차세대 염기서열분석(Next Gen Sequencing)을 위한 초음파 DNA 단편화
차세대 염기서열분석(NGS)은 게놈 DNA 가닥의 염기서열을 분석하고 게놈 라이브러리를 생성하기 위해 게놈 DNA의 신뢰할 수 있는 전단 및 단편화가 필요합니다. DNA를 DNA 단편으로 제어된 단편화는 DNA 염기서열 분석 전에 필요한 필수 시료 전처리 단계입니다. 초음파는 특정 길이의 DNA 단편화를위한 효율적이고 신뢰할 수있는 기술로 입증되었습니다. 초음파 DNA 단편화 프로토콜은 재현 가능한 단편화 결과를 달성합니다. Hielscher 초음파는 작동 매개 변수를 통해 정확하게 제어 할 수있는 광범위한 게놈 DNA 단편 크기 분포를 생성 할 수 있습니다. Hielscher 초음파 DNA 전단 시스템은 단일 및 다중 바이알뿐만 아니라 마이크로 플레이트에도 사용할 수 있으므로 샘플 준비가 매우 효율적입니다.
UIP400MTP 플레이트 초음파 발생기 고처리량 시료 전처리를 위해 Multi-well, Microtiter 플레이트 및 96-well 플레이트에서 시료를 균일하게 초음파 처리합니다.
- 반복 가능/재현 가능한 결과
- 특정 단편 길이를 얻기 위해 정밀하게 조정 가능
- 신속한 처리
- 일관된 DNA 단편화 결과
- 모든 시료 부피를 위한 장치(예: 여러 개의 바이알 또는 마이크로플레이트)
- 높은 처리량
- 정확한 온도 제어
- 간단하고 사용자 친화적인 작동
차세대 염기서열분석: 라이브러리 준비를 위한 초음파 DNA 단편화
차세대 염기서열분석을 수행하기 위해서는 (1) 라이브러리 준비, (2) 염기서열분석, (3) 데이터 분석의 세 가지 기본 단계를 수행해야 합니다. 라이브러리 준비 중에 DNA를 단편화한 다음 단일 아데닌 염기를 추가하여 단편 말단을 수리(연마)하고 표적 단편을 이중 가닥 DNA로 변환합니다. 마지막으로, 소위 adapter는 ligation, PCR 또는 tagmentation에 의해 부착되어 최종 라이브러리 DNA 산물을 염기서열 분석을 위해 정량화할 수 있습니다.
초음파 처리를 사용한 DNA 단편화: 특히 긴 DNA 단편을 쉽게 읽을 수 없는 Illumina와 같은 짧은 판독 염기서열 분석 기술의 경우, DNA 스탠드는 초음파로 안정적으로 달성할 수 있는 특정 크기로 단편화되어야 합니다.
초음파는 DNA, RNA 및 염색질 단편화에 안정적으로 사용할 수 있습니다.
차세대 염기서열분석 – 도서관 준비
초음파 DNA 단편화는 일반적으로 차세대 염기서열분석(NGS) 플랫폼을 위한 DNA 염기서열분석 라이브러리 준비에 사용됩니다. 이 기술은 DNA 분자를 원하는 크기 범위의 더 작은 조각으로 분해하는 데 사용되며, 이는 라이브러리 준비의 후속 단계를 용이하게 합니다. 초음파 DNA 단편화는 일반적으로 NGS 워크플로우의 라이브러리 준비 단계에서 게놈 DNA를 다운스트림 처리 및 염기서열 분석에 적합한 더 작은 조각으로 단편화하는 데 필요합니다. 이는 사용 중인 특정 염기서열분석 플랫폼에 적합한 크기 범위의 DNA 단편을 생성하여 염기서열분석 실험의 성공을 보장하는 데 중요한 역할을 합니다.
대장균 EDL933의 게놈 DNA의 전기 영동 분석은 0 – 15 분 초음파를 받았습니다. L은 DNA Ladder를 나타냅니다. (Basselet 외. 2008)
차세대 염기서열분석 – 프로세스 단계:
- 초음파 DNA 단편화: 라이브러리를 구축하기 전에 게놈 DNA는 더 작고 관리하기 쉬운 조각으로 단편화됩니다. 초음파 단편화는 고주파 음파를 사용하여 DNA 분자를 원하는 크기 범위의 단편으로 전단하는 것을 포함합니다. 이 단계는 나중에 생성되는 시퀀싱 읽기가 사용 중인 시퀀싱 플랫폼에 적합한 길이가 되도록 하는 데 도움이 되기 때문에 매우 중요합니다. 단편의 크기 범위는 염기서열분석 실험의 특정 요구 사항에 따라 조정할 수 있습니다.
