Hielscher 초음파 기술

대장균의 초음파 용해

  • E. coli 박테리아는 미생물학 및 생명 공학 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 박테리아입니다.
  • 초음파 세포 파괴 물질은 E. coli의 용해에 대해 신뢰성 있고 재현성있는 결과를 제공합니다.
  • 강렬하면서도 정밀하게 제어가 가능한 캐비테이션 및 전단력은 완전한 붕괴 및 높은 추출 수율 (예 : 단백질, DNA)을 초래합니다.

공동 현상에 의한 세포 파괴

Escherichia coli 박테리아는 초음파 조직 균질기를 사용하여 확실하게 용해됩니다.초음파 탐촉자 형 균질 기는 약 50 ℃에서 작동합니다. 초당 20,000 회 (20kHz에서) 액체 및 supsensions에서 캐비테이션을 유발합니다. 음향 캐비테이션 진공 상태의 압력과 고온의 미세한 영역으로 세포를 따로 따로 찢습니다. 기온이 수천 ℃에 이르지 만 캐비테이션 양은 너무 적어 공정을 크게 가열하지 못합니다. 초음파 생성 된 음향 캐비테이션 및 전단력으로 E.coli의 세포막이 관통되거나 파열됩니다. – 초음파 균질 기의 장치 설정에 따라 달라집니다.

초음파 용해의 장점

  • 용해 (강도, 진폭, 온도)의 정확한 제어
  • 특정 샘플에 대한 최적 적응
  • 온도 제어
  • 매우 작은 샘플에서 매우 큰 샘플 (μL에서 리터까지)
  • 순수 기계적 처리
  • 실험실에서 생산까지 선형 스케일 업
초음파 장치 VialTweeter를 사용하면 동일한 공정 조건에서 최대 10 개의 바이알을 동시에 샘플 준비 할 수 있습니다. (확대하려면 클릭!)

유리 병 초음파 용융

정보 요청




우리의 주의 개인 정보 정책.


화학적 및 효소 적 용해는 문제가 될 수 있지만 – 화학적 용해는 단백질 구조를 변화시키고 정제 문제를 일으킬 수 있고 효소 분해는 배양 시간이 길고 재현 할 수 없으므로 – 초음파 붕괴는 정교하고 빠른 세포 파괴 방법입니다.
초음파 매해는 기계적 힘만을 기반으로합니다. 화학 물질이 첨가되지 않고 초음파 처리가 전단력에 의해 세포벽을 깨뜨립니다. 화학적 용해는 단백질 구조를 바꾸고 정화 문제를 유발할 수 있습니다. 효소 중단은 긴 배양 시간이 필요하며 재현할 수 없습니다.

일반 권장 사항

흐름 반응기가있는 UP400St 초음파기Sonication은 매우 작은, 중간 및 대량의 세포 현탁액을 용해시키는 가장 보편적 인 기술입니다 – 피코 리터에서 최대 100L / hr (초음파 흐름 셀 사용). 세포는 액체 전단 및 캐비테이션에 의해 용해됩니다. DNA는 또한 초음파 처리 동안 전단되므로 DNase를 세포 현탁액에 첨가 할 필요가 없습니다.
온도 제어:
시료를 미리 냉각시키고 얼음으로 초음파 처리하는 동안 시료를 보관하면 시료의 시료 열 분해를 쉽게 방지 할 수 있습니다.
이상적으로, 견본은 용해 도중 얼음 차가운 유지되어야 합니다, 그러나 대부분의 견본을 위해 온도가 문화 또는 조직 근원의 온도 위로 상승하지 않는 경우에 충분합니다. 따라서 얼음에 현탁액을 유지하고 5-10 초의 짧은 초음파 펄스와 10-30 초의 일시 정지로 초음파 처리하는 것이 좋습니다. 일시 정지 하는 동안, 열은 낮은 온도 다시 설정 하기 위해 발산 될 수 있습니다. 더 큰 셀 샘플의 경우 냉각 재킷이 있는 다양한 유량 셀 반응기를 사용할 수 있습니다.

