초음파 DNA 전단

DNA 및 RNA 전단 과정에서는 긴 DNA 분자를 더 작은 조각으로 단편화하며, 이는 차세대 염기서열 분석(NGS) 라이브러리 구축을 위한 시료 준비의 핵심 단계입니다. 초음파 DNA 전단은 음향 캐비테이션의 힘을 이용하여 DNA 또는 RNA를 100 bp에서 5 kb 범위의 단편으로 분해합니다. 이 방법은 단편 크기를 정밀하게 제어할 수 있어 최적의 염기서열 분석 결과를 얻기 위해 원하는 DNA 길이에 맞출 수 있습니다.

초음파 처리를 이용한 DNA 전단

Hielscher Ultrasonics는 DNA, RNA 및 염색질 전단을 위한 다양한 초음파 기반 솔루션을 제공합니다. 마이크로팁을 사용한 직접 초음파 처리를 위해 프로브형 초음파 처리기(예: UP100H)를 선택하거나, 다양한 시료의 DNA를 동시에 간접적으로 준비하기 위해 VialTweeeter 또는 초음파 cuphorn을 사용할 수 있습니다. Hielscher는 고객의 요구를 고려한 이상적인 장치를 제공합니다. 시료 수가 1개이든 최대 10개이든, 부피가 마이크로리터에서 리터에 이르든 – Hielscher 초음파 처리기는 적절한 길이의 DNA, RNA 및 염색질 단편을 준비하기 위한 고객의 요구를 충족합니다. 재현성, 간편한 조작 및 정밀한 제어를 통해 차세대 염기서열 분석을 위한 신뢰할 수 있는 라이브러리를 구축할 수 있습니다.
효소적 DNA 단편화와 달리 초음파 전단은 화학물질을 전혀 첨가하지 않고 순수한 기계적 전단력을 가합니다. 공정 매개변수를 정밀하게 설정하면 초음파 전단으로 고분자량 DNA 단편(플라스미드 및 유전체 DNA)을 생성합니다.
정제된 핵산은 단편화 단계 전이나 후에 증폭할 수 있습니다.
초음파 처리 매개변수(출력, 펄스 주기 / 버스트, 시간 및 온도)는 소프트웨어 설정을 통해 안전하게 제어할 수 있습니다.

초음파 DNA 전단 프로토콜

염색질 면역침강 분석용

간략히 설명하면, 세포를 직경 60mm 배양 접시에 접종하고(접시당 400,000개) RhoA siRNA로 형질주입하였다(기술된 방법에 따름). 72 h 후, 단백질을 DNA에 가교하기 위해 포름알데히드(최종 농도 1%)와 함께 37°C에서 10 min 동안 배양하였다. 부피의 십분의 일에 해당하는 1.25 mol/L 글리신을 첨가하여 최종 농도를 125 mmol/L로 만들고 가교 반응을 중단하였다. 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척하고, 1 mmol/L 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1 Ag/mL 아프로티닌 및 1 Ag/mL 펩스타틴 A를 함유한 방사면역침강 분석 완충액[150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.5% 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)]에 재현탁한 후 얼음 위에 30 min 동안 두었다. 그런 다음 세포 용해물을 얼음 위에서 Hielscher UP200S 초음파 처리기(3 x 40 s, 진폭 40%, 주기 1; Hielscher Ultrasonics GmbH)로 초음파 처리하여 가교된 염색질을 전단하고 200에서 1,000 bp 사이의 DNA 단편을 얻었다. 전체 용해물의 십분의 일을 사용하여 각 시료에 존재하는 DNA의 양을 정량하였으며, 이를 “총 투입 DNA”로 간주하였다. 비특이적 배경 신호를 줄이기 위해 상등액을 연어 정자 DNA/단백질 아가로스 50% 슬러리와 함께 배양하였다. 이어서 5 Ag의 항-NF-nB p65(Upstate)를 첨가하거나 항체 없이(음성 대조군) 4°C에서 하룻밤 동안 면역침강을 수행하였다. 이 상등액에 5 mol/L NaCl을 첨가하고 65°C에서 하룻밤 동안 가열하여 단백질-DNA 가교를 해제하였다. 면역복합체를 DNase 및 RNase가 없는 프로테이나아제 K로 추가 처리하고, 페놀/클로로포름 추출과 에탄올 침전으로 DNA를 정제하였다. 인간 iNOS 유전자의 프로모터 영역 내 서열에 대응하는 특이적 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다(p1 프라이머: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 프라이머: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP 발현 연구

