대장균의 초음파 용해

  • E. coli 박테리아는 미생물학 및 생명 공학 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 박테리아입니다.
  • 초음파 세포 파괴 물질은 E. coli의 용해에 대해 신뢰성 있고 재현성있는 결과를 제공합니다.
  • 강렬하면서도 정밀하게 제어가 가능한 캐비테이션 및 전단력은 완전한 붕괴 및 높은 추출 수율 (예 : 단백질, DNA)을 초래합니다.

대장균의 초음파 세포 파괴가 선호되는 방법은 무엇입니까?

초음파 균질화 또는 프로브 형 초음파 는 강렬한 초음파가 세포벽과 막을 효율적으로 방해하기 때문에 대장균 용해에 몇 가지 이점을 제공합니다. 프로브 형 초음파 는 다음과 같은 이유로 대장균 용해에 널리 사용됩니다.

  • 세포벽의 효율적인 파괴 : 대장균은 펩티도글리칸으로 구성된 반강성 세포벽을 가지고 있어 전통적인 용해 방법으로는 깨기 어려울 수 있습니다. 프로브 형 초음파 는 세포를 둘러싼 액체에 캐비테이션 기포를 생성하는 강렬한 초음파를 생성합니다. 이러한 기포가 붕괴되면 고속 액체 제트와 충격파를 생성하여 세포벽을 기계적으로 파괴하여 생체 분자와 같은 세포 내용물을 효과적으로 방출합니다.
  • 향상된 침투력: 프로브 / sonotrode에 의해 생성 된 초음파는 샘플 깊숙이 침투하여 더 많은 수의 대장균 세포에 도달하여 균등하게 처리 할 수 있습니다. 이는 용해가 시료 전체에서 보다 균일하게 이루어지도록 하여 세포 파괴 효율을 높이는 데 도움이 됩니다.
  • 처리 시간 단축: 프로브 형 초음파 발생기에 의해 전달되는 에너지는 고도로 집중되고 국소화되어 신속하고 효율적인 세포 용해로 이어집니다. 비드 박타 또는 효소 용해와 같은 다른 방법과 비교할 때, 초음파 처리는 몇 분 또는 몇 초 내에 대장균 용해를 달성 할 수 있습니다. 동결 해동과 같은 많은 대체 기술은 여러 라운드의 처리가 필요하지만 초음파 용해는 단일 공정 단계에서 세포를 엽니 다.
  • 온도 제어: 최첨단 초음파 발생기에는 온도 센서와 스마트 소프트웨어가 장착되어있어 최대 공정 온도를 설정할 수 있습니다. 초음파 는 온도 한계에 도달하면 자동으로 일시 중지되고 설정 온도 지점에 도달하면 초음파 처리 과정을 시작합니다. 얼음 수조에서 샘플을 냉각하는 것은 샘플 온도를 낮게 유지하고 열로 인한 샘플 분해를 방지하는 간단한 방법입니다.
  • 확장성: 프로브 형 초음파 는 핸드 헬드 장치에서 대규모 산업 모델에 이르기까지 다양한 크기로 제공됩니다. 따라서 실험실에서 소량을 처리하거나 백신 생산 또는 분자 생합성과 같은 대규모 바이오프로세싱 응용 분야를 위해 확장하는 데 적합합니다.
  • 다재: 초음파 는 DNA 전단, 단백질 추출, 조직 균질화, 나노 입자 분산 및 유화와 같은 세포 용해 이외의 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 따라서 프로브 형 초음파 발생기에 투자하면 연구 또는 산업 환경에서 다양성을 제공합니다.
  • UP200St와 같은 프로브 형 초음파 는 신뢰할 수있는 조직 균질화 및 세포 분쇄기이므로 E.coli 용해와 같은 유전학의 샘플 준비에 널리 사용됩니다

    E.coli 세포에서 단백질 추출은 다음을 통해 효율적으로 수행됩니다. 초음파 프로브 UP200St

    프로브 형 초음파 는 대장균 용해에 많은 이점을 제공합니다. 초음파 공정 매개변수에 대한 안정적이고 정밀한 제어를 통해 전력, 지속 시간 및 샘플 처리와 같은 작동 매개변수를 최적화하여 원하는 결과를 얻을 수 있습니다.
     

