ELISA 에세이용 초음파 샘플 준비

ELISA와 같은 소사는 체외 진단, 질병 관련 단백질 검출 및 품질 관리(예: 식품 알레르겐 모니터링)에 널리 사용됩니다. 초음파 시료 제제는 세포를 lyse하고 세포 내 단백질, DNA, RNA 및 세포기관을 분리하는 신속하고 신뢰할 수 있으며 재현 가능한 기술입니다. Hielscher 초음파는 단일 샘플, 여러 바이알뿐만 아니라 마이크로 티터 플레이트 및 96 웰 플레이트의 편리한 준비를위한 다양한 초음파 솔루션을 제공합니다.

Elisa – 효소-연결된 면역흡소벤트 분석

ELISA는 효소 연결 면역소벤트 분석을 의미하며 리간 결합 분석 의 범주의 널리 사용되는 생화학 분석 기술입니다. ELISA에서 특수 바인딩 특성을 가진 고정 된 고체 상에 액체 샘플이 추가됩니다. 일반적으로 고정고체 상은 웰 플레이트 또는 ELISA 플레이트에 코팅으로 적용됩니다. 이어서, 다양한 액체 시약이 순차적으로 첨가, 인큐베이션 및 세척되어, 마침내 광학 변화(예를 들어, 효소 반응의 제품에 의한 색 개발)가 우물의 최종 액체에서 발생되도록 한다. 광학 변경을 통해 소위 정량적 분석물의 양을 측정할 수 있습니다. “읽기". 정량 적 판독을 위해 분광계, 불소계 또는 광등계가 전송된 빛의 강도를 감지하고 측정하는 데 사용됩니다. 검출의 감도는 분석 반응 도중 신호의 증폭에 의해 영향을 받습니다. 효소 반응은 잘 조사되고 신뢰할 수 있는 증폭 과정이기 때문에, 효소는 신호를 만드는 데 사용됩니다. 효소는 정확한 정량화를 허용하기 위하여 고정된 비율로 검출 시약에 연결됩니다, 또한 이름 "효소 연결" 면역 sorbent 분석.
ELISA 분석법은 마이크로티터 플레이트/96웰 플레이트에서 수행되기 때문에 판 기반 분석 기술로 알려져 있으며, 항체, 펩티드, 단백질 및 호르몬을 검출 및 정량화하기 위한 임상 내 진단, 연구, 약물 개발 등에 사용된다.
ELISA 기술은 의학, 생명 공학, 식물 병리학의 진단 도구로 자주 사용되며 여러 산업에서 중요한 품질 관리 측정이기도 합니다.

VialTweeter 설정 완료 : VialTweeter 초음파 처리기에서 초음파 처리 UP200St

초음파 샘플 준비 장치 유리 병 ELISA 분석 전에 세포 용해 및 단백질 추출에 사용됩니다.

ELISA 전에 초음파 샘플 준비

ELISA 분석이 수행되기 전에, 샘플은 세포 내 단백질, DNA, RNA 등의 세포 리시스 및 추출과 같은 준비 단계를 필요로한다. 초음파 세포 용해및 단백질 절연의 장점은 높은 효율, 신뢰성 및 재현성입니다. 이러한 모든 요소는 고품질 진단 및 연구 결과를 얻기 위해 중요합니다.

ELISA 이전의 초음파 리시스의 장점

균일한 샘플 처리
완전한 리시스
완전한 단백질 추출(예: 항체, DNA)
세포 유형에 대한 최적의 적응
모든 샘플 크기에 대해
재생할 수 있는
온도 제어
SD 카드의 자동 데이터 프로토콜

