초음파 DNA 전단

DNA 및 RNA 전단 과정에서 긴 DNA 분자는 더 작은 조각으로 단편화되며, 이는 차세대 염기서열분석(NGS) 라이브러리 구축을 위해 샘플을 준비하는 데 중요한 단계입니다. 초음파 DNA 전단은 음향 캐비테이션 힘을 사용하여 DNA 또는 RNA를 100bp에서 5kb 범위의 단편으로 분해합니다. 이 방법을 사용하면 단편 크기를 정밀하게 제어할 수 있어 최적의 염기서열분석 결과를 위해 원하는 DNA 길이에 맞게 맞춤화할 수 있습니다.

초음파를 사용한 DNA 전단

Hielscher 초음파는 DNA, RNA 및 염색질 전단을위한 다양한 초음파 기반 솔루션을 제공합니다. 마이크로 팁을 사용하여 직접 초음파 처리를 위해 프로브 형 초음파 발생기 (예 : UP100H) 중에서 선택하거나 다양한 샘플의 간접 DNA 준비를 위해 VialTweeeter 또는 초음파 cuphorn을 사용하십시오. Hielscher는 귀하의 요구를 고려한 이상적인 장치를 제공합니다 : 1 개 또는 최대 10 개의 샘플이 있는지, 마이크로 리터에서 리터 부피까지의 부피가 있는지 여부 – Hielscher 초음파 발생기는 DNA, RNA 및 염색질 단편을 올바른 길이로 준비하기위한 요구 사항을 충족시킵니다. 재현성, 쉬운 작동 및 정밀한 제어는 차세대 염기서열분석을 위한 신뢰할 수 있는 라이브러리를 가능하게 합니다.
효소 DNA 단편화와 달리 초음파 전단은 화학 물질을 추가하지 않고 순수한 기계적 전단력을 적용합니다. 공정 매개변수의 정확한 설정에 의해 초음파 전단은 고분자량 DNA 단편(플라스미드 및 게놈 DNA)을 생성합니다.
정제된 핵산은 단편화 단계 전이나 후에 증폭할 수 있습니다.
초음파 처리 매개 변수 (전력, 펄스주기 / 버스트, 시간 및 온도)는 소프트웨어 설정을 통해 안전하게 제어 할 수 있습니다.

초음파 DNA 전단을 위한 프로토콜

Chromatin Immunoprecipitation Assay의 경우

간략하게, 세포를 60mm 직경의 접시(접시당 400,000개)에 도말하고, RhoA siRNA(기재된 바와 같이)로 형질주입하였다; 72시간 후, 단백질을 DNA에 가교 결합하기 위해 37°C에서 10분 동안 포름알데히드(최종 농도, 1%)로 배양했습니다. 가교 반응은 1.25 mol/L 글리신의 1/10 부피를 첨가하여 소멸시켜 125 mmol/L 최종 농도를 수득하였다. 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 2회 세척하고, 1mmol/L 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1Ag/mL 아프로티닌 및 1Ag/mL 펩스타틴 A를 함유하는 방사성 면역침전 분석 완충액[150mmol/L NaCl, 1% NP40, 0.5% 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 5mmol/L EDTA, 50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)]에 재현탁하고, 30분 동안 얼음 속에 두었다. 그런 다음, 세포 용해물을 얼음 위에서 초음파 처리했습니다. Hielscher UP200S 초음파 음파 발생기 (3 x 40 s, 진폭 40 %, 사이클 1; Hielscher Ultrasonics GmbH)를 사용하여 가교 염색질을 전단하여 200 및 1,000 bp 사이의 DNA 단편을 생성하였다. 전체 용해물의 1/10을 사용하여 다른 샘플에 존재하는 DNA의 양을 정량화하고 다음과 같이 간주했습니다. “총 입력 DNA”. 상등액은 비특이적 배경을 줄이기 위해 연어 정자 DNA/단백질 아가로스-50% 슬러리로 배양되었습니다. 그런 다음 4°C에서 5Ag의 anti-NF-nB p65(Upstate) 또는 항체 없이(음성 대조군) 밤새 면역침전을 수행했습니다. 이들 상층액에 5mol/L NaCl을 보충하고 65°C에서 밤새 가열하여 단백질-DNA 가교를 되돌렸습니다. 면역복합체를 DNase- 및 RNase-free proteinase K로 추가로 처리하고, DNA를 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 정제하였다. PCR은 인간 iNOS 유전자의 프로모터 영역 내의 서열에 해당하는 특정 프라이머로 수행하였다(p1 프라이머: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 프라이머: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP 발현 연구