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    이 튜토리얼은 실험실, 분석 및 연구에서 용해, 세포 파괴, 단백질 분리, DNA 및 RNA 단편화와 같은 샘플 준비 작업에 가장 적합한 초음파 발생기 유형을 설명합니다. 응용 분야, 시료 부피, 시료 수 및 처리량에 이상적인 초음파 처리기 유형을 선택하십시오. Hielscher 초음파는 당신에게 이상적인 초음파 균질화기를 가지고 있습니다!

    과학 및 분석에서 세포 파괴 및 단백질 추출을위한 완벽한 초음파 발생기를 찾는 방법

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    초음파 DNA 단편화는 차세대 시퀀싱 (NGS)에서 샘플 준비 단계로 자주 사용됩니다.

    대장균 EDL933의 게놈 DNA의 전기 영동 분석은 0 – 15 분 초음파를 실시했습니다. L은 DNA 사다리를 나타냅니다.
    (연구 및 이미지: ©Basselet et al. 2008)

    초음파 캐비테이션을 이용한 세포 파괴

    초음파 프로브 형 균질화는 약 초당 20,000 사이클 (20kHz에서)로 작동하며 액체 또는 현탁액에서 캐비테이션을 유발합니다. 음향 캐비테이션 진공과 같은 압력과 세포를 찢는 고온의 미세한 영역. 온도가 섭씨 수천 도에 달할 수 있지만 캐비테이션 부피가 너무 작아서 공정을 크게 가열하지 않습니다. 초음파는 음향 캐비테이션과 전단력을 생성하여 대장균과 같은 박테리아 세포의 세포막을 천공하거나 파괴합니다. Hielscher 초음파 를 사용하면 초음파 강도, 진폭, 에너지 입력 및 온도와 같은 공정 매개 변수를 정밀하게 제어 할 수 있습니다. 따라서 초음파 용해 공정은 세포 유형, 세포 배양 및 공정 목표에 맞게 최적으로 조정할 수 있습니다.
     

    초음파 용해의 장점

    • 용해 (강도, 진폭, 온도)의 정확한 제어
    • 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과
    • 특정 샘플에 대한 최적 적응
    • 온도 제어
    • 매우 작은 샘플에서 매우 큰 샘플 (μL에서 리터까지)
    • 순수 기계적 처리
    • 사용자 친화적이고 안전한 작동
    • 실험실에서 생산까지 선형 스케일 업
    초음파 장치 VialTweeter를 사용하면 동일한 공정 조건에서 최대 10 개의 바이알을 동시에 샘플 준비 할 수 있습니다. (확대하려면 클릭!)

    유리 병 초음파 용융

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    초음파 균질화 대 다른 용해 기술

    화학적 및 효소적 용해는 문제가 될 수 있습니다 – 화학적 용해는 단백질 구조를 변화시키고 정제 문제를 일으킬 수 있고 효소 분해는 배양 시간이 길고 재현 할 수 없으므로 – 초음파 붕괴는 정교하고 빠른 세포 파괴 방법입니다.
    초음파 용해는 기계적 힘만을 기반으로합니다. 화학 물질이 첨가되지 않고 초음파 처리가 전단력에 의해 세포벽을 파괴합니다. 화학적 용해는 단백질 구조를 변화시키고 정제 문제를 일으킬 수 있습니다. 효소 파괴는 긴 배양 시간이 필요하며 재현할 수 없습니다. 대장균 박테리아 세포의 초음파 세포 파괴는 빠르고 간단하며 신뢰할 수 있으며 재현 가능합니다. 그렇기 때문에 Hielscher 초음파 는 전 세계의 생물학 및 생화학 실험실에서 샘플 준비, 사전 분석, 체외 대각선 및 매니 폴드 분석에 사용됩니다.

    초음파 용해에 대한 일반적인 권장 사항

    Sonication은 매우 작은, 중간 및 대량의 세포 현탁액을 용해시키는 가장 보편적 인 기술입니다 – 피코 리터에서 최대 100L / hr (초음파 흐름 셀 사용). 세포는 액체 전단 및 캐비테이션에 의해 용해됩니다. DNA는 또한 초음파 처리 동안 전단되므로 DNase를 세포 현탁액에 첨가 할 필요가 없습니다.
     