- PCR에 의한 클론 증폭: 초음파 단편화 후 DNA 단편은 말단 수리, 어댑터 접합 및 PCR 증폭을 거쳐 최종 DNA 시퀀싱 라이브러리를 생성합니다. 이러한 단계는 염기서열분석 플랫폼에 결합하는 데 필요한 어댑터 염기서열을 추가하고 PCR 증폭을 위한 프라이밍 부위를 제공하여 염기서열분석 공정을 위해 단편화된 DNA 분자를 준비합니다.
- 합성에 의한 DNA 염기서열분석: 염기서열분석 라이브러리가 준비되면 합성에 의한 DNA 염기서열분석(SBS) 공정이 시작됩니다. SBS 동안, DNA 염기서열은 상보적 가닥에 뉴클레오티드를 순차적으로 추가함으로써 결정됩니다. 이 단계에는 뉴클레오티드 혼입, 이미징 및 절단의 주기적 반응이 포함되어, 혼입된 뉴클레오티드에서 방출되는 형광 신호를 기반으로 DNA 염기서열을 결정할 수 있습니다.
- Massively Parallel Sequencing(대규모 병렬 시퀀싱): 마지막 단계에서는 공간적으로 분리되고 증폭된 DNA 템플릿이 대규모 병렬 방식으로 동시에 염기서열 분석됩니다. 이 고처리량 염기서열분석 접근법을 사용하면 한 번의 염기서열분석 실행으로 수백만 개에서 수십억 개의 염기서열분석 판독을 생성할 수 있어 DNA 염기서열을 효율적이고 신속하게 결정할 수 있습니다.
초음파 DNA 단편화는 어떻게 작동합니까?
음향 샘플 처리라고도 하는 초음파 처리는 DNA를 단편화하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 초음파 DNA 전단의 경우 샘플은 제어된 조건에서 초음파에 노출됩니다. 초음파 DNA 단편화의 작동 원리는 초음파에 의해 생성되는 진동과 캐비테이션을 기반으로 합니다. 초음파(음향) 캐비테이션으로 인한 전단력은 고분자량 DNA 분자를 파괴합니다. 강도 (진폭, 지속 시간), 맥동 모드 및 온도와 같은 초음파 처리를 설정하면 원하는 특정 길이의 DNA 단편으로 정확한 DNA 단편화가 가능합니다. DNA는 종종 초음파를 사용하여 100-600 bp로 감소되지만, 더 가벼운 초음파 조건이 적용될 때 최대 1300 bp의 더 긴 DNA 조각을 얻을 수 있습니다.
ChIP 중 초음파 DNA 전단 – 크로마틴 면역침전
CC-BY-SA.03의 Jkwchui에서 발췌
DNA 분해를 방지하기 위한 온도 제어
DNA의 이중 가닥 분자 형태는 고온에 매우 민감하므로 시료 전처리 단계에서 온도를 정확하게 제어하는 것이 신뢰할 수 있는 분석 결과를 위한 중요한 요소입니다.
Hielscher의 프로브 초음파를 사용하든 VialTweeter 또는 UIP400MTP – 지속적인 온도 모니터링 및 제어는 플러그형 온도 센서와 Smart Device Software를 통해 보장됩니다. 온도를 특정 범위 내로 유지하기 위해 온도 상한 및 하한을 설정할 수 있습니다. 결과적으로,이 온도 한계가 초과 되 자마자 초음파기가 일시 중지되고 온도가 설정된 ∆T만큼 낮아지면 자동으로 초음파 처리를 계속합니다.
Hielscher 초음파의 정교한 소프트웨어는 이상적인 샘플 처리 조건의 안정적인 유지 보수를 보장합니다.