발현 연구를 위해 염색체 ssu에 EGFP(향상된 녹색 형광 단백질) 유전자가 통합된 재조합 균주 L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12(Jena Bioscience, 독일)를 앞서 기술한 여러 배지에서 배양하였으며, 추가로 100 mg l^-1 의 Nourseothricin(Jena Bioscience, 독일)을 첨가하였다. 배양 중 1 ml 시료를 채취하여 원심분리하고(2000 × g, 20°C, 10 min) 0.9% NaCl 용액으로 세척하였다. 펠릿을 완충액(20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT)에 재현탁한 다음, 초음파 프로세서 UP400S (에너지 투입량 ∼ 400 Ws)를 사용한 초음파 처리로 파쇄하였다. 세포 잔해는 원심분리(6000 × g, 4°C, 5 min)로 제거하였으며, Laemmli(1970)의 방법에 따라 12.5% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 환원 조건에서 도데실황산나트륨 – 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석하였다. 교반 배양에서 EGFP 발현을 조사하였다. (Fritsche et al. 2007)

염색질 면역침강

염색질 면역침강 분석에는 ChIP-IT^TM Express(Active Motif, Carlsbad, CA, 미국)를 사용하였으며, 제조업체의 지침을 일부 수정하여 수행하였다. 간략히 설명하면, 분화된 인간 족세포를 실온에서 1% 포름알데히드로 10 min 동안 가교하였다. 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고, 실온에서 0.125 M 글리신을 첨가하여 5 min 동안 반응시켜 고정 반응을 중지하였다. 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 다시 세척한 후 배양 접시에서 긁어내었다. 원심분리로 세포를 펠릿화하고 세포 용해 완충액에 재현탁하였다. 원심분리 후 펠릿화된 핵을 전단 완충액에 재현탁하고 얼음 위에서 30 min 동안 반응시킨 다음, 초음파 처리로 염색질을 전단하였다. 예를 들어, UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, 독일)를 사용하여 얼음 위에서 25% 출력으로 각각 20 sec씩 5회의 펄스를 가해 약 200–600 bp 크기의 절편으로 전단하였다. 그런 다음 전단된 염색질을 원심분리하고 상층액을 수집하였다. 면역침강을 위해 염색질 60 μl에 Sp1(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 미국), NF-κB p65(Abcam, Cambridge, 영국) 또는 NF-κB p50(Abcam) 항체 1 μg을 첨가하거나, 음성 대조군으로 토끼 IgG(Zymed Laboratories)를 첨가하여 4°C에서 부드럽게 회전시키면서 하룻밤 동안 반응시켰다. 자성 비드에 결합한 면역복합체를 자석 스탠드로 수집하여 충분히 세척한 후, 단백질/DNA 가교를 해제하고 실시간 PCR 분석을 위해 DNA를 용출하였다. (Ristola et al. 2009)

칩 어레이 분석을 위한 EHEC DNA 준비

세포 용해물 및 추출된 DNA 준비
원하는 최종 농도가 되도록 PBS에 현탁한 세균 펠릿을 초음파 파쇄기 UP100H (Hielscher GmbH, 독일)를 사용하여 처리하였다. 이 장치에는 마이크로팁 MS1(직경 1mm)이 장착되어 있었다. 작동 주파수는 30 kHz였고 유효 출력은 100 W였다. 작동 중 시료를 얼음물 수조에서 냉각하고 혼합한 후 원심분리하였다. 시료는 유세포 분석 연구에 사용하였으며, 이후 처리를 위해 시료에 열처리(95°C, 5 min)를 실시하였다. 조세포 용해물은 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1) 혼합물로 처리하였다. 이 혼합물을 용해물 시료와 동일한 부피로 첨가하고, 용액을 15 s 동안 강하게 보텍싱한 후 약 22°C의 실온(RT)에서 15,000 x g로 2 min 동안 원심분리하였다. 유전체 DNA를 함유한 상층 수상을 조심스럽게 분리하여 새 멸균 Eppendorf 튜브에 수집하였다.
이어서 DNA를 단편화하기 위해 시료를 초음파 처리하였다. 초음파 처리 단계는 위에서 설명한 것과 동일한 조건에서 수행하였다. 유전체 DNA에 대한 단편화 효과를 평가하기 위해 아가로스 겔 전기영동으로 시료를 분석하였다.
(…) 앞서 2.5 min 동안 초음파 처리한 시료는 열처리와 원심분리 후 추출 단계를 거쳤다. 방출된 DNA를 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 혼합물로 두 번 추출한 후, 0 – 15 min 동안 두 번째 초음파 처리를 실시하였다. 추출 후 초음파 단편화를 거친 DNA의 크기 분포를 확인하기 위해 아가로스 겔 전기영동을 사용하였다(오른쪽 상단 그림). 2.5 min 이상 초음파 처리한 시료에서는 고분자량 밴드가 사라지고 대신 DNA 스미어가 나타나 DNA가 고도로 단편화되었음을 확인할 수 있었다. 초음파 처리 시간이 길어질수록 단편 길이는 약 150 – 600 bp까지 점차 감소하였으며, 15 min 동안 초음파 처리하면 이러한 단편이 더욱 분해되었는데, 이는 주로 스미어의 상부에서 확인할 수 있다. 따라서 평균 DNA 단편 크기는 초음파 처리 시간에 따라 점차 감소하였으며, 5 min 처리로 칩 어레이 분석에 가장 적합한 크기의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 최종적으로, 먼저 2 min 동안 초음파 처리하고 DNA를 추출한 다음(2×), 이어서 5 min 동안 초음파 처리하는 DNA 분석 시료 준비 절차를 확립하였다. (Basselet et al. 2008)

