색체 ssu 통합 유전자에 대한 재조합 균주 L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Germany)를 전술 한 바와 같이 다양한 배지에서 배양하고, 추가로 100 mg l을 보충^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, Germany). 배양 중에 1ml의 샘플을 취하여 원심 분리 (2000 × g, 20 ℃, 10 분)하고 0.9 % NaCl 용액으로 세척 하였다. 펠렛을 완충액 (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT)에 재현 탁하고 초음파 처리기로 초음파 분해하여 분해시켰다 UP400S (~ 400W의 에너지 적용). 세포 파편을 원심 분리 (6000 × g, 4 ℃, 5 분)에 의해 제거하고 12.5 % 폴리 아크릴 아미드 겔을 갖는 Laemmli (1970)의 방법에 따라 환원 조건 하에서 소듐 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) . EGFP 발현은 교반 된 배양에서 검사 하였다. (Fritsche 외. 2007)

크로마 틴 면역 침전

염색질 면역 침전 분석은 ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA)를 제조사의 지시 사항에 따라 수정 하였다. 간단히 말하면, 분화 된 인간 배 세포를 실온에서 10 분 동안 1 % 포름 알데히드로 가교 결합시켰다. 세포를 얼음으로 찬 PBS로 세척하고 0.125M 글리신을 실온에서 5 분간 첨가하여 고정 반응을 중단시켰다. 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 다시 세척하고 접시에서 긁어 냈다. 세포를 원심 분리에 의해 펠렛 화하고 용해 완충액에 재현 탁시켰다. 원심 분리 후, 펠렛 화 된 핵을 전단 완충액에 재현 탁하고, 얼음에서 30 분 동안 인큐베이션하고, 염색질을 초음파 처리 (예 : UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germany)에서 각각 약 20-6 초당 25 펄스의 전력으로 약 200-600 bp의 단편으로 얼음 위에서 20 초 동안 세척한다. 전단 된 염색질을 원심 분리하고 상등액을 수집 하였다. 면역 침전을 위해 60 μl의 염색질을 1 ㎍의 Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) 또는 NF-κB p50 (Abcam) 항체 또는 토끼 IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA)를 음성 대조군으로 4 ℃에서 완만하게 회전시켰다. 자성 비드에 결합 된 면역 복합체를 자성 스탠드를 사용하여 수집하고 광범위하게 세척하고 단백질 / DNA 교차 결합을 역전시키고 DNA를 실시간 PCR 분석을 위해 용리시켰다. (Ristola 외. 2009)

칩 어레이 분석을위한 EHEC DNA 준비

세포 용 해물과 추출 된 DNA의 배열
원하는 최종 농도로 PBS에 현탁 된 박테리아 펠렛을 초음파 파쇄기 UP100H (Hielscher GmbH, Germany)에 마이크로 팁 MS1 (직경 1mm)이 장착되어있다. 동작 주파수는 30 kHz이고 유효 출력 전력은 100 W였다. 동작 동안, 샘플을 얼음 - 수조에서 냉각시키고, 혼합하고 원심 분리 하였다. 샘플은 유동 세포 계측법 연구를 위해 사용되었으며 이후 처리를 위해 샘플은 열처리 (95 ℃, 5 분)를 받았다. 조 세포 용해질을 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1)의 혼합물로 처리 하였다. 이 혼합물의 동일한 부피를 lysate 시료에 첨가하고, 용액을 15 초 동안 격렬하게 vortex 한 후, 실온 (RT) 약 22 ℃에서 15,000 xg에서 2 분간 원심 분리 하였다. 게놈 DNA를 함유하는 상부 수성 상을 조심스럽게 분리하고 새로운 무균의 에펜 도르프 튜브에 수집 하였다.
이어서, 샘플을 초음파 처리하여 DNA를 단편화 하였다. 초음파 처리 단계는 전술 한 바와 동일한 조건에서 실현되었다. 게놈 DNA에 대한 단편화 효과를 평가하기 위해 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 샘플을 분석 하였다.
(…) 2.5 분 동안 이전에 초음파 처리 된 샘플을 열처리 및 원심 분리 후 추출 단계에 적용 하였다. 방출 된 DNA를 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 혼합물로 2 회 추출한 후, 0 내지 15 분 동안 제 2 초음파 처리 하였다. 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 추출 후 초음파 분열을 실시한 DNA의 크기 분포를 측정 하였다 (그림 오른쪽 상단). 2.5 분 이상 초음파 처리 한 샘플에서 제거 된 고 분자량 밴드보다는 DNA 스미어가있는 것으로부터 분열 된 DNA가 분명하게 나타납니다. 장시간 초음파 처리는 약 150-600 bp로 점차적으로 분절 길이를 감소 시켰고, 15 분 동안 초음파 처리 한 결과는 대부분이 번짐의 윗부분에서 볼 수 있듯이 이들 단편을 더욱 열화시켰다. 따라서, 평균 DNA 단편 크기는 초음파 처리 시간에 따라 점차적으로 감소하고 5 분 처리는 칩 어레이 분석에 가장 적합한 DNA 단편의 크기를 얻을 수있게한다. 마지막으로, DNA 처리 (DNA 추출 (2x)) 및이어서 5 분 초음파 처리 (ultrasonic treatment)의 2 분간의 초음파 처리를 포함하는 DNA 분석 물 제조 절차가 확립되었다. (Basselet 외. 2008)

