드로소필라 멜라노가스터 샘플의 초음파 리시스

Drosophila 멜라노가스터는 모델 유기체로서 실험실에서 널리 사용됩니다. 따라서, Drosophila 멜라노가스터 샘플의 용해, 세포 중단, 단백질 추출 및 DNA 전단과 같은 사전 분석 준비 단계는 자주 수행되어야 합니다. 초음파 디스넴브레이터는 안정적이고 효율적이며 초음파 공정 파라미터만 조정하여 용해, 단백질 추출 또는 DNA 단편화와 같은 다양한 작업을 쉽게 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 초음파 균질화는 광범위한 응용 분야의 유연한 도구입니다.

초음파 리시스 및 단백질 추출

용해, 세포 용해화, 조직 균질화 및 단백질 추출은 생물학적 실험실에서 초음파 dismembrators를위한 전형적인 작업입니다. 초음파 dismembrators 및 세포 파괴자는 동물 조직, 곤충 (예를 들면, Drosophila melanogaster, C. elegans) 또는 식물 표본을 균질화하기에 적합합니다. 초음파의 후속 응용 프로그램은 세포 현탁액 및 펠릿의 용해뿐만 아니라 세포 내 단백질의 추출입니다.
초음파 용해 및 단백질 추출은 확립 된 프로토콜에 기초하여 수행 할 수있는 매우 신뢰할 수있는 재현 가능한 과정입니다. 초음파 공정 강도는 진폭, 사이클 / 펄스 모드, 온도 및 샘플 볼륨과 같은 초음파 매개 변수를 통해 정확하게 조정할 수 있기 때문에 입증 된 프로토콜이 동일한 결과를 반복해서 반복 할 수 있습니다.

초음파 DNA 및 RNA 단편화

세포 용해 및 단백질 추출 후, 샘플 준비에서 일반적인 필수 단계는 DNA, RNA 및 크로마틴의 전단 및 단편화(예: 크로마틴 면역 침전물(ChIP) 이전이다. DNA와 RNA 단편화는 물리적 힘에 의해 DNA를 함께 유지하는 공유 결합을 끊어 안정적으로 달성 될 수있다. 초음파 처리와 같은 물리적 전단을 사용하여 처음에는 DNA 가닥이 깨지고 DNA가 더 작은 조각으로 조각됩니다.
초음파 DNA 단편화는 500bp (기본 쌍)와 같은 표적 길이로 전단 DNA에서 안정적이고 효율적입니다. 초음파 DNA 단편화의 주요 장점은 초음파 공정 매개 변수 및 강도의 정밀한 제어를 포함한다. 초음파 공정 파라미터는 초음파 처리 강도, 사이클 및 시간을 정확하게 조정하여 조정할 수 있습니다. 이를 통해 원하는 DNA 크기를 만들 수 있으며 표적 DNA 길이는 재현뿐만 아니라 안정적으로 생성될 수 있습니다. 초음파 DNA 전단은 또한 높은 분자량 DNA 단편을 만드는 것이 이상적입니다.

드로소필라 멜라노가스터의 초음파 용해에 대한 프로토콜

아래에서 Drosophila 샘플의 초음파 보조 용해, 단백질 추출 및 DNA 또는 크로마티닌 단편화를 위한 다양한 프로토콜을 찾을 수 있습니다.

교차 연결 면역 침전 (CLIP) 분석용 초음파 용해

CLIP 분석은 이전에 보고된 대로 일부 수정사항으로 수행되었습니다. 0-1일 의 약 20mg 난소는 UV 크로스링크(3× 2000 μJ/cm2), 1mL RCB 버퍼(50mM HEPES pH 7.4)로 얼음에 균질화되었다. 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% 트리톤 X-100, 250 mM 자당, 1 mM DTT, 1× EDTA 프리 완전 프로테아제 억제제, 1 mM PMSF) 300 U RNAseOUT로 보충 하고 30 분 동안 얼음에 배치. 동형질은 80%의 힘으로 얼음 위에 초음파 처리되었고, 20대 에서 5번, Hielscher 초음파 프로세서를 사용하는 사이에 60년대 의 휴식이 있었습니다. UP100H (100W, 30kHz) 원심 분리 (16000 × g는 4 °C에서 5 분). 수용성 추출물은 4°C에서 20분 동안 20 μl 단백질-G 다이나비드로 미리 지워졌습니다. 면역블로팅 및 RNA 입력(1%)의 양을 제거하기 위한 시료를 제거한 후, HP1은 50 μl Protein-G 다이나비드를 사용하여 4시간 동안 배양하여 450 μl 프리클리어 추출물로부터 항 HP1 9A9 항체로 면역침전을 하였다. 면역 절전제는 RCB로 4번 세척되었다. 면역절전 RNA를 용인하기 위해 펠렛 구슬은 5분 동안 울트라퓨어 드PC 처리 수의 100 μL으로 끓여RNA 제제를 위해 회수된 상내에 첨가하였다. 정제된 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 올리고 dT, 랜덤 hexamers 및 SuperScript 역전사 III를 사용하여 cDNA를 합성하기 위한 템플릿으로 사용되었다.
(Cassale 외. 2019)