염색질 면역침강(ChIP)

HEK293 세포를 위에서 설명한 대로 배양하고 실온에서 2 mM 디숙신이미딜 글루타레이트로 45 min 동안 고정하였다. 이어서 세포를 PBS로 두 번 세척하였다. 실온에서 1% (v/v) 포름알데히드를 사용하여 염색질을 10 min 동안 가교한 후 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세척하였다. 실온에서 최종 농도 0.125 M의 글리신과 함께 5 min 동안 배양하여 가교 반응을 중단하였다. 트립신과 함께 배양한 후 세포 배양 접시에서 세포를 긁어내어 PBS로 두 번 세척하였다. 세포 펠릿을 용해 완충액(5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl 및 0.5% (v/v) Nonidet P-40)에 재현탁하고 얼음 위에서 10 min 동안 배양한 후 Dounce 균질기로 균질화하였다. 이어서 원심분리(3500 x g, 5 min, 4 °C)로 핵을 침전시키고 핵 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 10 mM EDTA 및 1% (w/v) SDS)에 재현탁하였다. 핵은 각각 20-s인 펄스 세 번을 가하는 초음파 처리로 파쇄하였으며, 사용한 장치는 UP50H 초음파 처리기 (Hielscher Ultraschall Technologie)이고, 사이클 0.5 및 진폭 30%로 설정하여 대부분의 크기가 200 – 1000 bp인 유전체 DNA 단편을 얻었다. ChIP를 위해 DNA 50g을 면역침강 완충액(16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 1.1% (v/v) Triton X-100 및 0.01% (w/v) SDS)으로 4배 희석하였다. (Weiske et al. 2006)

염색질 면역침강(ChIP)을 통한 히스톤 변형 분석

간략히 설명하면, 6 x 10⁶ 개의 세포를 PBS로 두 번 세척하고 0.5% 포름알데히드 존재하에 실온에서 15 min 동안 배양 플레이트에서 가교시켰다. 0.125 M 글리신을 첨가하여 가교 반응을 중단하였다. 이후 모든 단계는 48°C에서 수행하였다. 모든 완충액은 미리 냉각하였으며 프로테아제 억제제(Complete Mini, Roche)를 함유하였다. 세포를 PBS로 두 번 세척한 다음 긁어 회수하였다. 수집한 펠릿을 1 ml의 세포 용해 완충액(1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8)에 용해하고, 차가운 에탄올 수조에서 100% 진폭으로 10회 초음파 처리하였다. 사용한 장치는 UP50H 초음파 처리기 (Hielscher, Teltow, Germany)였다. 염색질 단편화는 1% 아가로스 겔에서 시각화하였다. 얻어진 단편은 200–500pb 범위였다. 초음파 처리한 시료를 48°C에서 14,000g로 10 min 동안 원심분리하여 가용성 염색질을 얻었다. 가용성 분획을 희석 완충액(1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl)으로 1/10로 희석한 다음 분주하여 사용 시까지 80°C에서 보관하였다. (Rodriguez et al. 2008)