    초음파 E.coli 용해 중 온도 조절
    초음파 세포 파괴기 UP100H (100W) 세포 파괴 및 식물 화합물 추출.시료를 미리 냉각시키고 얼음으로 초음파 처리하는 동안 시료를 보관하면 시료의 시료 열 분해를 쉽게 방지 할 수 있습니다.
    이상적으로는 용해 중에 샘플을 얼음처럼 차갑게 유지해야 하지만 대부분의 샘플의 경우 온도가 배양 또는 조직 소스의 온도 이상으로 상승하지 않으면 충분합니다. 따라서 서스펜션을 얼음 위에 유지하고 5-10 초의 짧은 초음파 펄스와 10-30 초의 일시 중지로 초음파 처리하는 것이 좋습니다. 일시 정지 중에는 저온을 다시 설정하기 위해 열이 발산될 수 있습니다. 더 큰 셀 샘플의 경우, 냉각 재킷이 있는 다양한 플로우 셀 반응기를 사용할 수 있습니다.
    성공적인 초음파 용해를 위한 자세한 팁과 권장 사항을 여기에서 읽어보십시오!

    대장균 용해물의 초음파 준비를위한 프로토콜

    연구원들은 대장균 세포 파괴를 위해 Hielscher 초음파 균질화기를 사용합니다. 아래에서 다양한 대장균 관련 응용 분야에 Hielscher 초음파 균질화기를 사용하여 E.coli 용해에 대한 다양한 테스트 및 입증 된 프로토콜을 찾을 수 있습니다.
     

    이 비디오 클립은 Hielscher 초음파 균질 기 UP100H, 실험실에서 샘플 준비에 널리 사용되는 초음파 발생기를 보여줍니다.

    초음파 균질 기 UP100H

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    세포 성장, 가교 및 초음파를 이용한 대장균 세포 추출물의 제조

    SeqA 및 RNA 폴리머 라제 ChIP 칩의 경우 대장균 MG1655 또는 MG1655 ΔseqA를 37 ℃에서 OD600 ml 농도의 포름 알데히드 (37 %) 27 μl (최종 농도 1 %)를 첨가하기 전에 50 ml LB (+ 0.2 % 글루코스)에서 약 0.15의 농도로 첨가 하였다. 가교 결합은 실온에서 20 분 동안 느리게 흔들어 (100rpm) 수행 한 후 2.5M 글리신 (최종 농도 0.5M) 10ml로 급냉시켰다. 열충격 실험을 위해, E.coli MG1655를 30ml에서 65ml의 LB 배지에서 OD600 약 0.3. 이어서, 30ml의 배양물을 43°C에서 미리 예열된 플라스크에 옮기고 나머지는 30°C에서 유지하였다. 가교 및 담금질은 실온에서 더 천천히 진탕하기 전에 세포를 30 또는 43°C에서 5분 동안 유지한 것을 제외하고는 상기와 같았습니다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 차가운 TBS(pH7.5)로 2회 세척하였다. 1ml 용해 완충액(10mM 트리스(pH 8.0), 20% 자당, 50mM NaCl, 10mM EDTA, 10mg/ml 리소자임)에 재현탁하고 37°C에서 30분 동안 배양한 후 4ml IP 완충액을 첨가한 후 세포를 100% 전력 설정에서 Hielscher 초음파 프로세서 UP400St를 사용하여 12배 30초 및 30초 휴식으로 얼음 위에서 초음파 처리했습니다. 9000g에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액의 분취액 800μl를 -20°C에서 보관했습니다. (발트밍하우스 2010)
     

