ELISA 분석을 위한 초음파 시료 전처리

ELISA와 같은 분석법은 체외 진단, 질병 관련 단백질 검출 및 품질 관리(예: 식품 알레르겐 모니터링)에 널리 사용됩니다. 초음파 시료 전처리는 세포를 용해하고 세포 내 단백질, DNA, RNA 및 세포 소기관을 분리하는 신속하고 신뢰할 수 있으며 재현성이 높은 기법입니다. Hielscher Ultrasonics는 단일 시료, 여러 바이알뿐만 아니라 마이크로타이터 플레이트와 96웰 플레이트의 시료를 편리하게 전처리할 수 있는 다양한 초음파 솔루션을 제공합니다.

ELISA – 효소결합 면역흡착 분석법

ELISA는 효소결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay)의 약자로, 리간드 결합 분석법 범주에 속하며 널리 사용되는 생화학 분석 기법입니다. ELISA에서는 특수한 결합 특성을 지닌 고정된 고체상에 액체 시료를 첨가합니다. 일반적으로 이 고정된 고체상은 웰 플레이트 또는 ELISA 플레이트에 코팅됩니다. 그런 다음 다양한 액체 시약을 순차적으로 첨가하고 반응시킨 후 세척하여, 최종적으로 웰에 남은 액체에서 광학적 변화(예: 효소 반응 생성물에 의한 발색)가 일어나도록 합니다. 이러한 광학적 변화를 통해 이른바 정량적 “판독”으로 분석 대상 물질의 양을 측정할 수 있습니다. 정량적 판독에는 분광광도계, 형광계 또는 발광계를 사용하여 투과광의 강도를 검출하고 측정합니다. 검출 감도는 분석 반응 중 신호 증폭의 영향을 받습니다. 효소 반응은 충분히 연구되었으며 신뢰할 수 있는 증폭 과정이므로, 신호를 생성하는 데 효소가 사용됩니다. 정확한 정량이 가능하도록 효소를 검출 시약에 일정한 비율로 결합시키며, 이것이 면역흡착 분석법에 “효소결합”이라는 이름이 붙은 이유이기도 합니다.
ELISA 분석은 마이크로타이터 플레이트 / 96웰 플레이트에서 수행되므로 플레이트 기반 분석 기법으로 알려져 있으며, 임상 체외 진단, 연구, 신약 개발 등에서 항체, 펩타이드, 단백질 및 호르몬을 검출하고 정량하는 데 사용됩니다.
ELISA 기법은 의학, 생명공학 및 식물병리학에서 진단 도구로 자주 사용되며, 여러 산업에서도 중요한 품질 관리 측정법으로 활용됩니다.

ELISA 전 초음파 시료 전처리

ELISA 분석을 수행하기 전에 시료는 세포 용해와 세포 내 단백질, DNA, RNA 등의 추출과 같은 전처리 단계를 거쳐야 합니다. 초음파 세포 용해 및 단백질 분리의 장점은 높은 효율성, 신뢰성 및 재현성입니다. 이러한 요소는 모두 고품질의 진단 및 연구 결과를 얻는 데 중요합니다

ELISA 전 초음파 세포 용해 프로토콜

• 세포 배양물의 경우: 초음파 세포 용해 전에 미량 원심분리기에서 세포를 270 x g로 5분간 원심분리합니다. 흡인하여 상층액을 제거하고 세포를 30 – 100 μL의 RIPA 완충액에 재현탁합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 얼음 위에서 30분간 유지합니다.
• 이제 세포 시료의 초음파 세포 용해를 수행할 준비가 되었습니다.
  전처리해야 하는 시료 수에 따라 프로브형 초음파 처리기(예: UP200Ht에 S26d2 프로브를 장착한 구성) 또는 초음파 다중 시료 처리 장치(예: 최대 10개 바이알을 동시에 초음파 처리하는 VialTweeter 또는 마이크로타이터 플레이트 / 96웰 플레이트용 UIP400MPT)를 사용하십시오.
  단일 시료를 프로브형 장치로 초음파 처리할 경우 세포를 1.5 mL 미량 원심분리 튜브에 넣으십시오.
• 초음파 처리기의 디지털 메뉴에서 초음파 처리 시간, 총 에너지 투입량, 사이클 모드 및/또는 온도 한계를 미리 설정하십시오. 이를 통해 신뢰성이 매우 높은 초음파 처리와 반복성을 확보할 수 있습니다.
• 소노트로드를 삽입하고 초음파 장치를 켜십시오. 시료가 균일하게 초음파 처리되도록 초음파 프로브의 마이크로팁을 시료 내에서 부드럽게 움직이십시오.
  대부분의 세포는 10초간의 초음파 처리를 2–4회 반복하면 초음파 세포 용해가 완료됩니다.
• 초음파 처리 후 소노트로드를 시료에서 꺼내십시오. 시료를 얼음 위에서 5분간 배양해야 합니다. 그런 다음 10,000 x g에서 20분간 원심분리하여 잔해를 침전시키십시오. 상층액을 새 미세원심분리 튜브로 옮기십시오. 분석 대상 물질에 라벨을 붙이고 -20°C에서 보관하십시오.
• 초음파 소노트로드는 알코올로 꼼꼼히 닦거나 알코올(예: 70% 에탄올)이 담긴 비커에서 초음파 처리하여 세척할 수 있습니다. 티타늄으로 제작된 모든 초음파 프로브는 고압증기멸균이 가능합니다.

