Ultrasonic Sample Prep for ELISA Assays
ELISA와 같은 분석은 체외 진단, 질병 관련 단백질 검출 및 품질 관리(예: 식품 알레르겐 모니터링)에 널리 사용됩니다. 초음파 시료 전처리는 세포를 용해하고 세포 내 단백질, DNA, RNA 및 세포 기관을 분리하는 빠르고 신뢰할 수 있으며 재현성 있는 기술입니다. Hielscher 초음파는 단일 샘플, 여러 바이알, 마이크로 타이터 플레이트 및 96 웰 플레이트의 편리한 준비를위한 다양한 초음파 솔루션을 제공합니다.
ELISA – 효소 결합 면역 흡착 분석
ELISA는 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay의 약자로 리간드 결합 분석 범주에서 널리 사용되는 생화학 분석 기법입니다. ELISA에서는 액체 샘플이 특별한 결합 특성을 가진 고정상에 추가됩니다. 일반적으로 고정 고체상은 웰 플레이트 또는 ELISA 플레이트에 코팅으로 적용됩니다. 그런 다음 다양한 액체 시약을 순차적으로 첨가, 배양 및 세척하여 최종적으로 웰의 최종 액체에서 광학 변화(예: 효소 반응 생성물에 의한 색상 발달)가 발생합니다. 광학적 변화는 소위 정량적 측정으로 분석물의 양을 측정할 수 있습니다. “읽기". 정량적 판독을 위해 분광 광도계, 형광 측정기 또는 광도계를 사용하여 투과 된 빛의 강도를 감지하고 측정합니다. 검출 민감도는 분석 반응 중 신호의 증폭에 의해 영향을 받습니다. 효소 반응은 잘 조사되고 신뢰할 수 있는 증폭 과정이기 때문에 효소를 사용하여 신호를 생성합니다. 효소는 정확한 정량화가 가능하도록 고정된 비율로 검출 시약에 연결되어 있으며, 이는 "효소 결합" 면역 흡착 분석법이라는 이름도 설명합니다.
ELISA 분석은 마이크로타이터 플레이트/96웰 플레이트에서 수행되기 때문에 플레이트 기반 분석 기법으로 알려져 있으며 항체, 펩타이드, 단백질 및 호르몬을 검출하고 정량화하기 위한 임상 체외 진단, 연구, 약물 개발 등에 사용됩니다.
ELISA 기법은 의학, 생명 공학, 식물 병리학에서 진단 도구로 자주 사용되며 여러 산업 분야에서 중요한 품질 관리 측정이기도 합니다.
초음파 시료 전처리 장치 VialTweeter ELISA 분석 전에 세포 용해 및 단백질 추출에 사용됩니다.
ELISA 전 초음파 시료 전처리
ELISA 분석을 수행하기 전에 샘플은 세포 용해 및 세포 내 단백질, DNA, RNA 등의 추출과 같은 준비 단계가 필요합니다. 초음파 세포 용해 및 단백질 분리의 장점은 높은 효율성, 신뢰성 및 재현성입니다. 이러한 모든 요소는 고품질 진단 및 연구 결과를 얻기 위해 중요합니다
- 균질한 시료 처리
- 완전한 용해
- 완전한 단백질 추출(예: 항체, DNA)
- 세포 유형에 대한 최적의 적응
- 모든 표본 크기에 대해
- 재현할
- 온도 제어
- SD 카드의 자동 데이터 프로토콜링
Pre-ELISA 초음파 세포 용해를 위한 프로토콜
- 세포 배양의 경우: 초음파 세포 용해 전에 마이크로 원심 분리기에서 270 x g에서 5 분 동안 세포를 원심 분리합니다. 흡인으로 상층액을 제거하고 30 – 100 μL의 RIPA 완충액에서 세포를 재현탁시킵니다. 그런 다음 세포 펠릿을 얼음에 30분 동안 배양합니다.
- 이제 세포 샘플은 초음파 용해를 위한 준비가 되었습니다.
프로브 형 초음파를 사용하십시오 (예 : UP200HT S26d2 프로브 사용) 또는 초음파 다중 샘플 장치(예: 최대 10개의 바이알을 동시에 초음파 처리하기 위한 VialTweeter 또는 마이크로타이터 플레이트/96웰 플레이트의 UIP400MPT) 준비해야 하는 샘플의 양에 따라.