    초음파 프로브를 사용한 효소의 과잉 생산 및 정제

    초음파 UP100H는 세포 배양 플레이트의 샘플 준비에 자주 사용되는 실험실 균질 화제입니다.데카히스티딘(His10) 태그가 부착된 단백질의 과잉생산을 위해 대장균 BL21(DE3)을 pET19b 구축물로 형질전환했습니다. 하룻밤 전배양을 원심분리에 의해 수확하고, 1%를 발현 배양물을 접종하는데 사용하였다. pET19mgtB를 운반하는 세포는 600nm(OD600)에서 광학 밀도가 0.7이 될 때까지 22°C에서 성장했습니다. 배양물을 17°C로 옮기고 100μM IPTG에 의해 유도되었습니다. 16시간 후, 배양물을 4°C에서 7,500 × g에서 원심분리에 의해 수확하였다. 세포는 pH 7.4에서 0.3M NaCl로 50mM 인산염 완충 식염수 (PBS)에 재현 탁되고 Hielscher 초음파 처리기 UP200St에서 0.5 사이클과 75 %의 진폭으로 S2 마이크로 팁 sonotrode로 초음파에 의해 중단되었습니다.
    데카 히스티딘 태깅 된 GtfC의과 생산은 37 ℃에서 OD600 IPTG 100 μM의 경우 0.6이다. 그런 다음 세포를 4 시간 동안 배양하고, 수확하고, MgtB에 대해 상기 한 바와 같이 용해시켰다.
    조세포 추출물을 15,000 × g 및 4°C에서 원심분리하여 세포 파편을 침전시켰다. 정제된 추출물을 ÄKTAprime Plus 시스템을 사용하여 1ml HisTrap FF Crude 컬럼에 로딩했습니다. 효소는 His-태그된 단백질의 그래디언트 용리를 위한 제조자의 프로토콜에 따라 정제되었다. 용출된 단백질 용액을 4°C에서 0.3M NaCl로 50mM PBS, pH 7.4의 1,000부피에 대해 두 번 투석했습니다. 정제를 12% SDS-PAGE로 분석하였다. 단백질의 농도는 Roti-Quant를 이용한 Bradford 방법으로 측정하였다. (Rabausch 외. 2013)
     

    대장균 박테리아에서 단백질의 초음파 추출
    관심있는 미끼 단백질 (이 경우 Arabidopsis thaliana의 MTV1)은 GST tag에 융합되어 BL21 Escherichia coli (E. coli) 세포에서 발현된다.

    1. GST-MTV1 및 GST(박테리아 배양액 50ml에 해당) 펠릿 1개를 취하여 각각 2.5mL 얼음 냉간 추출 완충액에 재현탁합니다.
    2. 초음파 처리기 UP100H (약 2-5mL의 소량을위한 MS3 마이크로 팁 - sonotrode 장착)를 사용하여 박테리아 세포가 용해 될 때까지 박테리아 세포를 파괴하며, 이는 불투명도 감소 및 점도 증가로 나타납니다. 이것은 얼음 위에서 수행되어야하며, 간격으로 초음파 처리하는 것이 좋습니다 (예 : 10 초 초음파 처리 후 얼음 위에서 10 초 일시 중지 등). 너무 높은 강도로 초음파 처리하지 않도록주의해야합니다. 거품이 발생하거나 백색 침전물이 형성되면 강도를 낮춰야 합니다.
    3. 용해된 박테리아 용액을 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 옮기고 4°C, 16,000 x g에서 20분 동안 원심분리합니다.

     

    초음파 프로브는 음향 캐비테이션의 힘을 사용하여 세포를 파괴하고 대장균에서 분자와 DNA를 추출합니다.

    UP400St와 같은 프로브 형 초음파 발생기 E.coli의 효율적인 용해를 위해 음향 캐비테이션의 작동 원리를 사용하십시오.

    초음파 처리를 이용한 재조합 단백질의 발현 분석 및 정제

    대장균 펠릿은 Hielscher 초음파 처리기로 초음파 처리되었습니다 UP100H. 이를 위해, 세포 펠렛을 냉장 용해 완충액(50mM Tris-HCl pH=7.5, 100mM NaCl, 5mM DTT, 1mM PMSF)에 재현탁하고 얼음 상에서 10분 동안 냉각시켰다. 그런 다음, 세포 현탁액을 10 초의 짧은 버스트로 초음파 처리 한 후 냉각을 위해 30 초 간격으로 초음파 처리했습니다. 마지막으로, 세포 파편은 14000rpm에서 15분 동안 4°C에서 초원심분리에 의해 제거되었습니다. rPR 발현의 확인을 위해, 상청액을 12% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 실행하고, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하였다. rPR의 정제는 제조사 가이드에 따라 Ni2+-NTA 수지(Invitrogen, USA)를 사용하여 수행하였다. 이 단계에서는 천연 정제 방법을 사용했습니다. 정제된 단백질의 순도는 12% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동 및 후속적인 쿠마시 블루 염색을 사용하여 평가하였다. 정제된 단백질 농도는 Micro BCA protein assay kit(PIERCE, USA)로 측정하였다. (Azarnezhad 외. 2016)
     

    이 비디오는 실험실 샘플의 분산, 균질화, 추출 또는 탈기를위한 200 와트 초음파 컵 혼을 보여줍니다.

