Drosophila melanogaster 시료의 초음파 세포 용해

Drosophila melanogaster는 실험실에서 모델 생물로 널리 사용됩니다. 따라서 Drosophila melanogaster 시료의 세포 용해, 세포 파쇄, 단백질 추출 및 DNA 전단과 같은 분석 전 준비 단계를 빈번하게 수행해야 합니다. 초음파 파쇄기는 신뢰성이 높고 효율적이며, 초음파 공정 매개변수만 조정하여 세포 용해, 단백질 추출 또는 DNA 단편화와 같은 다양한 작업을 손쉽게 수행할 수 있습니다. 따라서 초음파 균질기는 광범위한 용도에 활용할 수 있는 유연한 도구입니다.

초음파 세포 용해 및 단백질 추출

세포 용해, 세포 가용화, 조직 균질화 및 단백질 추출은 생물학 실험실에서 초음파 파쇄기로 수행하는 대표적인 작업입니다. 초음파 파쇄기와 세포 파쇄기는 동물 조직, 곤충(예: Drosophila melanogaster, C. elegans) 또는 식물 표본을 균질화하는 데 매우 적합합니다. 초음파 처리의 후속 응용에는 세포 현탁액과 펠릿의 세포 용해 및 세포 내 단백질 추출이 포함됩니다.
초음파 세포 용해 및 단백질 추출은 신뢰성과 재현성이 매우 높은 공정으로, 확립된 프로토콜에 따라 수행할 수 있습니다. 진폭, 사이클 / 펄스 모드, 온도 및 시료 부피와 같은 초음파 처리 매개변수로 초음파 공정 강도를 정확하게 조정할 수 있으므로, 한 번 검증된 프로토콜은 동일한 결과를 얻으며 거듭 반복할 수 있습니다.

초음파 DNA 및 RNA 단편화

세포 용해와 단백질 추출 후 시료 전처리에서 일반적으로 필요한 단계는 DNA, RNA 및 염색질의 전단과 단편화이며, 예를 들어 염색질 면역침강(ChIP) 전에 수행합니다. 물리적 힘으로 DNA를 결합하고 있는 공유 결합을 끊어 DNA 및 RNA 단편화를 신뢰성 있게 수행할 수 있습니다. 초음파 처리와 같은 물리적 전단을 이용하면 먼저 DNA 가닥이 끊어지고, 이어서 DNA가 더 작은 조각으로 단편화됩니다.
초음파 DNA 단편화는 DNA를 목표 길이, 예를 들어 500bp(염기쌍)로 전단하는 데 신뢰성이 높고 효율적입니다. 초음파 DNA 단편화의 주요 장점으로는 초음파 공정 매개변수와 강도를 정밀하게 제어할 수 있다는 점이 있습니다. 초음파 처리 강도, 사이클 및 시간을 정밀하게 조절하여 초음파 공정 매개변수를 조정할 수 있습니다. 이를 통해 원하는 크기의 DNA를 생성할 수 있으며, 목표 DNA 길이를 신뢰성 있게 생성하고 재현할 수 있습니다. 초음파 DNA 전단은 고분자량 DNA 단편을 생성하는 데에도 이상적입니다.

Drosophila melanogaster의 초음파 세포 용해 프로토콜

아래에서 초파리 시료의 초음파 보조 세포 용해, 단백질 추출 및 DNA 또는 염색질 단편화를 위한 다양한 프로토콜을 확인할 수 있습니다.

가교 면역침강(CLIP) 분석을 위한 초음파 세포 용해

CLIP 분석은 이전에 보고된 방법을 일부 수정하여 수행했습니다. 생후 0–1일 된 야생형 암컷에서 얻은 난소 약 20 mg을 UV로 가교하고(3 × 2000 μJ/cm2), 300 U RNAseOUT을 첨가한 1 mL RCB 완충액(50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM 자당, 1 mM DTT, 1× EDTA 무함유 Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF)에서 얼음 위에서 균질화한 다음, 얼음 위에 30 min 동안 두었습니다. 균질액을 얼음 위에서 출력 80%로, 각 처리 사이에 60 s의 휴지 시간을 두고 20 s씩 다섯 번 초음파 처리하기 위해 Hielscher 초음파 프로세서 UP100H (100 W, 30 kHz)를 사용하였으며, 이어서 원심분리하였다(4°C에서 16,000 × g로 5 min). 가용성 추출액은 20 μl의 Protein-G dynabeads를 사용하여 4°C에서 20 min 동안 사전 정제하였다. 면역블로팅 및 투입 RNA 정량(1%)을 위한 시료를 덜어낸 후, 사전 정제한 추출액 450 μl에 항-HP1 9A9 항체와 50 μl의 Protein-G dynabeads를 넣고 4 h 동안 배양하여 HP1을 면역침전시켰다. 면역침전물은 RCB로 4회 세척하였다. 면역침전된 RNA를 용출하기 위해 침전된 비드를 100 μL의 UltraPure DEPC 처리수에서 5 min 동안 끓였다. RNA 조제를 위해 회수한 상등액에 900 μL의 Qiazol Reagent를 첨가하였다. 정제한 RNA를 주형으로 사용하고, 제조사의 프로토콜에 따라 oligo dT, 무작위 헥사머 및 SuperScript 역전사효소 III를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
(Cassale et al. 2019)