크로마틴 면역 침전 분석용 초음파 용해

크로마틴 면역 침전은 경미한 수정을 통해 Menet에 의해 기술된 방법에 따라 수행되었다. 약 20 mg 난소0-1일 된 야생형 암컷은 NEB 버퍼 1mL(pH 8.0, 10mM Na at pH 8.0, 10mM NaCl에서 10mH-Na)에서 균질화되었다. 0.1 mM EGTA-Na at pH 8, 0.5 mM EDTA-Na at pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM Spermidine, 0.15 mM Spermine, 1× EDTA-무료 완전 프로테아제 억제제)와 동종제 /담근 10 rpm (30 rpm). 호모게네이트는 미리 차가운 유리 두드리기로 옮겨졌고 15개의 전체 스트로크는 단단한 유봉으로 적용되었습니다. 자유 핵은 4°C에서 10분 동안 6000xg에서 원심분리하였다. 핵 함유 펠릿은 NEB의 1mL에서 재중단되었고, 20000× g에서 20분 간 20분 간 원심분리(NEB에서 1.6m 자당0.6mL, NEB에서 0.35mL0.35mL). 펠릿은 NEB와 포름알데히드의 1mL에서 1%의 최종 농도로 재중단되었다. 핵은 실온에서 10 분 동안 교차 연결되었고 1.375 M 글리신의 1/10 vol을 추가하여 담금질했습니다. 핵은 5 분 동안 6000 × g에서 원심분리에 의해 수집되었다. 핵은 NEB의 1mL에서 두 번 세척하고 리시스 버퍼의 1 mL (pH 7.6에서 15 mM HEPES-Na에서 15 mM HEPES-Na에서 재중단되었습니다. 140mM NaCl, 0.5 mM EGTA, pH 8에서 1mM EDTA, 1% 트리톤 X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% 나디코콜레이트, 0.1% SDS, 0.5% N-lauroylsarcosine 및 1× EDTA-무료 완전 프로 억제제). 핵은 Hielscher 초음파 프로세서를 사용하여 초음파 처리되었습니다. UP100H (100W, 30kHz) 20대 6회, 얼음 1분. 초음파 처리된 핵은 4°C에서 4분 동안 13000 × g에서 원심분리하였다. 초음파 염색체의 대부분은 길이가 500에서 1000 베이스 쌍 (bp)이었다. 각 면역 침전을 위해, 크롬틴의 15 μg는 HP1 9A9 단클론 항체의 10 μg (회전 바퀴에서 4°C에서 3 시간)의 존재에서 배양되었다. 이어서, 다이나비즈 단백질 G의 50μl을 첨가하고 잠복기가 4°C에서 하룻밤 동안 계속되었다. 수퍼나탈트는 폐기되고 샘플을 리시스 버퍼(각 세척 15분 4°C)에서 두 번 세척하고 TE 버퍼(1mM EDTA, pH 8에서 10mM TrisHCl)로 두 번 세척하였다. 크로마틴은 두 단계로 구슬에서 출루되었다. 엘루이온 버퍼 1(10mM EDTA, 1% SDS, pH 8에서 50mM TrisHCl)의 100μl에서 15분 동안 65°C에서 15분 동안 원심분리 및 상퍼트의 회수가 뒤따랐다. 비드 재료는 TE + 0.67% SDS의 100 μl에서 재추출하였다. 결합 된 용출액 (200 μl)은 교차 링크를 반전하기 위해 65 °C에서 하룻밤 동안 배양되었고 65 ° C에서 15 분 동안 50 μg / ml RNaseA로 처리하고 65 ° C에서 3 시간 동안 50μg /ml Proteinase K로 처리되었습니다. 시료는 페놀-클로로폼 추출 및 에탄올 침전시켰다. DNA는 25 μl의 물에서 다시 중단되었습니다. DNA 면역 절전을 통한 분자 분석을 최대화하기 위해, 후보 유전자는 단일 반응에서 유사한 용융 온도를 갖는 두 가지 프라이머 세트를 사용하여 최적화된 이중 PCR 프로토콜을 통해 쌍으로 증폭되었다.
(카살레 외 2019)

