Drosophila Melanogaster 샘플의 초음파 용해

Drosophila melanogaster는 모델 유기체로 실험실에서 널리 사용됩니다. 따라서 Drosophila melanogaster 샘플의 용해, 세포 파괴, 단백질 추출 및 DNA 전단과 같은 사전 분석 준비 단계를 자주 수행해야 합니다. 초음파 dismembrator는 신뢰할 수 있고 효율적이며 초음파 공정 매개 변수 만 조정하여 용해, 단백질 추출 또는 DNA 단편화와 같은 다양한 작업을 쉽게 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 초음파 균질화기는 광범위한 응용 분야를 가진 유연한 도구입니다.

초음파 용해 및 단백질 추출

용해, 세포 가용화, 조직 균질화 및 단백질 추출은 생물학 실험실에서 초음파 dismembrator의 일반적인 작업입니다. 초음파 dismembrator 및 cell disruptor는 동물 조직, 곤충(예: Drosophila melanogaster, C. elegans) 또는 식물 표본을 균질화하는 데 적합합니다. 초음파의 후속 응용 분야는 세포 현탁액 및 펠릿의 용해와 세포 내 단백질의 추출입니다.
초음파 용해 및 단백질 추출은 매우 신뢰할 수 있고 재현 가능한 공정으로 확립 된 프로토콜에 따라 수행 할 수 있습니다. 초음파 공정 강도는 진폭, 사이클 / 펄스 모드, 온도 및 샘플 볼륨과 같은 초음파 처리 매개 변수를 통해 정확하게 조정할 수 있기 때문에 한 번 입증 된 프로토콜은 동일한 결과로 계속해서 반복 될 수 있습니다.

초음파 DNA 및 RNA 단편화

세포 용해 및 단백질 추출 후 시료 전처리에서 일반적으로 필요한 단계는 DNA, RNA 및 염색질의 전단 및 단편화입니다(예: 염색질 면역침전(ChIP) 전). DNA와 RNA 단편화는 물리적 힘에 의해 DNA를 함께 유지하는 공유 결합을 끊음으로써 안정적으로 달성될 수 있습니다. 초음파 처리와 같은 물리적 전단을 사용하여 처음에는 DNA 가닥이 끊어진 다음 DNA가 더 작은 조각으로 조각화됩니다.
초음파 DNA 단편화는 DNA를 목표 길이(예: 500bp(염기쌍))까지 전단하는 데 신뢰할 수 있고 효율적입니다. 초음파 DNA 단편화의 주요 장점은 초음파 공정 매개 변수 및 강도의 정밀한 제어를 포함합니다. 초음파 공정 매개 변수는 초음파 강도,주기 및 시간을 정확하게 조정하여 조정할 수 있습니다. 이를 통해 원하는 DNA 크기를 생성할 수 있으며 표적 DNA 길이를 안정적으로 생산 및 재현할 수 있습니다. 초음파 DNA 전단은 또한 고분자량 DNA 단편을 만드는 데 이상적입니다.

Drosophila melanogaster의 초음파 용해를 위한 프로토콜

아래에서 초음파 보조 용해, 단백질 추출, 초파리 샘플의 DNA 또는 염색질 단편화를 위한 다양한 프로토콜을 찾을 수 있습니다.

Cross-linking Immunoprecipitation(CLIP) 분석을 위한 초음파 용해

CLIP 분석은 이전에 보고된 바와 같이 약간의 수정을 가하여 수행하였다. 0에서 1일령까지의 야생형 암컷 약 20mg의 난소를 UV 가교(3 × 2000 μJ/cm2)하고, 1 mL RCB 완충액(50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1 × EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF)에 300 U RNAseOUT을 보충하고 30분 동안 얼음 위에 두었습니다. 균질액은 Hielscher 초음파 프로세서를 사용하여 20 초 동안 60 초 동안 휴식을 취하고 80 % 전력으로 얼음 위에서 초음파 처리했습니다 UP100H(100W, 30kHz) 및 원심 분리 (4 ° C에서 5 분 동안 16000 × g). 용해성 추출물은 4°C에서 20분 동안 20μl Protein-G dynabeads로 사전 세척되었습니다. 면역블로팅(immunoblotting) 및 RNA 투입(1%)의 정량화를 위해 샘플을 제거한 후, HP1을 50μl Protein-G dynabeads로 4시간 동안 배양하여 450μl 사전 투명 추출물로부터 항-HP1 9A9 항체로 면역침전시켰습니다. 면역침전물을 RCB로 4회 세척하였다. 면역침강된 RNA를 용리하기 위해, 펠릿화된 비드를 100 μL의 초순수 DEPC 처리수에 5분 동안 끓였다. 900 μL 키아졸 시약을 RNA 준비를 위해 회수된 상층액에 첨가하였다. 정제된 RNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 oligo dT, 무작위 헥사머 및 SuperScript 역전사 효소 III를 사용하여 cDNA를 합성하기 위한 템플릿으로 사용되었습니다.
(Cassale 외. 2019)