사전 ELISA 초음파 세포 용 용 프로토콜

세포 배양의 경우: 초음파 세포 용해 전에, 미세 원심 분리기에서 270 x g에서 5 분 동안 원심분리기 세포. 흡인에 의해 상체를 제거하고 RIPA 버퍼의 30 - 100 μL에서 셀을 다시 중단합니다. 그런 다음, 30 분 동안 얼음에 세포 펠릿을 배양.
이제 세포 샘플은 초음파 용해에 대한 준비가되어 있습니다.
프로브 형 초음파 처리기(예: 사용)를 사용하십시오. UP200Ht S26d2 프로브) 또는 초음파 다중 샘플 장치(예: 최대 10개의 바이알의 동시 초음파 처리를 위한 VialTweeter 또는 마이크로티터 플레이트/96웰 플레이트용 UIP400MPT)를 준비하는 데 필요한 샘플의 양에 따라.
단일 샘플의 프로브 형 초음파 처리를 위해 세포를 1.5 mL 마이크로 센심 분리튜브에 배치하십시오.
초음파 의 디지털 메뉴에서 초음파 지속 시간, 총 에너지 입력, 사이클 모드 및 / 또는 온도 제한을 미리 설정합니다. 이를 통해 매우 신뢰할 수 있는 초음파 처리 및 반복성을 보장합니다.
sonotrode를 설정하고 초음파 장치를 켭타. 초음파 프로브의 마이크로 팁을 샘플을 통해 균일하게 초음파 처리합니다.
대부분의 세포에 대 한, 초음파 용 해 10 초 초음파 의 2-4 주기 후 완료 됩니다.
초음파 처리 후 샘플에서 sonotrode를 제거합니다. 샘플은 5 분 동안 얼음에 배양해야합니다. 그런 다음 원심 분리기는 10,000 x g에서 20 분 동안 파편을 펠렛합니다. 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 슈퍼 네이티퍼를 전송합니다. -20°C에서 데이터 저장에 레이블을 지정합니다.
초음파 sonotrode알코올로 제대로 닦아내거나 알코올로 채워진 비커(예: 70% 에탄올)로 초음파 처리하여 세척할 수 있습니다. 티타늄으로 만든 모든 초음파 프로브는 자동 분리 할 수 있습니다.

조직 균질화의 경우:

얼음감기 PBS(0.01M, pH=7.4)로 조직을 헹구어 과도한 용혈 혈액을 철저히 제거합니다.
조직 (신장, 심장, 폐, 비장 등)을 무게와 PBS에서 균질화되는 작은 조각으로 메이크 레이트. 필요한 PBS의 부피는 조직의 무게와 관련이 있습니다. 엄지 손가락의 규칙으로, 조직의 1g은 약 9mL PBS를 필요로한다. PBS에 프로테아제 억제제를 추가하는 것이 좋습니다. (프로테아제와 인산염 억제제 칵테일을 함유한 RIPA 또는 저혈압 용해 완충제는 대안적으로 사용될 수 있다.)
조직 크기에 따라 짧은 소용돌이 치료(약 1-2분. 15초 펄스)는 조직을 사전 치료하는 데 도움이 될 수 있다.
초음파 처리기에 S26d2와 같은 마이크로 팁을 마운트합니다. 얼음 욕조에 티슈가 있는 샘플 튜브를 놓습니다.
초음파 처리기로 샘플을 초음파 처리하십시오(예: UP200St(80% 진폭)는 펄스 모드(15초, 일시 정지 15초)에서 1분 동안 보관하십시오. 샘플을 얼음 욕조에 보관하십시오.
균질화는 분석을 위한 단백질을 풍부하게 하기 위하여 특정 풀 (세포종, 핵, 미토콘드리아 또는 리소질)를 얻기 위하여 원심분리됩니다. 5000×g에서 5분 동안 샘플을 원심분리하여 상체가 회수됩니다.

SONOTrode MTP-24-8-96에는 마이크로티터 플레이트의 우물의 초음파 처리를위한 8 개의 초음파 프로브가 있습니다.

초음파 처리 중 신뢰할 수 있는 온도 제어

온도는 단백질의 열 분해를 방지하기 위하여 생물학 견본의 처리에 특히 중요한 프로세스-영향을 미치는 인자입니다. 모든 기계적 샘플 준비 기술로 초음파 처리는 열을 생성합니다. 그러나, Hielscher 초음파 장치를 사용할 때 시료의 온도를 잘 조절할 수 있다. 우리는 당신에게 모니터링하고 프로브 형 초음파 또는 사전 악성 로터사전 악성 로 그들을 준비하는 동안 샘플의 온도를 제어 할 수있는 다양한 옵션을 제공합니다.