UIP400MTP Multi-Well Plate Ultrasonicator를 사용한 대량 시료 DNA 단편화
생명 과학 분야의 샘플 수는 지난 10년 동안 크게 증가했습니다. 이는 비교 가능하고 유효한 결과를 얻기 위해 매우 많은 수의 시료(예: 마이크로플레이트당 384, 1536 또는 3456웰)를 시료 전처리 및 분석 중에 일관되게 동일한 조건에서 처리해야 함을 의미합니다. UIP400MTP 통해 Hielscher 초음파는 대량 시료 처리의 추세를 따르고 있습니다. UIP400MTP는 마이크로플레이트를 사용하여 시료를 준비하기 위한 초음파기입니다. 이 UIP400MTP는 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 또는 3456웰이 있는 플레이트를 처리할 수 있습니다. 마이크로플레이트 유형에 따라 각 웰은 일반적으로 수십 나노리리터에서 수 밀리리터 사이의 시료 부피를 보유할 수 있습니다. 생명 과학 연구에서 널리 사용되는 이 UIP400MTP은 ELISA(효소 결합 면역 흡착 분석) 또는 PCR과 같은 분석 전, 단백질 분석 전, CHiP 및 CHiP-seq 전 염색질 준비, 히스톤 변형 식별 및 기타 분석 처리(예: 겔 전기영동, 질량 분석법)에 매우 일반적으로 사용됩니다.
PCR 플레이트의 고처리량 처리에 대해 자세히 알아보십시오!
최대 10개의 바이알을 시료 추출할 수 있는 VialTweeter
VialTweeter는 최대 10 개의 바이알을 동시에 효과적이고 편안하게 초음파 처리 할 수있는 널리 사용되는 실험실 초음파 발생기 VialTweeter입니다. 바이알과 시험관(예: Eppendorf 바이알, 크라이오 바이알, 원심분리기 튜브)은 간접적으로 초음파 처리되기 때문에 교차 오염을 방지할 수 있습니다. 동일한 초음파 강도가 각 샘플에 전달되므로 모든 초음파 처리 결과는 균일하고 재현 가능합니다. VialTwitterer는 다른 디지털 장치(예: 스마트 메뉴, 프로그래밍 가능한 설정, 온도 제어, 원격 제어 등)와 같은 모든 스마트 기능을 제공하여 최고의 사용자 편안함을 보장합니다.
Microwell 플레이트를 위한 Multi-Finger 프로브
초음파 프로브 균질화 기 UP200Ht 및 UP200St에 사용할 수있는 4 개 또는 8 개의 손가락이있는 다중 손가락 프로브는 동일한 조건에서 동시에 여러 샘플을 초음파 처리 할 수있는 편안한 옵션입니다. 예를 들어, sonotrode MTP-24-8-96은 여덟 손가락 프로브로, 자동화 시스템에 통합하거나 다중 웰 플레이트 웰의 효율적인 수동 시료 준비에 이상적입니다. 다중 손가락 sonotrode는 표준 초음파 sonotrode를 사용하는 대부분 비커와 시험관이 처리되는 실험실의 자동화에 이상적입니다. 다중 핑거 및 표준 프로브는 몇 분 내에 신속하게 상호 교환하여 단일 프로브 초음파를 다중 프로브 초음파 교쇄기로 변환 할 수 있습니다.
DNA 단편화를위한 Hielscher 초음파 발생기
Hielscher 초음파는 DNA, RNA 및 염색질 단편화를위한 다양한 초음파 기반 플랫폼을 제공합니다. 이러한 다양한 플랫폼에는 초음파 프로브 (sonotrodes), 여러 튜브 또는 다중 웰 플레이트 (예 : 96 웰 플레이트, 마이크로 타이터 플레이트)의 동시 샘플 준비를위한 간접 초음파 처리 솔루션, 초음파 증폭기 및 초음파 컵혼이 포함됩니다. DNA 전단을 위한 모든 플랫폼은 주파수 조정된 고성능 초음파 프로세서로 구동되며, 이 프로세서는 정밀하게 제어할 수 있고 재현 가능한 결과를 제공합니다.
모든 시료 수와 크기에 맞는 초음파 프로세서
Hielscher의 다중 샘플 초음파 발생기 인 VialTweeter (최대 10 개의 시험관 용) 및 UIP400MTP (마이크로 플레이트 / 멀티 웰 플레이트 용)을 사용하면 원하는 DNA 조각 크기 분포 및 수율을 얻으면서 강렬하고 정밀하게 제어 가능한 초음파로 인해 샘플 처리 시간을 쉽게 줄일 수 있습니다. 초음파 DNA 단편화는 시료 전처리를 효율적이고 신뢰할 수 있으며 확장 가능하게 만듭니다. 프로토콜은 지속적으로 제어되는 초음파를 적용하여 하나에서 수많은 샘플로 선형 확장할 수 있습니다.