E. Coli Lysates의 준비를위한 프로토콜

재조합 단백질의 발현 분석 및 정제

대장균 펠렛을 초음파 시스템으로 초음파 처리 하였다 UP100H (Hielscher). 이 목적을 위해, 세포 펠릿을 냉각 된 용해 완충액 (50 mM 트리스 -HCl pH = 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF)에 재현 탁시키고 얼음상에서 10 분 동안 냉각시켰다. 그런 다음, 세포 현탁액을 10 초의 짧은 파열로 냉각시킨 후 30 초 간격으로 초음파 처리 하였다. 마지막으로 세포 파편을 14000 rpm으로 15 분 동안 4 ℃에서 초 원심 분리하여 제거 하였다. rPR 발현을 확인하기 위해 상등액을 12 % 폴리 아크릴 아미드 겔에서 작동시키고 SDS-PAGE와 Western blotting으로 분석 하였다. rPR의 정제는 Ni2+-NTA 수지 (Invitrogen, USA)를 제조자 지침서에 따라 배양 하였다. 이 단계에서는 천연 정제 방법을 사용했습니다. 정제 된 단백질의 순도는 12 % 폴리 아크릴 아미드 겔에서의 전기 영동 및 후속적인 쿠마시 블루 염색을 사용하여 평가 하였다. 정제 된 단백질 농도는 Micro BCA 단백질 분석 키트 (PIERCE, USA)로 측정 하였다. (Azarnezhad 외 2016)

용해, 세포 파괴 및 DNA 전단을위한 초음파 세포 분쇄기 UP100H (100W).

초음파 균질 기 UP100H (100W)

대장균 세포 추출물의 세포 성장, 가교 결합 및 제조

SeqA 및 RNA 폴리머 라제 ChIP 칩의 경우 대장균 MG1655 또는 MG1655 ΔseqA를 37 ℃에서 OD600 ml 농도의 포름 알데히드 (37 %) 27 μl (최종 농도 1 %)를 첨가하기 전에 50 ml LB (+ 0.2 % 글루코스)에서 약 0.15의 농도로 첨가 하였다. 가교 결합은 실온에서 20 분 동안 느리게 흔들어 (100rpm) 수행 한 후 2.5M 글리신 (최종 농도 0.5M) 10ml로 급냉시켰다. 열충격 실험을 위해, E.coli MG1655를 30ml에서 65ml의 LB 배지에서 OD600 약 0.3이다. 이어서 배양액 30ml를 예열 된 플라스크에 43 ℃에서 옮기고 나머지는 30 ℃로 유지했다. 가교 결합 및 퀀칭은 실온에서 추가로 느린 교반 전에 세포를 30 또는 43 ℃에서 5 분간 유지하는 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같다. 세포를 원심 분리에 의해 수집하고 차가운 TBS (pH7.5)로 2 회 세척 하였다. 1 ML의 용해 버퍼 (10 MM 트리스 (pH 8.0), 20 % 자당, 50 MM NaCl, 10 MM EDTA, 10 MG / ML 리소자임) 1 ML의에 resuspension 후 30 분 동안 37 ° C에서 보육 다음 4 ML IP 완충액을 사용하여 세포를 얼음 위에서 12 시간 30 초 및 30 초 휴식시킨 후 UP400St 초음파 프로세서 (Hielscher Ultrasonics GmbH)가 100 % 전력을 소비합니다. 9000 g에서 10 분간 원심 분리 한 후, 상등액 800 μl를 -20 ℃에서 보관 하였다. (Waldminghaus 2010)

효소의 과다 생산 및 정제.