샘플 온도 모니터링: 모든 Hielscher 디지털 초음파 프로세서에는 지능형 소프트웨어와 플러그형 온도 센서가 장착되어 있습니다. 온도 센서를 초음파 장치에 연결하십시오(예: UP200Ht, UP200St, 유리 병, UIP400MTP) 샘플 튜브 중 하나에 온도 센서의 끝을 삽입합니다. 디지털 컬러 터치 디스플레이를 통해 초음파 프로세서의 메뉴에서 시료 초음파 처리를위한 특정 온도 범위를 설정할 수 있습니다. 초음파 는 최대 온도에 도달하면 자동으로 멈추고 샘플 온도가 세트 온도의 낮은 값까지 내려갈 때까지 ∆. 그런 다음 초음파 처리가 자동으로 다시 시작됩니다. 이 스마트 기능은 열로 인한 저하를 방지합니다.
초음파 다중 시료 유닛 VialTweeter에 관해서는, 샘플 튜브를 보유하는 티타늄 블록은 미리 냉각 될 수있다. 비알트위터 블록을 냉장고 나 냉동실에 넣어 티타늄 블록을 미리 냉각하여 샘플의 온도 상승을 연기합니다. 가능하면 샘플 자체도 미리 냉각될 수 있습니다.
얼음 목욕이나 드라이 아이스를 사용하여 초음파 처리 중에 식힙니다. 초음파 처리 중에 샘플 튜브를 얼음 욕조에 넣습니다. VialTweeter의 경우 드라이 아이스로 채워진 얕은 트레이를 사용하여 VialTweeter를 드라이 아이스에 배치하여 열이 빠르게 사라질 수 있도록 합니다.

전 세계 고객은 Hielscher 프로브 초음파 장치뿐만 아니라 다중 샘플 초음파 장치 VialTweeter 및 UIP400MTP를 사용하여 생물학적, 생화학, 의료 및 임상 실험실에서 매일 샘플 준비 작업을 수행합니다. Hielscher 프로세서의 지능형 소프트웨어 및 온도 제어, 온도는 안정적으로 제어되고 열에 의한 시료 분해를 피할 수 있습니다. Hielscher 초음파 솔루션의 초음파 샘플 준비는 매우 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 제공합니다!

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초음파 고전기 균질화는 실험실, 벤치 탑, 파일럿 및 산업 처리에 사용됩니다.

Hielscher 초음파는 실험실, 파일럿 및 산업 규모의 응용 프로그램, 분산, 에멀화 및 추출을 위한 고성능 초음파 균질화를 제조합니다.

문학 / 참고 문헌

Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.

알만한 가치가있는 사실

ELISA의 종류

ELISA에는 여러 가지 유형이 있으며, 이는 기능 원리로 구별됩니다. 그들은 직접 ELISA로 알려져 있다, 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA, 경쟁 ELISA, 그리고 역 ELISA. 아래에서 다양한 ELISA 유형과 주요 특성 및 차이점에 대한 개요를 제공합니다.
ELISA는 질적 또는 정량적 형식으로 실행될 수 있습니다. 정성적 결과는 간단한 양수 또는 음수 결과를 제공하며, 정량적 ELISA에서 시료의 광학 밀도(OD)는 표준 곡선과 비교되며, 이는 일반적으로 표적 분자의 공지된 농도 용액의 직렬 희석이다.

다이렉트 엘리사

직접 ELISA는 효소 라벨1차 항체만 사용되고 이차 항체가 필요하지 않은 엘리사의 가장 간단한 분석 형태이다. 효소 표지된 1차 항체는 표적, 즉 항원에게 직접 결합한다. 완충된 항원 용액은 전하 상호 작용을 통해 플라스틱 표면에 부착되는 마이크로티터 플레이트(보통 96웰 플레이트, ELISA-플레이트)의 각 웰에 추가됩니다. 1차 항체에 연결된 효소가 기판과 반응할 때, 분광계, 형광계 또는 광등계를 통해 측정할 수 있는 가시적인 신호를 생성한다.

간접 ELISA

간접 ELISA 검사를 위해서는 1차 항체와 이차 항체가 모두 요구된다. 그러나, 직접적인 ELISA와는 반대로, 1차 항체가 아니라, 이차 항체는 효소로 표지된다. 항원은 웰 플레이트에 고정되어 1차 항체에 의해 결합된다. 이어서, 효소 표지이 부착된 이차 항체는 1차 항체에 결합한다. 마지막으로, 이차 항체에 연결된 효소는 기판과 반응하여 검출될 수 있는 가시적인 신호를 생성한다.