    초음파 컵혼 (200 와트)

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    E. coli Lysis에 대한 초음파 균질화

    Hielscher 초음파는 대장균 박테리아 및 기타 세포 유형, 조직 및 세포 배양의 안정적이고 효율적인 용해를 위한 고성능 초음파 균질화기를 설계, 제조 및 공급합니다.
    초음파 프로브의 광범위한 포트폴리오와 간접 초음파 처리 시스템을 통해 세포 파괴 및 추출 응용 분야에 이상적인 초음파 조직 균질화를 제공 할 수 있습니다.

    설계, 제조 및 컨설팅 – 독일에서 만든 품질

    Hielscher 초음파 는 브라우저 제어를 통해 원격으로 제어 할 수 있습니다. 초음파 처리 매개 변수를 모니터링하고 공정 요구 사항에 맞게 정확하게 조정할 수 있습니다.Hielscher 초음파 는 최고 품질 및 설계 표준으로 잘 알려져 있습니다. 스마트 소프트웨어, 직관적인 메뉴, 프로그래밍 가능한 설정 및 자동 데이터 프로토콜은 Hielscher 초음파 의 몇 가지 기능에 불과합니다. 견고성과 쉬운 작동으로 초음파 를 연구 및 생명 공학 시설에 원활하게 통합 할 수 있습니다. 거친 조건과 까다로운 환경조차도 Hielscher 초음파 로 쉽게 처리 할 수 있습니다.

    Hielscher 초음파는 ISO 인증 회사이며 최첨단 기술과 사용자 친화성을 특징으로 하는 고성능 초음파 에 특히 중점을 둡니다. 물론, Hielscher 초음파 는 CE를 준수하고 UL, CSA 및 RoHs의 요구 사항을 충족합니다.

    아래 표는 초음파 장비의 대략적인 처리 용량을 보여줍니다.

    일괄 볼륨 유량 권장 장치
    다중 웰/마이크로타이터 플레이트 N.A. UIP400MTP
    바이알 또는 비커용 CupHorn N.A. 초음파 cuphorn
    초음파 마이크로 플로우 반응기 N.A. GDmini2
    0.5 - 1.5mL의 최대 10개 바이알 N.A. 유리 병
    0.5 ~ 1.5mL N.A. 유리 병
    1 ~ 500mL 10 ~ 200mL / min UP100H
    10 ~ 2000mL 20 ~ 400 mL / min UP200Ht, UP400St
    0.1 ~ 20L 0.2 ~ 4L / min UIP2000hdT
    10 ~ 100L 2 ~ 10L / min UIP4000
    N.A. 10 ~ 100L / min UIP16000
    N.A. 더 큰 의 클러스터 UIP16000

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    추가 정보 요청

    아래 양식을 사용하여 초음파 조직 균질화 및 세포 분쇄기, 용해 응용 프로그램 및 가격에 대한 추가 정보를 요청하십시오. 우리는 당신과 함께 당신의 과정을 논의하고 당신에게 당신의 요구 사항을 충족시키는 초음파 균질화기를 제공하게되어 기쁩니다!









    주의 하시기 바랍니다 개인 정보 정책.


    비디오는 고강도 초음파를 사용하여 모든 표준 멀티 웰 플레이트의 신뢰할 수있는 샘플 준비를 할 수있는 초음파 샘플 준비 시스템 UIP400MTP를 보여줍니다. UIP400MTP의 전형적인 응용 분야는 세포 용해, DNA, RNA 및 크로마틴 전단뿐만 아니라 단백질 추출을 포함한다.