데카 히스티딘 (His10) 태그 단백질의 과잉 생성을 위해, pET19b 구조물로 대장균 BL21 (DE3)을 형질 전환시켰다. 하룻밤 전 배양 물을 원심 분리에 의해 수확하고, 1 %를 발현 배양 물 접종에 사용 하였다. pET19mgtB를 운반하는 세포를 22 ℃에서 600 nm에서의 광학 밀도 (OD600)가 0.7이다. 배양 물을 17 ° C로 옮기고 100 μM IPTG로 유도 하였다. 16 시간 후, 배양액을 4 ℃에서 7,500 x g으로 원심 분리하여 수확 하였다. 세포를 pH 7.4의 0.3M NaCl을 함유 한 50mM 인산 완충 식염수 (PBS)에 재현 탁하고, S2 마이크로 팁 sonotrode로 초음파 처리하여 파쇄 하였다 UP200St 초음파 발생 장치 (Hielscher, Teltow, Germany)를 사용하여 사이클 0.5 및 진폭 75 %에서 측정 하였다.
데카 히스티딘 태깅 된 GtfC의과 생산은 37 ℃에서 OD600 IPTG 100 μM의 경우 0.6이다. 그런 다음 세포를 4 시간 동안 배양하고, 수확하고, MgtB에 대해 상기 한 바와 같이 용해시켰다.
조잡한 세포 추출물을 15,000 × g 및 4 ℃에서 원심 분리하여 세포 파편을 침전시켰다. 맑은 추출물은 ÄKTAprime Plus 시스템 (GE Healthcare)을 사용하여 1ml HisTrap FF Crude 컬럼에 넣었습니다. His- 태깅 된 단백질의 구배 용출을위한 제조자의 프로토콜에 따라 효소를 정제 하였다. 용출 된 단백질 용액을 4 ℃에서 0.3M NaCl을 함유 한 50mM PBS (pH 7.4) 1,000 배에 대해 2 회 투석 하였다. 정제는 12 % SDS-PAGE로 분석 하였다. 단백질의 농도는 Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany)를 사용하여 Bradford 방법으로 측정 하였다. (Rabausch 외. 2013)

대장균 박테리아에서 단백질 추출
관심있는 미끼 단백질 (이 경우 Arabidopsis thaliana의 MTV1)은 GST tag에 융합되어 BL21 Escherichia coli (E. coli) 세포에서 발현된다.
1. GST - MTV1과 GST (50 ML 박테리아 문화에 해당) 한 펠렛을 가지고 2.5 ML 얼음 추위 추출 버퍼에 각각을 resuspend.
2. 초음파 발생기를 사용하십시오. UP100H (2 ~ 5mL 용 MS3 microtip-sonotrode 장착)을 사용하여 박테리아 세포를 용해시켜 불투명도를 높이고 점도를 증가시킴으로써 표시됩니다. 이것은 얼음 위에서 수행되어야하며 간격을두고 음파 처리하는 것이 좋습니다 (예 : 10 초 초음파 처리 후 얼음에 10 초). 너무 강한 강도로 초음파 처리하지 않도록주의해야합니다. 발포 또는 백색 침전물의 형성이 검출되면, 강도를 낮추어야한다.
3. 용해 된 박테리아 용액을 1.5 mL의 마이크로 원심 분리 관에 옮기고 4 ℃에서 원심 분리하여 20 분 동안 16,000 xg로 만듭니다.