샌드위치 엘리사

직접 및 간접 ELISA 테스트에서 항원은 고정되어 웰 플레이트의 표면으로 코팅되며, 샌드위치 ELISA에서 항체는 ELISA 플레이트의 플라스틱 표면에 고정된다. 샌드위치 ELISA에서 고정 된 항체는 캡처 항체로 알려져 있습니다. 또한 포획 항체에, 샌드위치 ELISA에서도 소위 검출 항체가 요구된다. 검출 항체는 표지되지 않은 1 차적인 검출 항체 및 효소 표지된 이차 검출 항체를 포함합니다.
단계적으로, 관심의 항원은 플레이트에 고정된 포획 항체에 결합한다. 이어서, 1차 검출 항체는 항원에게 결합한다. 그 후, 이차 검출 항체는 1차 검출 항체에 결합한다. 최종 반응 단계에서, 효소는 기판과 반응하여 광학적으로 검출될 수 있는 가시적인 신호를 생성한다.

경쟁적인 엘리사

경쟁 ELISA, 또한 억제 ELISA로 알려진, 그것은 억제제 항원의 사용을 포함 하기 때문에 가장 복잡 한 ELISA 유형. ELISA의 세 가지 형식은 각각 경쟁적인 ELISA 형식에 맞게 조정할 수 있습니다. 경쟁적인 ELISA에서, 억제제 항원 및 관심의 항원은 1 차적인 항체에 결합을 위해 경쟁합니다.
경쟁력 있는 ELISA를 위해, 표지되지 않은 항체는 항원, 즉 견본의 존재에서 배양됩니다. 이러한 결합된 항체/항원 복합체는 항원 코팅에 잘 첨가된다.
플레이트가 세척되어 결합되지 않은 항체가 제거됩니다. 경쟁력 있는 ELISA는 항원이 샘플에 더 많고, 더 많은 항원 항체 복합체가 형성된다는 사실 때문에 그 이름을 가지고 있다. 즉, 항원에서 항원에 결합할 수 있는 언바운드 항체가 적고 항원은 사용 가능한 항체를 위해 경쟁해야 한다. 1차 항체와 일치하는 이차 항체가 첨가된다. 이 두 번째 항체는 효소에 연결됩니다. 기판이 첨가되면 나머지 효소는 염색체 또는 형광 신호를 생성합니다.
이 시점에서, 반응은 신호의 최종 포화를 피하기 위해 중지됩니다.
일부 경쟁 ELISA 키트는 효소 연결 항체 대신 효소 연결 항원포함. 표지된 항원은 시료 항원(라벨이 부착되지 않은)을 가진 1차 항체 결합 부위를 경쟁한다. 시료에 있는 더 적은 항원, 더 표지된 항원은 우물에서 유지되고 신호가 강해진다.

리버스 엘리사

역 ELISA는 잘 플레이트를 사용하지 않지만 항원은 시험 유체에서 일시 중단됩니다. 역ELISA 검사는 항원을 통한 바운드 항체의 양을 측정합니다. 그것은 검출하고 서쪽 나일 바이러스 봉투 단백질을 조사하고 어떻게 바이러스 특정 항체를 찾아볼 수 있는지 를 조사하기 위하여 특별히 개발되었습니다.

ELISA에 사용되는 효소 마커

아래 목록은 ELISA 분석서에 사용되는 가장 일반적인 효소 마커를 제공하므로 분석 결과를 완료 시 측정할 수 있습니다.

OPD(o-페닐렌디아민 디하이드로클로리데)는 공주 단백질로 자주 사용되는 HRP(고추냉이 페록시다제)를 검출하기 위해 호박색으로 변합니다.
TMB (3,3′,5,5′-테트라메틸벤지딘)은 HRP를 감지할 때 파란색으로 변하고 황산 또는 인산을 첨가한 후 노란색으로 변합니다.
ABTS (2,2′- 아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-설포닉산]-디아모늄 소금)은 HRP를 검출할 때 녹색으로 변합니다.
PNPP (p-니트로페닐 인산염, 디나트륨 소금)는 알칼리성 인산염을 검출할 때 노란색으로 변합니다.