• 조직을 얼음처럼 차가운 PBS(0.01M, pH=7.4)로 헹구어 여분의 용혈된 혈액을 완전히 제거하십시오.
• 조직(신장, 심장, 폐, 비장 등)의 무게를 측정하고 잘게 으깬 다음 PBS에서 균질화하십시오. 필요한 PBS의 부피는 조직의 무게에 따라 달라집니다. 일반적으로 조직 1g에는 약 9mL의 PBS가 필요합니다. PBS에 단백질분해효소 억제제를 약간 첨가하는 것이 권장됩니다. (대신 단백질분해효소 및 인산가수분해효소 억제제 혼합물이 포함된 RIPA 또는 저장성 세포 용해 완충액을 사용할 수 있습니다.)
• 조직의 크기에 따라 짧은 볼텍스 처리(15초씩 펄스로 약 1–2분)가 조직 전처리에 도움이 될 수 있습니다.
• 초음파 처리기에 마이크로팁(예: S26d2)을 장착하십시오. 조직이 담긴 시료 튜브를 얼음 수조에 넣으십시오.
• 초음파 처리기(예: UP200St, 진폭 80%)로 시료를 펄스 모드(15초 작동, 15초 정지)에서 1분간 초음파 처리하십시오. 시료를 얼음 수조에 계속 두십시오.
• 그런 다음 균질액을 원심분리하여 특정 분획(세포질, 핵, 미토콘드리아 또는 리소좀 분획)을 얻고 분석용 단백질을 농축합니다. 시료를 5000×g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 회수합니다.

초음파 처리 중 신뢰할 수 있는 온도 제어

온도는 공정에 영향을 미치는 핵심 요인으로, 단백질의 열 분해 방지 등 생물학적 시료 처리에서 특히 중요합니다. 모든 기계적 시료 전처리 기법과 마찬가지로 초음파 처리에서도 열이 발생합니다. 그러나 Hielscher Ultrasonics 장치를 사용하면 시료의 온도를 효과적으로 제어할 수 있습니다. 분석 전에 프로브형 초음파 처리기 또는 VialTweeter로 시료를 전처리하는 동안 시료의 온도를 모니터링하고 제어할 수 있는 다양한 방법을 소개합니다.

1. 시료 온도 모니터링: 모든 Hielscher 디지털 초음파 프로세서에는 지능형 소프트웨어와 연결식 온도 센서가 장착되어 있습니다. 온도 센서를 초음파 장치(예: UP200Ht, UP200St, VialTweeter, 다중 웰 플레이트 초음파 처리기 UIP400MTP)에 연결하고 온도 센서의 끝부분을 시료 튜브 중 하나에 삽입하십시오. 디지털 컬러 터치 디스플레이를 통해 초음파 프로세서의 메뉴에서 시료의 초음파 처리를 위한 특정 온도 범위를 설정할 수 있습니다. 최대 온도에 도달하면 초음파 처리기가 자동으로 정지하고, 시료 온도가 설정된 온도 ∆의 하한값까지 내려갈 때까지 일시 정지 상태를 유지합니다. 그런 다음 초음파 처리가 자동으로 다시 시작됩니다. 이 지능형 기능은 열로 인한 분해를 방지합니다.
2. 초음파 다중 시료 처리 장치 VialTweeter의 경우, 시료 튜브를 고정하는 티타늄 블록을 미리 냉각할 수 있습니다. VialTweeter 블록(트랜스듀서를 제외한 소노트로드만!)을 냉장고나 냉동고에 넣어 티타늄 블록을 미리 냉각하면 시료의 온도 상승을 늦추는 데 도움이 됩니다. 가능하면 시료 자체도 미리 냉각할 수 있습니다.
3. 초음파 처리 중에는 얼음 수조나 드라이아이스를 사용하여 냉각하십시오. 초음파 처리 중에는 시료 튜브를 얼음 수조에 넣으십시오. VialTweeter의 경우 드라이아이스를 채운 얕은 트레이를 사용하고, 열이 빠르게 방출될 수 있도록 VialTweeter를 드라이아이스 위에 놓으십시오.

전 세계 고객들은 생물학, 생화학, 의학 및 임상 실험실에서 일상적인 시료 전처리 작업에 Hielscher 프로브형 초음파 처리기와 다중 시료 초음파 처리 장치인 VialTweeter 및 UIP400MTP를 사용합니다. Hielscher 초음파 처리기의 지능형 소프트웨어와 온도 제어 기능을 통해 온도를 신뢰성 있게 제어하고 열로 인한 시료 분해를 방지합니다. Hielscher 초음파 솔루션을 이용한 초음파 시료 전처리는 신뢰성과 재현성이 매우 높은 결과를 제공합니다!
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