대장균에서의 Allicin- 변형 된 단백질

VialTweeter는 작은 샘플 균질화를위한 편안한 초음파 발생기입니다.5,5'- Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) 분석법에 의한 Sulfhydryl 함량의 측정
대장균 MG1655 하룻밤 배양 물을 MOPS 최소 배지 (1 : 100)에 접종하기 위해 사용 하였다. 배양 물은 0.4의 A600에 도달 할 때까지 호 기적으로 성장 하였다. 스트레스 처리를 위해 배양액을 3 개의 15 ml 배양 균으로 나누었다. 미처리 배양 물은 음성 대조군으로 사용되었다. 0.79 mM 알리신 (128 μg ml-1) 또는 1 mM 디아 미드를 각각 나머지 두 배양 배지 중 하나에 첨가 하였다. 배양액을 15 분간 배양 하였다. 각 배양액 5ml를 원심 분리 (8,525 × g, 4 ℃, 10 분)하여 수확 하였다. 세포를 1 ㎖의 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, 사용 전에 혐기성으로 저장) 및 원심 분리 (13,000 × g, 4 ℃, 10 분). 세포를 4 ℃에서 파쇄하기 전에 용해 완충액 (6 mM guanidinium HCl, pH 7.4을 갖는 PBS)에 재현 탁시키고 (초음파 처리유리 병 초음파 발생기, Hielscher GmbH, Germany) (3 × 1 분). 세포 파편을 원심 분리 (13,000 × g, 4 ℃, 15 분)에 의해 펠렛 화 하였다. 상등액을 자기 교반 바를 사용하여 3.5ml QS- 마크로 큐벳 (10mm)에 옮기고 1ml의 용해 완충액과 혼합 하였다. 샘플의 소멸은 실온에서 PSC-718 온도 제어 셀 홀더 (Jasco)가 장착 된 Jasco V-650 분광 광도계를 사용하여 412 nm에서 모니터링되었습니다. 3 mM 디티 오비스 (2- 니트로 벤조산) 용액 100 ㎕를 첨가 하였다. 소화가 포화 상태에 도달 할 때까지 모니터링 하였다. 티올 농도의 계산은 흡광 계수 ε412 = 13,700 M-1 센티미터-1 티오 -2- 니트로 벤조산 (TNB)에 대한 것이다. 세포질 티올 농도는 6.7 x 10의 대장균 체적-15 리터 및 세포 밀도 A600 = 0.5 (1 × 10에 상당)8 세포 ml-1 문화). (Müller et al., 2016)

Vivo 글루타티온 결정

대장균 MG1655를 MOPS 최소 배지에서 총 부피 200 ㎖로 A600 0.5에 도달했다. 스트레스 처리를 위해 배양 물을 50-ml 배지로 나누었다. 0.79 mM allicin, 1 mM diamide, 또는 dimethyl sulfoxide (대조군)로 15 분간 배양 한 후 세포를 4 ℃에서 4 ℃에서 10 분간 수확했다. 세포를 KPE 완충액으로 2 회 세척 한 후, 펠렛을 700μl의 KPE 완충액에 재현 탁시켰다. 탈 단백질을 위해 10 % (w / v) sulfosalicylic acid 300㎕를 초음파 분쇄 (3 x 1 분; 유리 병 초음파기). 원심 분리 (30 분, 13,000g, 4 ℃) 후에 상등액을 수집 하였다. Sulfosalicylic acid 농도는 3 부피의 KPE 완충액의 첨가에 의해 1 %로 감소되었다. 총 글루타티온 및 GSSG의 측정은 상기 한 바와 같이 수행 하였다. 세포 글루타티온 농도는 대장균 6.7×(10)-15 리터 및 세포 밀도 A600 0.5 (1에 해당함)×(10)8 세포 ml-1 문화). GSH 농도는 총 글루타티온에서 2 [GSSG]를 뺀 값으로 계산 하였다. (Müller et al., 2016)

세포 용해 및 생물학적 물질 추출을위한 초음파 분쇄기 (Click to enlarge!)

프로브 형 초음파기 UP400St

대장균에서 인간 mAspAT의 발현

세포 내 물질 (예 : 단백질, 세포 기관, DNA, RNA 등) 추출 용 초음파 세포 분쇄기 UP400St (400W)100μg / mL의 암피실린을 함유 한 Luria-Bertani (LB) 배지 30 mL에서 발현 벡터를 보유하고있는 E. coli BL21 (DE3)의 단일 콜로니를 얻은 다음, 37 ℃에서 광학 밀도 (OD600)가 0.6에 도달했습니다. 세포를 4,000 × g에서 10 분간 원심 분리하여 수확하고, 100μg / mL 암피실린을 함유하는 3L 신선한 LB 배지에 재현 탁시켰다.
그 후 단백질 발현을 1 mM 이소 프로필 β-1-thiogalactopyranoside (IPTG)로 16 ℃에서 20 시간 동안 유도 하였다. 8,000 × g에서 15 분간 원심 분리하여 세포를 수확하고 완충액 A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4)로 세척 하였다. 약 45g (습윤 중량)의 세포가 3L ​​배양으로부터 얻어졌다. 원심 분리 후, 세포 펠릿을 40 ㎖ (1 L 배양)의 빙냉 추출 완충액 A에 재현 탁시키고, 빙냉 온도에서 초음파 세척에 의해 UP400St 악기 (Dr. Hielscher GmbH, Germany). 세포 용해를 12,000 rpm으로 15 분 동안 원심 분리하여 가용성 (상층) 및 침전 (펠렛) 분획을 분리 하였다. (Jiang 외 2015)