단일 샘플의 프로브 형 초음파 처리를 위해 세포를 1.5mL 마이크로 원심 분리 튜브에 넣으십시오. - 초음파 지속 시간, 총 에너지 입력, 사이클 모드 및 / 또는 초음파기의 디지털 메뉴에서 온도 제한을 미리 설정하십시오. 이것은 매우 신뢰할 수있는 초음파 처리 및 반복성을 보장합니다.
- sonotrode를 삽입하고 초음파 장치를 켭니다. 초음파 프로브의 마이크로 팁을 샘플을 통해 부드럽게 움직여 샘플을 균일하게 초음파 처리합니다.
대부분의 세포에서 초음파 용해는 10 초 초음파 처리의 2-4 사이클 후에 완료됩니다. - 초음파 처리 후, 샘플에서 sonotrode를 제거하십시오. 샘플은 얼음 위에서 5분 동안 배양해야 합니다. 그런 다음 10,000 x g에서 20분 동안 원심분리하여 파편을 펠릿으로 제거합니다. 상층액을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 분석물을 라벨링하고 -20°C에서 보관합니다.
- 초음파 sonotrode는 알코올로 제대로 닦거나 알코올 (예 : 70 % 에탄올)로 채워진 비커에서 초음파 처리하여 세척 할 수 있습니다. 티타늄으로 만든 모든 초음파 프로브는 오토클레이브가 가능합니다.
E.coli 세포에서 단백질 추출을 통해 초음파 프로브 UP200St
- 얼음처럼 차가운 PBS(0.01M, pH=7.4)로 조직을 헹구어 과도한 용혈혈을 철저히 제거합니다.
- 조직(신장, 심장, 폐, 비장 등)의 무게를 측정하고 PBS에서 균질화된 작은 조각으로 침식합니다. 필요한 PBS의 부피는 조직의 무게와 관련이 있습니다. 일반적으로 조직 1g에는 약 9mL PBS가 필요합니다. PBS에 일부 프로테아제 억제제를 추가하는 것이 좋습니다. (프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일을 함유하는 RIPA 또는 저긴장성 용해 완충액을 대안으로 사용할 수 있습니다.)
- 조직 크기에 따라 짧은 와류 처리(15초 펄스에서 약 1-2분)가 조직을 전처리하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 마이크로 팁 (예 : S26d2)을 초음파기에 장착하십시오. 티슈와 함께 샘플 튜브를 얼음 욕조에 넣습니다.
- 초음파기 (예 : UP200St (80 % 진폭)로 펄스 모드 (15 초 켜짐, 15 초 일시 중지)에서 1 분 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 샘플을 얼음 욕조에 보관하십시오.
- 그런 다음 균질액을 원심분리하여 특정 풀(세포솔, 핵, 미토콘드리아 또는 리소좀)을 얻어 분석을 위해 단백질을 농축합니다. 5000×g에서 5분 동안 샘플을 원심분리하면 상층액이 회수됩니다.
The sonotrode MTP-24-8-96 has eight ultrasonic probes for the sonication of the wells of microtiter plates.
초음파 처리 중 신뢰할 수 있는 온도 제어
온도는 공정에 영향을 미치는 중요한 요소로, 예를 들어 단백질의 열 분해를 방지하기 위해 생물학적 시료 처리에 특히 중요합니다. 모든 기계적 샘플 준비 기술과 마찬가지로 초음파 처리는 열을 생성합니다. 그러나 Hielscher 초음파 장치를 사용할 때 샘플의 온도를 잘 제어 할 수 있습니다. 프로브형 초음파발생기 또는 VialTwitter를 사전 분석적으로 사용하여 샘플의 온도를 모니터링하고 제어할 수 있는 다양한 옵션을 제공합니다.
