초음파 처리를 통한 SARS-CoV-2 코로나바이러스 비활성화 프로토콜

Hielscher VialTweeter는 코로나 바이러스 SARS-COV-2를 비활성화하는 데 사용되는 독특한 초음파 다중 샘플 준비 장치입니다. VialTwitterer는 최대 10개의 시료 바이알을 동시에 준비할 수 있으므로 대량 시료 처리에 이상적인 장치입니다.

VialTwitter를 사용한 SARS-CoV-2 코로나바이러스 비활성화

정착제를 제거한 후, 단층을 인산염 완충 식염수 (PBS)로 3 번 세척 한 후 세포를 1mL MEM / 5 % FBS로 긁어내고 Hielscher 초음파 프로세서를 사용하여 초음파 처리 (3 × 10 초 켜짐, 100 % 출력 및 진폭에서 10 초 꺼짐)를 처리했습니다 UP200St(VialTwitter 포함) 첨부 파일. 상층액은 3000×g에서 10분 동안 원심분리하여 정화하였다. 

아래에서 Welch et al. (2020)의 SARS-CoV-2 코로나바이러스 불활화에 대한 전체 프로토콜을 읽어보십시오.

세포와 바이러스

Vero E6 셀(Vero C1008; ATCC CRL-1586)을 10%(v/v) 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 변형된 Eagle's 최소 필수 배지(MEM)에서 배양하였다. 사용된 바이러스는 SARS-CoV-2 균주 hCOV-19/England/2/2020이며, 2020년 1월 29일 영국의 첫 번째 환자 클러스터에서 PHE로 분리했습니다. 이 바이러스는 통로 1에서 얻어졌으며 통로 2 또는 3에서 불활성화 연구에 사용되었습니다.
SARS-CoV-2 불활성화 및 시약 세포 독성 제거에 사용되는 시약 및 화학 물질에 대해서는 Welch et al. (2020)의 과학 보고서를 참조하십시오.

세제에 의한 바이러스 불활화 – SARS-CoV-2 코로나바이러스 불활화 프로토콜, Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 불활화

상업용 제품의 경우 바이러스 제제(조직 배양액, 1 × 10 범위의 역가⁶ 에 1 × 10⁸ PFU/ml)를 제조업체의 사용 지침에서 권장하는 농도 및 접촉 시간(사용 가능한 경우) 또는 테스트 실험실에서 특별히 요구하는 농도 및 시간에 대해 시약으로 삼중 처리했습니다. 제조업체가 농도 범위를 제공한 경우 제품 대 샘플의 가장 낮은 비율(즉, 테스트 제품의 가장 낮은 권장 농도)을 테스트했습니다. 시료 수송 튜브 시약은 제조업체가 시약 대비 시료 유체의 부피 비율을 지정하지 않는 한 조직 배양 유체 1부피와 시약 10부피의 비율을 사용하여 테스트했습니다. 세제, 고정제 및 용제는 표시된 시간 동안 표시된 농도에서 테스트되었습니다. 모든 비활성화 단계는 주변 실온(18 – 25°C)에서 수행되었습니다. 대체 시료 유형의 시험을 위해 바이러스를 1:9의 비율로 표시된 시료 매트릭스에 스파이크한 후 위와 같이 시험 시약으로 처리했습니다. 모든 실험에는 테스트 시약 대신 동일한 부피의 PBS가 있는 삼중 대조군 모의 처리 샘플이 포함되었습니다. 필요한 접촉 시간 직후, 적절하게 선택된 여과 매트릭스를 사용하여 처리된 샘플 1mL를 처리했습니다. 불활화 검사를 위한 시약 제거는 Pierce 4mL Detergent Removal Spin Column(Thermo Fisher)을 사용하거나 빈 Pierce 10mL 용량의 원심분리기 column(Thermo Fisher)에 SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR 또는 Sephadex LH-20을 채워 4mL 충전된 비드/수지를 제공하는 방식으로 더 큰 스핀 컬럼 형식으로 수행되었습니다. Amicon 필터를 사용한 정제를 위해 2개 × 500μl 샘플을 앞서 설명한 방법에 따라 2개의 원심 필터를 사용하여 정제한 다음 함께 풀링했습니다. 글루타르알데히드 제거 기능이 있는 포름알데히드 및 포름알데히드의 경우 1× 500μl 샘플 부피로 하나의 필터를 사용하고 500μl PBS에서 처리 후 재현탁하고 400ul MEM/5% FBS에 첨가했습니다. 감염된 사람의 비활성화를 위해 단층, 12.5 cm² Vero E6 셀 플라스크(2.5 × 10⁶ 2.5mL MEM/5% FBS의 세포/플라스크)를 MOI 0.001에서 감염시키고 37°C/5% CO에서 배양했습니다.₂ 24 시간 동안. 상층액을 제거하고, 5mL의 포름알데히드 또는 포름알데히드와 글루타르알데히드를 사용하여 실온에서 15분 또는 60분 동안 세포를 고정시켰다. 정착제를 제거하고, PBS로 단층을 3 번 세척 한 후 세포를 1mL MEM / 5 % FBS로 긁어내고 VialTweeter 부착 장치 (Hielscher 초음파 기술)와 UP200St를 사용하여 초음파 처리 (3 × 10 초 켜짐, 100 % 전력 및 진폭에서 10 초 꺼짐). 상층액은 3000×g에서 10분 동안 원심분리하여 정화하였다.

Welch et al. 2020의 프로토콜에 따라 초음파 VialTweeter를 사용한 SARS-CoV-2 코로나바이러스 비활성화에 사용되는 시약의 세부 정보

Hielscher VialTweeter 사용을 포함한 전체 프로토콜은 다음에서 확인할 수 있습니다.
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

정교한 초음파 Dismembrator 및 세포 교란기

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