아래 표는 초음파 장비의 대략적인 처리 용량을 보여줍니다.

일괄 볼륨 유량 권장 장치
0.5 ~ 1.5mL N.A. 유리 병
1 ~ 500mL 10 ~ 200mL / min UP100H
10 ~ 2000mL 20 ~ 400 mL / min UP200Ht, UP400St
0.1 ~ 20L 0.2 ~ 4L / min UIP2000hdT
10 ~ 100L 2 ~ 10L / min UIP4000
N.A. 10 ~ 100L / min UIP16000
N.A. 더 큰 의 클러스터 UIP16000

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문학 / 참고 문헌



알만한 가치가있는 사실

대장균

대장균 (Escherichia coli)은 대장균 (Escherichia coli, 대장균)으로서 일반적으로 온혈 동물의 하부 장 (흡열)에서 흔히 발견되는 대장균 (Escherichia) 속의 그램 음성, 혐기성, 막대 모양의 대장균이다. 다양한 특성을 지닌 다수의 대장균 균주 (또는 아형)가 존재한다. 대부분의 E. coli 균주는 인간에게 무해합니다. 예를 들어 실험실에서 연구 응용에 일반적으로 사용되는 B 및 K-12 균주가 있습니다. 그러나 일부 변종은 해롭고 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다.
E. coli는 박테리아가 조작하기 쉽기 때문에 현대 생물 공학과 산업 미생물학에서 중요한 역할을합니다. 대장균을 자주 사용하는 일반적인 실험실 응용 프로그램, 예를 들어 재조합 디옥시리보 핵산 (DNA)을 만들거나 모델 생물로 작용하는 경우.
대장균은 이종 단백질 생산을위한 매우 다양한 호스트이며 대장균에서 재조합 단백질을 생산할 수있는 다양한 단백질 발현 시스템이 있습니다. 단백질의 높은 수준의 발현을 허용하는 플라스미드를 사용하여, 유전자가 박테리아에 도입 될 수 있으며, 이는 산업 발효 과정에서 대량으로 이러한 단백질을 생산할 수있게한다.
대장균은 인슐린을 생산하는 세포 공장으로 사용됩니다. 추가 응용 프로그램에는 bioremediation뿐만 아니라 바이오 연료를 생산하기 위해 백신과 고정 효소를 개발 및 생산하기 위해 변형 된 E. coli 세포를 사용하는 것이 포함됩니다.
K-12 균주는 효소 인 ALK (Alkaline Phosphatase)를 과발현하는 E. coli의 돌연변이 형태이다. 이 돌연변이는 효소를 끊임없이 코드하는 유전자의 결함으로 인해 발생합니다. 유전자가 어떠한 억제도 일으키지 않는 생성물을 생산하는 경우 이는 구성적인 활동으로 알려져있다. 이 특정 돌연변이 형태는 ALP 효소의 분리 및 정제에 사용됩니다.

초음파 DNA 절단

초음파 전단력은 세포에서 분리하여 DNA 가닥을 조각으로 만드는 일반적인 방법입니다. 음향 캐비테이션은 세포 벽과 세포막을 파괴하여 세포에서 DNA를 추출하고 약 600 개의 단편을 생성합니다 – 800 bp의 길이로 분석에 이상적입니다.
DNA 단편화를위한 초음파 균질기에 대한 자세한 내용을 보려면 여기를 클릭하십시오!