발현 연구를 위해, 염색체 ssu가 통합된 EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein) 유전자와 재조합 균주 L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12(Jena Bioscience, Germany)를 앞서 설명한 바와 같이 다양한 배지에서 배양하고 100mg l를 추가로 보충했습니다^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience, 독일). 배양 중, 1 ml 샘플을 채취하여 원심 분리 (2000 × g, 20 ° C, 10 분)하고 0.9 % NaCl 용액으로 세척 하였다. 펠렛을 완충액(20mM HEPES, 5mM EDTA, 2mM DTT)에 재현탁시키고 초음파 처리기로 초음파 처리하여 분해했습니다 업400S (에너지 적용 ∼ 400Ws). 세포 파편을 원심분리(6000 × g, 4°C, 5분)에 의해 제거하고, 12.5% 폴리아크랄아미드 겔을 사용한 Laemmli(1970)의 방법에 따른 환원 조건에서 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석하였다. EGFP-발현은 교반 배양에서 검사하였다. (Fritsche 외. 2007)

크로마틴 면역침전

염색질 면역침전 분석은 ChIP-IT를 사용하여 수행하였다^™ Express(Active Motif, Carlsbad, CA, USA)는 제조업체의 지침에 따라 약간의 수정을 가했습니다. 간략하게, 분화된 인간 podocytes를 실온에서 10분 동안 1% 포름알데히드로 가교 결합했습니다. 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 실온에서 5분 동안 0.125M 글리신을 첨가하여 고정 반응을 중단시켰다. 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 다시 세척하고 접시에서 긁어냈습니다. 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고 용해 완충액에 재현탁시켰다. 원심분리 후, 펠릿화된 핵을 전단 완충액에 재현탁시키고, 30분 동안 얼음 위에서 배양하고, 염색질을 초음파 처리에 의해 전단하였다. 업100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, 독일) 25 % 전력에서 얼음에 각각 20 초의 5 펄스를 약 200-600 bp의 조각으로 나눕니다. 그런 다음 전단된 염색질을 원심분리하고 상층액을 수집했습니다. 면역침전을 위해 60μl의 염색질을 1μg의 Sp1(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65(Abcam, Cambridge, UK) 또는 NF-κB p50(Abcam) 항체 또는 토끼 IgG(Zymed Laboratories)를 음성 대조군으로 4°C에서 밤새 부드럽게 회전하여 배양했습니다. 마그네틱 비드에 결합된 면역복합체를 마그네틱 스탠드를 사용하여 광범위하게 세척한 후 단백질/DNA 가교를 역전시키고 DNA를 용출하여 Real-time PCR 분석을 수행했습니다. (Ristola 외. 2009)

칩 어레이 분석을 위한 EHEC DNA 준비

세포 용해물과 추출된 DNA의 배열
PBS에 현탁된 박테리아 펠릿을 원하는 최종 농도로 처리하였다. 초음파 방해기 UP100H (Hielscher GmbH, 독일) 마이크로 팁 MS1 (직경 1mm)이 장착되어 있습니다. 작동 주파수는 30kHz이고 유효 출력 전력은 100W였습니다. 작업 중에 샘플을 얼음물 수조에서 냉각하고 혼합 및 원심 분리했습니다. 샘플은 유세포 분석 연구에 사용되었으며, 나중에 취급하기 위해 샘플은 열처리(95°C, 5분)를 거쳤습니다. 조세포 용해물을 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1)의 혼합물로 처리하였다. 이 혼합물을 동일한 부피의 용해물 샘플에 첨가하고, 용액을 15초 동안 격렬하게 소용돌이치고, 약 22°C의 실온(RT)에서 2분 동안 15,000 x g에서 원심분리했습니다. 게놈 DNA를 함유한 상부 수성상을 조심스럽게 분리하여 새로운 멸균 Eppendorf 튜브에 수집했습니다.
그 후, 샘플을 초음파 처리하여 DNA를 단편화했습니다. 초음파 처리 단계는 위에서 설명한 것과 동일한 조건에서 실현되었습니다. 게놈 DNA에 대한 단편화 효과를 평가하기 위해 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 샘플을 분석했습니다.
(…) 사전에 2.5분 동안 초음파 처리한 시료는 열처리 및 원심분리 후 추출 단계를 거쳤다. 방출 된 DNA는 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 혼합물로 두 번 추출 한 후 0 - 15 분 동안 두 번째 초음파 처리를 실시했다. 아가로스 겔 전기영동은 추출 후 초음파 단편화를 거친 DNA의 크기 분포를 결정하는 데 사용되었습니다(오른쪽 상단의 그림). 고도로 단편화 된 DNA는 2.5 분 이상 초음파 처리 된 샘플에서 제거 된 고분자량 밴드가 아닌 DNA 도말의 존재로 인해 분명했습니다. 더 긴 초음파 처리는 점차적으로 단편 길이를 약 150 – 600 bp로 줄였으며 15 분 동안의 초음파 처리는 주로 도말의 상부에서 볼 수 있듯이 이러한 단편을 더욱 저하시켰다. 따라서, 평균 DNA 단편 크기는 초음파 처리 시간과 5 분 처리에 따라 점차 감소하여 칩 어레이 분석에 가장 적합한 DNA 단편의 크기를 얻을 수 있었다. 마침내, 초음파 처리의 처음 2 분, DNA 추출 (2×) 및 후속 5 분 초음파 처리로 구성된 DNA 분석 물 준비 절차가 확립되었습니다. (Basselet 외. 2008)