- 샘플 온도 모니터링 : 모든 Hielscher 디지털 초음파 프로세서에는 지능형 소프트웨어와 플러그 형 온도 센서가 장착되어 있습니다. 온도 센서를 초음파 장치에 연결합니다(예: UP200HT, UP200세인트, 바이알트위터, UIP400MTP) 온도 센서의 끝을 샘플 튜브 중 하나에 삽입합니다. 디지털 컬러 터치 디스플레이를 통해 초음파 프로세서의 메뉴에서 샘플 초음파 처리를위한 특정 온도 범위를 설정할 수 있습니다. 초음파기는 최대 온도에 도달하면 자동으로 중지되고 샘플 온도가 설정 온도 ∆의 낮은 값으로 내려갈 때까지 일시 중지됩니다. 그런 다음 초음파 처리가 자동으로 다시 시작됩니다. 이 스마트 기능은 열로 인한 성능 저하를 방지합니다.
- 초음파 다중 시료 장치인 VialTweeter와 관련하여 시료 튜브를 고정하는 티타늄 블록을 사전 냉각할 수 있습니다. VialTweeter 블록(변환기가 없는 sonotrode만 해당)을 냉장고나 냉동고에 넣어 티타늄 블록을 사전 냉각하면 샘플의 온도 상승을 연기하는 데 도움이 됩니다. 가능한 경우 샘플 자체도 사전 냉각할 수 있습니다.
- 초음파 처리 중에 식히기 위해 얼음 목욕 또는 드라이 아이스를 사용하십시오. 초음파 처리 중에 샘플 튜브를 얼음 욕조에 넣으십시오. VialTweeter의 경우 드라이아이스를 채운 얕은 트레이를 사용하고 열이 빠르게 발산될 수 있도록 VialTweeter를 드라이아이스 위에 놓습니다.
전 세계 고객은 생물학, 생화학, 의료 및 임상 실험실에서 일일 샘플 준비 작업을 위해 Hielscher 프로브 초음파발생기와 다중 샘플 초음파 처리 장치 VialTweeter 및 UIP400MTP를 사용합니다. Hielscher 프로세서의 지능형 소프트웨어 및 온도 제어, 온도가 안정적으로 제어되고 열로 인한 샘플 저하가 방지됩니다. Hielscher 초음파 솔루션을 사용한 초음파 샘플 준비는 매우 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 제공합니다!
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Hielscher 초음파는 실험실, 파일럿 및 산업 규모에서 혼합 응용 분야, 분산, 유화 및 추출을위한 고성능 초음파 균질화기를 제조합니다.
문헌 / 참고문헌
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
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알아 둘 만한 가치가 있는 사실
ELISA의 종류
ELISA에는 여러 유형이 있으며 기능 원리로 구별됩니다. 이를 직접 ELISA, 간접 ELISA, 샌드위치 ELISA, 경쟁 ELISA 및 역 ELISA라고 합니다. 아래에서는 다양한 ELISA 유형과 주요 특성 및 차이점에 대한 개요를 제공합니다.
ELISA는 정성적 또는 정량적 형식으로 실행될 수 있습니다. 정성적 결과는 단순한 양성 또는 음성 결과를 제공하는 반면, 정량적 ELISA에서는 시료의 광학 밀도(OD)를 표준 곡선과 비교하며, 이는 일반적으로 표적 분자의 알려진 농도 용액을 연속적으로 희석한 것입니다.
다이렉트 ELISA
direct ELISA는 Elisa의 가장 간단한 분석 형태로, 효소 표지된 1차 항체만 사용하고 2차 항체는 필요하지 않습니다. 효소 표지된 1차 항체는 표적, 즉 항원에 직접 결합합니다. 완충된 항원 용액은 마이크로타이터 플레이트(일반적으로 96웰 플레이트, ELISA 플레이트)의 각 웰에 추가되며, 여기서 전하 상호 작용을 통해 플라스틱 표면에 부착됩니다. 1차 항체에 연결된 효소가 기질과 반응하면 분광 광도계, 형광 측정기 또는 광도계를 통해 측정할 수 있는 가시 신호를 생성합니다.
간접 ELISA
간접 ELISA 검사의 경우 1차 항체와 2차 항체가 모두 필요합니다. 그러나 직접 ELISA와 달리 1차 항체가 아니라 2차 항체에 효소를 부착하여 라벨링합니다. 항원은 웰 플레이트에 고정되고 1차 항체에 의해 결합됩니다. 그 후, 효소 표지된 2차 항체는 1차 항체에 결합합니다. 마지막으로, 2차 항체에 연결된 효소는 기질과 반응하여 검출할 수 있는 가시 신호를 생성합니다.