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

HEK293 세포를 상기 한 바와 같이 배양하고 실온에서 45 분 동안 2 mM 디 숙신 이미 딜 - 글 루타 레이트로 고정시켰다. 이어서, 세포를 PBS로 2 회 세정 하였다. 크로마토 그래피는 1 % (v / v) 포름 알데히드를 사용하여 실온에서 10 분간 가교 결합시키고 얼음으로 찬 PBS로 2 회 세척 하였다. 가교 결합 반응은 실온에서 5 분 동안 0.125 M의 최종 농도에서 글리신과의 인큐베이션에 의해 중단되었다. 트립신과 배양 한 후, 세포를 세포 배양 접시에서 긁어 내고 PBS로 두 번 세척 하였다. 세포 펠릿을 용해 완충액 (5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl 및 0.5 % (v / v) Nonidet P-40)에 재현 탁시키고, 얼음 위에서 10 분 동안 인큐베이션하고, Dounce 균질기로 균질화시켰다. 그 후 핵을 원심 분리 (3500 xg, 5 분, 4 ℃)하여 펠렛 화하고 핵 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA 및 1 % (w / v) SDS)에 재현 탁한다. 핵을 3 회의 20 초 펄스로 초음파 처리하여 UP50H 초음파기 (Hielscher Ultraschall Technologie)를주기 0.5와 진폭 30 %로 설정하여 벌크 크기가 200 ~ 1000 bp 인 게놈 DNA 단편을 얻었다. ChIP의 경우, 면역 침전 완충액 (16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1 % (v / v) Triton X-100 및 0.01 % v) SDS). (Weiske 외. 2006)

염색질 면역 침전 (ChIP)에 의한 히스톤 수정 분석

간단히 말해, 6 x 10⁶ 세포를 PBS로 2 회 세척하고 0.5 % 포름 알데히드의 존재하에 실온에서 15 분 동안 배양 플레이트상에서 가교 결합시켰다. 교차 결합 반응은 0.125M 글리신을 첨가함으로써 중단되었다. 모든 후속 단계는 48 ℃에서 수행되었다. 모든 완충액은 미리 냉각시키고 프로 테아 제 억제제 (Complete Mini, Roche)를 함유하고 있습니다. 세포를 PBS로 2 회 세척 한 후 긁어 냈다. 수집 된 펠릿을 1 ml 용해 완충액 (1 % SDS, 5 mM EDTA, 50 mM 트리스 pH 8)에 용해시키고, 100 % 진폭에서 10 사이클 동안 냉 에탄올 욕에서 초음파 처리 하였다. UP50H 초음파기 (Hielscher, Teltow, Germany). 염색질 단편화를 1 % 아가 로스 겔에서 시각화 하였다. 얻은 조각은 200-500pb 범위에 있었다. 가용성 염색질은 초음파 처리 된 시료를 14,000g에서 48 분간 10 분간 원심 분리하여 얻은 것이다. 가용성 분획을 희석 완충액 (1 % Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris pH 8, 150mM NaCl)에 1/10 희석 한 다음 분주하고 80 ℃에서 사용할 때까지 보관 하였다. (로드리게스 외. 2008)