염색질 면역침전 분석을 위한 초음파 세포 용해

염색질 면역침전은 Menet이 기술한 방법을 약간 수정하여 수행하였다. 0–1일령 야생형 암컷에서 얻은 약 20 mg의 난소를 1 mL의 NEB 완충액(10 mM HEPES-Na, pH 8.0, 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na, pH 8, 0.5 mM EDTA-Na, pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM 스페르미딘, 0.15 mM 스페르민, 1× EDTA 무첨가 Complete Protease Inhibitors)에서 균질기 / 침지형 분산기를 사용하여 1 min 동안 균질화하였다(3000 rpm). 균질액을 미리 냉각한 유리 Dounce 균질기로 옮긴 후, 밀착형 페슬로 완전한 왕복 운동을 15회 수행하였다. 이어서 유리된 핵을 4°C에서 6000xg로 10 min 동안 원심분리하였다. 핵이 포함된 침전물을 1 mL의 NEB에 재현탁하고, 자당 밀도 구배(NEB에 용해한 1.6 M 자당 0.65 mL, NEB에 용해한 0.8 M 자당 0.35 mL)에서 20,000 × g로 20 min 동안 원심분리하였다. 침전물을 1 mL의 NEB에 재현탁하고 포름알데히드의 최종 농도가 1%가 되도록 첨가하였다. 핵을 실온에서 10 min 동안 가교한 후, 1.375 M 글리신을 1/10 vol 첨가하여 반응을 중지하였다. 6000 × g로 5 min 동안 원심분리하여 핵을 수집하였다. 핵을 1 mL의 NEB로 두 번 세척하고, 1 mL의 세포 용해 완충액(15 mM HEPES-Na, pH 7.6, 140 mM NaCl, 0.5 mM EGTA, 1 mM EDTA, pH 8, 1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% 데옥시콜산 나트륨, 0.1% SDS, 0.5% N-라우로일사르코신 및 1× EDTA 무첨가 Complete Protease Inhibitors)에 재현탁하였다. 핵은 Hielscher 초음파 프로세서 UP100H (100 W, 30 kHz)를 사용하여 20 s 동안 초음파를 가하고 1 min 동안 얼음 위에 두는 과정을 여섯 번 반복하여 초음파 처리하였다. 초음파 처리한 핵을 4°C에서 13,000 × g로 4 min 동안 원심분리하였다. 초음파 처리한 염색질 대부분의 길이는 500–1000 염기쌍(bp)이었다. 각 면역침전에서는 15 μg의 염색질을 10 μg의 HP1 9A9 단클론 항체 존재하에 배양하였다(4°C에서 회전 휠을 사용하여 3 h). 이어서 50 μl의 dynabeads protein G를 첨가하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양을 계속하였다. 상등액을 버리고 시료를 세포 용해 완충액으로 두 번(각 세척은 4 °C에서 15 min), TE 완충액(1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl, pH 8)으로 두 번 세척하였다. 염색질은 두 단계로 비드에서 용출하였다. 먼저 100 μl의 용출 완충액 1(10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl, pH 8)에서 65°C로 15 min 동안 처리한 후 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 비드에 남은 물질은 100 μl의 TE + 0.67% SDS로 재추출하였다. 합친 용출액(200 μl)을 65°C에서 하룻밤 동안 배양하여 가교를 해제한 후, 50 μg/ml RNaseA로 65°C에서 15 min 동안, 500 μg/ml Proteinase K로 65°C에서 3 h 동안 처리하였다. 시료를 페놀–클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켰다. DNA는 25 μl의 물에 재현탁하였다. 면역침전한 DNA를 이용한 분자 분석을 극대화하기 위해, 단일 반응에서 융해 온도가 유사한 서로 다른 두 프라이머 세트를 사용하는 최적화된 듀플렉스 PCR 프로토콜을 통해 후보 유전자를 쌍으로 증폭하였다.
(Casale et al. 2019)
 