Chromatin Immunoprecipitation Assay를 위한 초음파 용해

크로마틴 면역침전은 Menet에 의해 기술된 방법에 따라 약간의 수정을 가하여 수행하였다. 0-1일령에서 1일령의 야생형 암컷 대략 20mg의 난소를 1mL의 NEB 완충액(pH 8.0에서 10mM HEPES-Na, 10mM NaCl, pH 8에서 0.1mM EGTA-Na, pH 8에서 0.5mM EDTA-Na, 1mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5mM 스페르미딘, 0.15mM 스페르민, 1× EDTA-free 완전 프로테아제 억제제)에서 균질화기/침지 분산기를 사용하여 1분(3000rpm에서)을 균질화하였다. 균질액을 사전 냉각된 유리 dounce로 옮기고 단단한 유봉으로 15번의 전체 스트로크를 적용했습니다. 그런 다음 유리 핵을 4°C에서 10분 동안 6000xg에서 원심분리했습니다. 핵-함유 펠릿을 1 mL의 NEB에 재현탁시키고, 슈크로스 그래디언트(NEB에서 1.6M 슈크로스 0.65 mL, NEB에서 0.35 mL의 0.8 M 슈크로스)에서 20분 동안 20000 × g으로 원심분리하였다. 펠릿을 1mL의 NEB 및 포름알데히드에 최종 농도 1%로 재현탁시켰다. 핵을 실온에서 10분 동안 가교시키고 1.375M 글리신을 1/10 vol 첨가하여 담금질하였다. 핵을 6000×g에서 5분 동안 원심분리하여 수집하였다. 핵을 NEB 1mL에서 2회 세척하고 1mL의 용해 완충액(pH 7.6에서 15mM HEPES-Na, 140mM NaCl, 0.5mM EGTA, pH 8에서 1mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.5mM DTT, 0.1% Na Deoxycholate, 0.1% SDS, 0.5% N-라우로일사르코신 및 1× EDTA-free 완전 프로테아제 억제제)에 재현탁시켰다. 핵은 Hielscher 초음파 프로세서를 사용하여 초음파 처리되었습니다 UP100H(100W, 30kHz) 얼음 위에서 20초, 얼음 위에서 1분 동안 6번. 초음파 처리 된 핵을 4 ° C에서 4 분 동안 13000 × g에서 원심 분리 하였다. 초음파 처리 된 염색질의 대다수는 길이가 500 내지 1000 염기쌍 (bp)이었다. 각 면역침전에 대해 10μg의 HP1 9A9 단클론 항체(회전 휠에서 4°C에서 3시간)의 존재 하에 15μg의 크로마틴을 배양했습니다. 그런 다음 50 μl의 dynabeads 단백질 G를 첨가하고 4°C에서 밤새 배양을 계속했습니다. 상층액을 버리고 샘플을 용해 완충액에서 2회 세척하고(4°C에서 15분 세척) TE 완충액(pH 8에서 1mM EDTA, 10mM TrisHCl)에서 2회 세척했습니다. 염색질은 두 단계로 비드에서 용출되었습니다. 먼저 100μl의 용리 완충액 1(pH 8에서 10mM EDTA, 1% SDS, 50mM TrisHCl)을 65°C에서 15분 동안 주입한 후 상층액의 원심분리 및 회수를 수행합니다. 비드 물질을 100 μl의 TE + 0.67% SDS에서 다시 추출하였다. 결합된 용리액(200μl)을 65°C에서 밤새 배양하여 가교를 역전시키고 65°C에서 15분 동안 50μg/ml RNaseA로 처리한 후 65°C에서 3시간 동안 500μg/ml Proteinase K로 처리했습니다. 샘플은 페놀-클로로포름을 추출하고 에탄올을 침전시켰습니다. DNA를 25μl의 물에 재현탁시켰다. DNA immunoprecipitated로 분자 분석을 극대화하기 위해, 단일 반응에서 유사한 용융 온도를 가진 두 개의 서로 다른 프라이머 세트를 사용하여 최적화된 duplex-PCR 프로토콜을 통해 후보 유전자를 쌍으로 증폭했습니다.
(Casale 외, 2019)
 