크로마틴 면역침전(ChIP)

HEK293 세포를 상술한 바와 같이 배양하고, 실온에서 45분 동안 2mM 디숙시니미딜-글루타레이트로 고정하였다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 크로마틴을 1%(v/v) 포름알데히드를 사용하여 실온에서 10분 동안 가교시키고 얼음처럼 차가운 PBS로 2회 세척했습니다. 가교 결합 반응은 실온에서 5분 동안 0.125M의 최종 농도에서 글리신으로 배양함으로써 중단시켰다. 트립신으로 배양한 후, 세포 배양 접시에서 세포를 긁어내고 PBS로 2회 세척하였다. 세포 펠릿을 용해 완충액(5mM 파이프, pH 8.0, 85mM KCl 및 0.5%(v/v) Nonidet P-40)에 재현탁시키고, 얼음 위에서 10분 동안 배양하고, Dounce 균질화기로 균질화했습니다. 이어서, 핵을 원심분리(3500 x g, 5분, 4°C)에 의해 펠릿화하고, 핵 완충액(50mM Tris-HCl, pH 8.1, 10mM EDTA, 및 1%(w/v) SDS)에 재현탁시켰다. 핵은 3 개의 20-s 펄스로 초음파 처리에 의해 파괴되었습니다. UP50H 초음파 발생기 (Hielscher Ultraschall Technologie) 사이클 0.5 및 진폭 30 %의 설정에서 200 – 1000 bp의 벌크 크기를 가진 게놈 DNA 단편을 생성합니다. ChIP의 경우, 50g의 DNA를 면역침전 완충액(16.7mM Tris-HCl, pH 8.1, 167mM NaCl, 1.2mM EDTA, 1.1%(v/v) Triton X-100 및 0.01%(w/v) SDS)에 4배 희석했습니다. (Weiske 외. 2006)

염색질 면역침전(ChIP)에 의한 히스톤 변형 분석

간단히 말해서 6 x 10⁶ 세포를 PBS로 2회 세척하고 0.5% 포름알데히드가 있는 상태에서 실온에서 15분 동안 배양 플레이트에서 가교 결합했습니다. 가교 반응은 0.125M 글리신을 첨가하여 중단시켰다. 모든 후속 단계는 48°C에서 수행되었습니다. 모든 완충액은 사전 냉각되었으며 프로테아제 억제제(Complete Mini, Roche)를 함유했습니다. 세포를 PBS로 두 번 세척한 다음 긁어냈습니다. 수집된 펠릿을 1ml 용해 완충액(1% SDS, 5mM EDTA, 50mM Tris pH 8)에 용해시키고 를 사용하여 100% 진폭에서 10주기 동안 차가운 에탄올 수조에서 초음파 처리했습니다. UP50H 초음파 발생기 (Hielscher, Teltow, 독일). 크로마틴 단편화는 1% 아가로스 겔에서 시각화되었습니다. 얻어진 단편은 200–500pb 범위였습니다. 가용성 크로마틴은 14,000g에서 초음파 처리 된 샘플을 48 ° C에서 10 분 동안 원심 분리하여 얻었다. 용해성 분획물을 희석 완충액(1% Triton X-100, 2mM EDTA, 20mM Tris pH 8, 150mM NaCl)에 1/10로 희석한 후 분주하여 사용할 때까지 80°C에서 보관했습니다. (Rodriguez 외. 2008)