생물학적 시료용 고성능 초음파 세포 파쇄기

Hielscher Ultrasonics는 세포 파쇄, 세포 용해, 단백질 추출, DNA, RNA 및 염색질 단편화와 기타 분석 전 시료 전처리 단계에 사용하는 고성능 초음파 처리기 분야에서 오랜 경험을 쌓아 온 파트너입니다. Hielscher는 실험실용 초음파 균질기와 시료 전처리 장치로 구성된 포괄적인 제품군을 제공하며, 고객의 생물학적 응용 분야와 요구 사항에 이상적인 초음파 장치를 갖추고 있습니다.
마이크로팁이 장착된 일반적인 프로브형 초음파 처리기인 UP200St (200W; 왼쪽 사진 참조) 같은 모델이나 초음파 시료 전처리 장치인 VialTweeter 또는 UP200ST_TD_CupHorn에 VialHolder를 장착한 모델은 연구 및 분석 실험실에서 선호하는 모델입니다. 일반적인 초음파 프로브는 세포 용해, 추출 또는 단편화해야 하는 시료 수가 적을 때 이상적입니다. 시료 전처리 장치인 VialTweeter와 UP200St_TD_CupHorn은 각각 최대 10개 또는 5개의 바이알을 동시에 초음파 처리할 수 있습니다.
많은 수의 시료(예: 96웰 플레이트, 마이크로타이터 플레이트 등)를 처리해야 하는 경우에는 UIP400MTP는 이상적인 초음파 처리 시스템입니다. UIP400MTP는 물을 채우고 마이크로웰 플레이트를 넣을 수 있는 충분한 공간을 갖춘 더 큰 cuphorn처럼 작동합니다. 강력한 400와트 초음파 프로세서로 구동되는 UIP400MTP는 멀티웰 플레이트에 매우 균일하고 강도 높은 초음파 처리를 제공하여 세포를 파쇄하고, 시료를 용해하고, 펠릿을 가용화하고, 단백질을 추출하거나 DNA를 전단합니다.

스마트 소프트웨어를 통한 정밀 제어

200와트 이상의 모든 Hielscher 초음파 처리 솔루션에는 디지털 컬러 터치스크린과 지능형 소프트웨어가 탑재되어 있습니다. 스마트 데이터 기록 기능을 통해 초음파 처리기가 가동되는 즉시 모든 초음파 공정 매개변수가 내장 SD 카드에 CSV 파일로 자동 저장됩니다. 따라서 연구와 기록 작업이 훨씬 편리해집니다. 초음파 처리 시험이나 시료 전처리 후에는 각 초음파 처리 실행의 매개변수를 간편하게 검토하고 비교할 수 있습니다.
직관적인 메뉴를 통해 초음파 처리 전에 다양한 매개변수를 미리 설정할 수 있습니다. 예를 들어, 시료의 온도를 제어하고 열에 의한 분해를 방지하기 위해 시료 온도의 상한을 설정할 수 있습니다. 초음파 장치와 함께 제공되는 연결식 온도 센서는 실제 초음파 처리 온도를 초음파 프로세서에 피드백합니다. 온도 상한에 도달하면 초음파 장치는 설정된 ∆T의 하한에 도달할 때까지 작동을 일시 중지한 다음 자동으로 초음파 처리를 다시 시작합니다.
특정 에너지 투입량으로 초음파 처리를 해야 하는 경우, 해당 처리 실행의 최종 초음파 에너지를 미리 설정할 수 있습니다. 물론 초음파 펄스 및 사이클 모드도 개별적으로 설정할 수 있습니다.
가장 성공적인 초음파 처리 매개변수를 재사용하려면 다양한 초음파 처리 모드(예: 초음파 처리 시간, 강도, 사이클 모드 등)를 사전 설정 모드로 저장하여 쉽고 빠르게 다시 시작할 수 있습니다.
조작 편의성을 더욱 높이기 위해 모든 디지털 초음파 장치는 일반적인 모든 브라우저(예: InternetExplorer, Safari, Chrome 등)에서 브라우저 원격 제어로 조작할 수 있습니다. LAN 연결은 간단한 플러그 앤 플레이 방식이며 추가 소프트웨어 설치가 필요하지 않습니다.
Hielscher는 생물학적 시료를 성공적으로 초음파 처리하려면 정밀성과 반복성이 필요하다는 것을 알고 있습니다. 따라서 효율적이고 신뢰할 수 있으며 재현성이 높고 편리한 시료 전처리를 가능하게 하는 모든 기능을 갖춘 스마트 장치로 초음파 처리기를 설계했습니다.

아래 표는 다수의 시료를 편리하고 신뢰성 있게 전처리하기 위한 초음파 마이크로팁과 일반적인 초음파 균질기부터 MultiSample 초음파 처리기에 이르는 당사 초음파 시스템의 대략적인 처리 용량을 보여 줍니다.