    멀티 웰 플레이트 초음파 처리를위한 초음파 처리기 UIP400MTP

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    초음파 대장균 용해를 위한 추가 프로토콜

    Allicin-modified Proteins in E. coli using Ultrasonic VialTweeter (초음파 바이알트윗터를 사용한 대장균의 알리신 변형 단백질)

    초음파 프로세서 UP200ST의 바이알 트위터5,5'- Dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) 분석법에 의한 Sulfhydryl 함량의 측정
    대장균 MG1655 하룻밤 배양을 사용하여 MOPS 최소 배지(1:100)를 접종했습니다. 배양은 0.4의 A600에 도달할 때까지 호기성으로 성장했습니다. 배양은 스트레스 치료를 위해 3개의 15ml 배양으로 분할되었습니다. 처리되지 않은 배양 물은 음성 대조군으로 작용했습니다. 0.79 mM 알리신(128 μg ml-1) 또는 1 mM 디아미드를 각각 나머지 2개의 배양물 중 하나에 첨가하였다. 배양물을 15분 동안 배양하였다. 각 배양액 5ml를 원심분리(8,525 × g, 4°C, 10분)에 의해 수확하였다. 세포를 1ml의 PBS(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7.4, 사용 전에 혐기성 저장)로 2회 세척하고 원심분리(13,000×g, 4°C, 10분)했습니다. 세포는 초음파에 의해 4°C에서 파괴되기 전에 용해 완충액(6mM 구아니디늄 HCl, pH 7.4가 있는 PBS)에 재현탁되었습니다(유리 병 초음파 발생기, Hielscher GmbH, 독일) (3 × 1 분). 세포 파편을 원심분리(13,000 × g, 4°C, 15분)에 의해 펠릿화하였다. 상청액을 마그네틱 교반 막대가 있는 3.5ml QS-매크로 큐벳(10mm)으로 옮기고 1ml의 용해 완충액과 혼합했습니다. 샘플의 소멸은 실온에서 PSC-718 온도 제어 셀 홀더가 장착된 Jasco V-650 분광 광도계를 사용하여 412nm에서 모니터링했습니다. 100μl의 3mM 디티오비스(2-니트로벤조산) 용액을 첨가하였다. 포화 상태에 도달 할 때까지 멸종을 모니터링했습니다. 티올 농도의 계산은 흡광계수 ε를 이용하여 수행하였다412 = 13,700 M-1 센티미터-1 티오 -2- 니트로 벤조산 (TNB)에 대한 것이다. 세포질 티올 농도는 6.7 x 10의 대장균 체적-15 리터 및 셀 밀도 A600 = 0.5 (1 × 10에 해당)8 세포 ml-1 문화). (Müller et al., 2016)
     

    초음파 세포 분쇄기를 사용한 생체 내 글루타티온 측정

    대장균 MG1655는 A600이 0.5에 도달할 때까지 총 부피 200ml의 MOPS 최소 배지에서 성장했습니다. 배양물을 스트레스 치료를 위해 50ml 배양액으로 분할하였다. 0.79mM 알리신, 1mM 디아미드 또는 디메틸 설폭사이드(대조군)로 15분 동안 배양한 후 4°C에서 4,000g에서 10분 동안 세포를 수확했습니다. 세포를 700μl의 KPE 완충액에 펠렛을 재현탁시키기 전에 KPE 완충액으로 2회 세척하였다. 탈단백질화를 위해, 300l의 10%(w/v) 설포살리실산을 초음파에 의해 세포를 파괴하기 전에 첨가하였다(3 x 1분; 유리 병 초음파기). 원심 분리 (30 분, 13,000g, 4 ℃) 후에 상등액을 수집 하였다. Sulfosalicylic acid 농도는 3 부피의 KPE 완충액의 첨가에 의해 1 %로 감소되었다. 총 글루타티온 및 GSSG의 측정은 상기 한 바와 같이 수행 하였다. 세포 글루타티온 농도는 대장균 6.7×(10)-15 리터 및 셀 밀도 A600 0.5(1×(10)8 세포 ml-1 문화). GSH 농도는 총 글루타티온에서 2 [GSSG]를 뺀 값으로 계산 하였다. (Müller et al., 2016)