샌드위치 ELISA
직접 및 간접 ELISA 검사에서 항원은 고정되어 웰 플레이트 표면에 코팅되는 반면, 샌드위치 ELISA에서는 항체가 ELISA 플레이트의 플라스틱 표면에 고정됩니다. 샌드위치 ELISA의 고정화된 항체는 포획 항체로 알려져 있습니다. 또한 포획 항체 외에도 샌드위치 ELISA에서는 소위 검출 항체가 필요합니다. 검출 항체에는 표지되지 않은 1차 검출 항체와 효소 표지된 2차 검출 항체가 포함됩니다.
단계적으로, 관심 항원은 플레이트에 고정된 포획 항체에 결합합니다. 그런 다음 1차 검출 항체가 항원에 결합합니다. 그 후, 2차 검출 항체는 1차 검출 항체에 결합합니다. 최종 반응 단계에서 효소는 기질과 반응하여 광학적으로 감지할 수 있는 가시 신호를 생성합니다.
경쟁력 있는 ELISA
억제 ELISA라고도 하는 경쟁적 ELISA는 억제제 항원을 사용하기 때문에 가장 복잡한 ELISA 유형입니다. 직접, 간접 및 샌드위치 ELISA의 세 가지 형식 각각은 경쟁력 있는 ELISA 형식에 맞게 조정할 수 있습니다. 경쟁적 ELISA에서 억제제 항원과 관심 항원은 1차 항체에 결합하기 위해 경쟁합니다.
경쟁력 있는 ELISA의 경우, 라벨링되지 않은 항체는 항원, 즉 샘플이 있는 상태에서 배양됩니다. 그런 다음 이러한 결합된 항체/항원 복합체를 항원 코팅된 웰에 추가합니다.
플레이트를 세척하여 결합되지 않은 항체가 제거됩니다. 경쟁력 있는 ELISA는 샘플에 항원이 많을수록 더 많은 항원-항체 복합체가 형성되기 때문에 붙여진 이름입니다. 이는 웰의 항원에 결합할 수 있는 결합되지 않은 항체가 더 적고 항원이 사용 가능한 항체를 놓고 경쟁해야 함을 의미합니다. 1차 항체와 일치하는 2차 항체가 추가됩니다. 이 두 번째 항체는 효소와 연결되어 있습니다. 기질이 첨가되면 나머지 효소는 발색 또는 형광 신호를 생성합니다.
이 시점에서 신호의 최종 포화를 피하기 위해 반응이 중지됩니다.
일부 경쟁력 있는 ELISA 키트에는 효소 결합 항체 대신 효소 결합 항원이 포함되어 있습니다. 라벨링된 항원은 샘플 항원(라벨링되지 않음)과 1차 항체 결합 부위를 놓고 경쟁합니다. 샘플의 항원이 적을수록 웰에 더 많이 라벨링된 항원이 유지되고 신호가 더 강해집니다.
역 ELISA
Reverse ELISA는 웰 플레이트를 사용하지 않고 항원을 테스트 유체에 부유 상태로 둡니다. 역 ELISA 검사는 항원을 통해 결합된 항체의 양을 측정합니다. 웨스트 나일 바이러스 외피 단백질을 검출 및 조사하고 바이러스 특이적 항체를 찾을 수 있는 방법을 조사하기 위해 특별히 개발되었습니다.
ELISA에 사용되는 효소 마커
아래 목록은 ELISA 분석에 사용되는 가장 일반적인 효소 마커를 제공하며, 이를 통해 분석 완료 시 분석 결과를 측정할 수 있습니다.
- OPD(o-phenylenediamine dihydrochloride)는 호박색으로 변하여 종종 접합 단백질로 사용되는 HRP(Horseradish Peroxidase)를 검출합니다.
- 티엠비(3,3′,5,5′-테트라메틸벤지딘)은 HRP를 검출할 때 파란색으로 변하고 황산 또는 인산을 첨가하면 노란색으로 변합니다.
- ABTS(2,2′-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt)는 HRP를 검출 할 때 녹색으로 바뀝니다.
- PNPP(p-Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt)는 알칼리성 인산가수분해효소를 검출할 때 노란색으로 변합니다.