생물학적 시료를 위한 고성능 초음파 세포 교란기

Hielscher 초음파는 세포 파괴, 용해, 단백질 추출, DNA, RNA 및 염색질 단편화 및 기타 사전 분석 샘플 준비 단계를위한 고성능 초음파와 관련하여 오랜 경험을 쌓은 파트너입니다. 초음파 실험실 균질화 기 및 시료 준비 장치의 포괄적 인 포트폴리오를 제공하는 Hielscher는 생물학적 응용 분야 및 요구 사항에 이상적인 초음파 장치를 보유하고 있습니다.
다음과 같은 마이크로 팁이 있는 고전적인 프로브 형 초음파기 UP200세인트 (200W, 왼쪽 그림 참조) 또는 초음파 시료 전처리 장치 중 하나 바이알트위터 또는 UP200St_TD_CupHorn VialHolder는 연구 및 분석 실험실에서 가장 좋아하는 모델입니다. 기존의 초음파 프로브는 더 적은 수의 샘플을 용해, 추출 또는 단편화해야 할 때 이상적입니다. 시료 전처리 장치인 VialTweeter 및 UP200St_TD_CupHorn는 각각 최대 10개 또는 5개의 바이알을 동시에 초음파 처리할 수 있습니다.
많은 수의 시료(예: 96웰 플레이트, 마이크로타이터 플레이트 등)를 처리해야 하는 경우 UIP400MTP 이상적인 초음파 처리 설정입니다. UIP400MTP는 물로 채워져 있고 마이크로 웰 플레이트를 수용할 수 있는 충분한 공간이 있는 더 큰 컵혼과 같은 기능을 합니다. 400 와트의 강력한 초음파 프로세서로 구동되는이 UIP400MTP은 세포를 파괴하고, 샘플을 용해하고, 펠릿을 용해하고, 단백질을 추출하거나 DNA를 전단하기 위해 멀티 웰 플레이트의 매우 균일하고 강렬한 초음파 처리를 제공합니다.

스마트 소프트웨어를 통한 정밀한 제어

200 와트 이상의 모든 Hielscher 초음파 처리 솔루션에는 디지털 컬러 터치 스크린과 지능형 소프트웨어가 장착되어 있습니다. 스마트 데이터 프로토콜을 통해 모든 초음파 공정 매개 변수는 초음파기가 시작되 자마자 내장 SD 카드에 CSV 파일로 자동 저장됩니다. 이를 통해 연구 및 프로토콜링이 훨씬 더 편리해집니다. 초음파 처리 시험 또는 샘플 준비 후에는 각 초음파 처리 실행의 초음파 처리 매개 변수를 간단히 검토하고 비교할 수 있습니다.
직관적 인 메뉴를 통해 초음파 처리 전에 수많은 매개 변수를 사전 설정할 수 있습니다 : 예를 들어, 샘플의 온도를 제어하고 열 저하를 방지하기 위해 샘플 온도의 상한을 설정할 수 있습니다. 초음파 장치와 함께 제공되는 플러그형 온도 센서는 초음파 프로세서에 실제 초음파 처리 온도에 대한 피드백을 제공합니다. 온도 상한에 도달하면 초음파 장치는 설정된 ∆T의 하한에 도달 할 때까지 일시 중지 된 다음 자동으로 다시 초음파 처리를 시작합니다.
특정 에너지 입력을 사용한 초음파 처리가 필요한 경우 초음파 처리의 최종 초음파 에너지를 미리 설정할 수 있습니다. 물론 초음파 맥동 및 사이클 모드도 개별적으로 설정할 수 있습니다.
가장 성공적인 초음파 처리 매개 변수를 재사용하려면 다양한 초음파 처리 모드 (예 : 초음파 처리 시간, 강도,주기 모드 등)를 사전 설정된 모드로 저장하여 쉽고 빠르게 다시 시작할 수 있습니다.
보다 조작상의 편의를 위해, 모든 디지털 초음파 장치는 임의의 일반 브라우저 (예를 들어, InternetExplorer, Safari, Chrome 등)에서 브라우저 원격 제어를 통해 작동될 수 있습니다. LAN 연결은 간단한 플러그 앤 플레이 설정이며 추가 소프트웨어 설치가 필요하지 않습니다.
Hielscher는 생물학적 샘플의 성공적인 초음파 처리를 위해서는 정밀도와 반복성이 필요하다는 것을 알고 있습니다. 따라서 우리는 초음파기를 효율적이고 신뢰할 수 있으며 재현 가능하고 편리한 샘플 준비를 가능하게하는 모든 기능을 갖춘 스마트 장치로 설계했습니다.

아래 표는 초음파 마이크로 팁 및 고전적인 초음파 균질화기에서 수많은 샘플의 편리하고 안정적인 준비를위한 MultiSample 초음파 발생기에 이르기까지 초음파 시스템의 대략적인 처리 용량을 나타냅니다.