생물학적 샘플을 위한 고성능 초음파 세포 파괴기

Hielscher 초음파는 세포 중단, 용해, 단백질 추출, DNA, RNA 및 크로마틴 단편화뿐만 아니라 다른 사전 분석 샘플 준비 단계에 대한 고성능 초음파 검사기에 관해서 오랜 경험이 풍부한 파트너입니다. 초음파 실험실 균질화 및 샘플 준비 장치의 포괄적 인 포트폴리오를 제공하는 Hielscher는 생물학적 응용 프로그램 및 요구 사항에 이상적인 초음파 장치를 보유하고 있습니다.
마이크로 팁과 같은 마이크로 팁이 있는 클래식 프로브 형 초음파 처리기 UP200St (200W; 왼쪽 그림 참조) 또는 초음파 샘플 준비 장치 중 하나 유리 병 또는 UP200St_TD_CupHorn VialHolder와 연구 및 분석 실험실에서 좋아하는 모델입니다. 고전적인 초음파 프로브는 더 적은 샘플을 준비할 때 lysed, 추출 또는 단편화해야합니다. 샘플 준비 유닛 VialTweeter 및 UP200St_TD_CupHorn 각각 최대 10 또는 5 개의 바이알의 동시 초음파 처리를 허용합니다.
높은 샘플 번호(예: 96웰 플레이트, 마이크로티터 플레이트 등)를 처리해야 하는 경우 UIP400MTP 이상적인 초음파 설정입니다. UIP400MTP는 물로 채워져 마이크로 웰 플레이트를 보유하기에 충분한 공간을 가진 더 큰 컵혼과 같은 기능을 제공합니다. 400와트의 강력한 초음파 프로세서로 구동되는 UIP400MTP는 세포를 방해하고, lyse 샘플을 흡입하고, 펠릿을 용해시키고, 단백질을 추출하거나, DNA를 추출하기 위해 멀티 웰 플레이트의 매우 균일하고 강렬한 초음파 처리를 제공합니다.

스마트 소프트웨어를 통한 정밀 제어

200와트의 모든 Hielscher 초음파 처리 솔루션에는 디지털 컬러 터치 스크린과 지능형 소프트웨어가 장착되어 있습니다. 스마트 데이터 프로토콜을 통해 모든 초음파 공정 매개 변수는 초음파가 시작되는 즉시 내장 된 SD 카드에 CSV 파일로 자동으로 저장됩니다. 이것은 연구와 프로토콜을 훨씬 더 편리하게 만듭니다. 초음파 처리 시험 또는 샘플 준비 후, 당신은 단순히 각 초음파 실행의 초음파 처리 매개 변수를 검토하고 비교할 수 있습니다.
직관적인 메뉴를 통해 초음파 처리 전에 수많은 매개 변수를 미리 설정할 수 있습니다: 예를 들어, 샘플의 온도를 제어하고 열 열 저하를 방지하기 위해 시료 온도의 상한을 설정할 수 있습니다. 초음파 장치와 함께 제공되는 플러그 형 온도 센서는 실제 초음파 처리기에게 실제 초음파 처리기피드백을 제공합니다. 상온 한계에 도달하면 초음파 장치는 세트의 하한∆T에 도달하고 다시 자동으로 초음파 처리될 때까지 일시 중지됩니다.
특정 에너지 입력을 가진 초음파 처리가 필요한 경우 초음파 처리 실행의 최종 초음파 에너지를 미리 설정할 수 있습니다. 물론 초음파 박동 및 사이클 모드도 개별적으로 설정할 수 있습니다.
가장 성공적인 초음파 처리 매개 변수를 다시 사용하려면 다양한 초음파 처리 모드 (예 : 초음파 처리 시간, 강도, 사이클 모드 등)를 사전 설정된 모드로 저장하여 쉽고 빠르게 다시 시작할 수 있습니다.
보다 운영 편의를 위해 모든 디지털 초음파 장치는 일반적인 브라우저(예: InternetExplorer, Safari, Chrome 등)의 브라우저 리모컨을 통해 작동할 수 있습니다. LAN 연결은 간단한 플러그 앤 플레이 설정이며 추가 소프트웨어 설치가 필요하지 않습니다.
Hielscher는 생물학적 샘플의 성공적인 초음파 처리에는 정밀도와 반복성이 필요하다는 것을 알고 있습니다. 따라서, 우리는 효율적이고 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 편리한 샘플 준비를 가능하게하는 모든 기능을 갖춘 초음파 장치를 스마트 장치로 설계했습니다.

아래 표는 초음파 마이크로 팁과 고전적인 초음파 균질화에서 멀티 샘플 초음파 에 이르기까지 초음파 시스템의 대략적인 처리 능력을 표시하여 수많은 샘플을 편리하고 신뢰할 수있는 준비시 제공합니다.