    초음파 균질화기를 이용한 대장균의 인간 mAspAT 발현

    세포 내 물질 (예 : 단백질, 세포 기관, DNA, RNA 등) 추출 용 초음파 세포 분쇄기 UP400St (400W)100μg / mL의 암피실린을 함유 한 Luria-Bertani (LB) 배지 30 mL에서 발현 벡터를 보유하고있는 E. coli BL21 (DE3)의 단일 콜로니를 얻은 다음, 37 ℃에서 광학 밀도 (OD600)가 0.6에 도달했습니다. 세포를 4,000 × g에서 10 분간 원심 분리하여 수확하고, 100μg / mL 암피실린을 함유하는 3L 신선한 LB 배지에 재현 탁시켰다.
    이어서, 단백질 발현을 16ºC에서 20시간 동안 1mM 이소프로필 β-ᴅ-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도하였다. 세포를 8,000 × g에서 15분 동안 원심분리하여 수확하고, 완충제 A (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4)로 세척하였다. 대략 45g(습윤 중량) 세포를 3L 배양물로부터 수득하였다. 원심분리 후, 세포 펠릿을 40mL(1L 배양용) 빙냉 추출 완충액 A에 재현탁하고, Hielscher 초음파 세포 분쇄기 UP400St를 사용하여 빙냉 온도에서 초음파로 용해시켰다. 세포 용해를 12,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 용해성(상층액)과 침전(펠렛) 분획을 분리하였다. (Jiang 외. 2015)
     



    알만한 가치가있는 사실

    대장균

    대장균 (Escherichia coli)은 대장균 (Escherichia coli, 대장균)으로서 일반적으로 온혈 동물의 하부 장 (흡열)에서 흔히 발견되는 대장균 (Escherichia) 속의 그램 음성, 혐기성, 막대 모양의 대장균이다. 다양한 특성을 지닌 다수의 대장균 균주 (또는 아형)가 존재한다. 대부분의 E. coli 균주는 인간에게 무해합니다. 예를 들어 실험실에서 연구 응용에 일반적으로 사용되는 B 및 K-12 균주가 있습니다. 그러나 일부 변종은 해롭고 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다.
    E. coli는 박테리아가 조작하기 쉽기 때문에 현대 생물 공학과 산업 미생물학에서 중요한 역할을합니다. 대장균을 자주 사용하는 일반적인 실험실 응용 프로그램, 예를 들어 재조합 디옥시리보 핵산 (DNA)을 만들거나 모델 생물로 작용하는 경우.
    대장균은 이종 단백질 생산을위한 매우 다양한 호스트이며 대장균에서 재조합 단백질을 생산할 수있는 다양한 단백질 발현 시스템이 있습니다. 단백질의 높은 수준의 발현을 허용하는 플라스미드를 사용하여, 유전자가 박테리아에 도입 될 수 있으며, 이는 산업 발효 과정에서 대량으로 이러한 단백질을 생산할 수있게한다.
    대장균은 인슐린을 생산하는 세포 공장으로 사용됩니다. 추가 응용 분야에는 변형된 대장균 세포를 사용하여 백신과 고정된 효소를 개발 및 생산하고, 바이오 연료를 생산하고, 생물학적 정화를 위한 것이 포함됩니다.
    K-12 균주는 효소 인 ALK (Alkaline Phosphatase)를 과발현하는 E. coli의 돌연변이 형태이다. 이 돌연변이는 효소를 끊임없이 코드하는 유전자의 결함으로 인해 발생합니다. 유전자가 어떠한 억제도 일으키지 않는 생성물을 생산하는 경우 이는 구성적인 활동으로 알려져있다. 이 특정 돌연변이 형태는 ALP 효소의 분리 및 정제에 사용됩니다.
    대장균 균은 또한 세포 공장으로 널리 사용됩니다. 엔지니어링 된 미생물 (예를 들어, 박테리아) 및 식물 세포는 소위 세포 공장으로 사용될 수 있습니다. 이러한 유전자 변형 세포는 제약, 식품 및 화학 산업에서 예를 들어 사용되는 분자, 화학 물질, 폴리머, 단백질 및 기타 물질을 생산합니다. 이러한 생체 공학 세포의 내부에서 생산된 분자를 방출하기 위해 초음파 용해는 세포벽을 방해하고 대상 물질을 주변 액체로 이송하는 일반적인 방법입니다. 바이오 엔지니어링 세포의 용해에 대해 자세히 읽어보십시오!

    초음파 DNA 절단

    초음파 전단력은 세포 내부에서 분자, 세포 기관 및 단백질을 방출하고 DNA 가닥을 조각으로 분해하는 데 일반적으로 사용되는 방법입니다. 음향 캐비테이션은 세포벽과 막을 파괴하여 세포에서 DNA를 추출하고 약 600개의 단편을 생성합니다 – 800 bp의 길이로 분석에 이상적입니다.
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    문학 / 참고 문헌


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