1-5 개의 손가락이있는 프로브 초음파기는 더 작은 샘플 수를 준비하는 데 이상적입니다. Hielscher의 실험실 초음파기는 다양한 크기로 제공되므로 귀하의 응용 프로그램 및 요구 사항에 이상적인 장치를 추천 할 수 있습니다.
정밀한 공정 제어
철저한 초음파 화는 DNA, RNA 및 염색질을 파괴 할 수 있기 때문에 정확하게 제어 가능한 초음파 처리 설정이 중요하지만 부적절한 초음파 전단은 너무 긴 DNA 및 염색질 단편을 초래합니다. Hielscher의 디지털 초음파기는 정확한 초음파 매개 변수로 쉽게 설정할 수 있습니다. 특정 초음파 처리는 동일한 절차를 빠르게 반복하기 위해 프로그래밍 된 설정으로 저장할 수도 있습니다.
모든 초음파 처리는 자동으로 프로토콜이 지정되고 내장 SD 카드에 CSV 파일로 저장됩니다. 이를 통해 수행 된 시험을 정확하게 문서화 할 수 있으며 초음파 처리 실행을 쉽게 수정할 수 있습니다.
브라우저 원격 제어를 통해 모든 디지털 초음파기는 모든 표준 브라우저를 통해 작동 및 모니터링 할 수 있습니다. LAN 연결을 통해 매우 간단한 플러그 앤 플레이 설정이 가능하므로 추가 소프트웨어를 설치할 필요가 없습니다.
초음파 시료 전처리에서 최고의 사용자 친화성
모든 Hielscher 초음파는 고성능 초음파를 제공하도록 설계되었으며 동시에 항상 사용자 친화적이고 작동하기 쉽습니다. 모든 설정은 컬러 터치 디스플레이 또는 브라우저 원격 제어를 통해 쉽게 액세스할 수 있는 명확한 메뉴에 잘 구성되어 있습니다. 프로그래밍 가능한 설정 및 자동 데이터 기록 기능이 있는 스마트 소프트웨어는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 위한 최적의 초음파 처리를 보장합니다. 깨끗하고 사용하기 쉬운 메뉴 인터페이스는 Hielscher 초음파를 사용자 친화적이고 효율적인 장치로 바꿉니다.
아래 표는 DNA 및 RNA 단편화, 세포 용해 및 단백질 추출과 같은 시료 준비 작업에 이상적인 실험실 초음파의 대략적인 처리 용량을 나타냅니다.
| 장치 | 전력 [W] | 형 | 부피 [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | 마이크로플레이트용 | 6 – 3456웰 | 바이알트위터 | 200 | 최대 10개의 바이알 및 클램프온 가능 | 0.5 – 1.5 |
| 업50H | 50 | 프로브 유형 | 0.01 – 250 |
| 업100H | 100 | 프로브 유형 | 0.01 – 500 |
| UP200HT | 200 | 프로브 유형 | 0.1 – 1000 |
| UP200세인트 | 200 | 프로브 유형 | 0.1 – 1000 |
| UP400ST | 400 | 프로브 유형 | 5.0 – 2000 |
| 컵혼 | 200 | CupHorn, 초음파 증폭기 | 10 – 200 |
| GD미니2 | 200 | 오염 없는 플로우 셀(flow cell) |
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초음파 다중 시료 전처리 장치 바이알트위터 최대 10 개의 바이알을 동시에 초음파 처리 할 수 있습니다. 클램프 온 장치 VialPress를 사용하면 최대 4 개의 추가 튜브를 전면으로 눌러 강렬한 초음파 처리를 할 수 있습니다.
sonotrode MTP-24-8-96에는 마이크로 타이 터 플레이트의 우물의 초음파 처리를위한 8 개의 초음파 프로브가 있습니다.
문헌 / 참고문헌
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알아 둘 만한 가치가 있는 사실
차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing)이란 무엇입니까?
차세대 염기서열분석(Next-generation Sequencing), 차세대 염기서열분석(Next Gen Sequencing, NGS), 고처리량 염기서열분석(high-throughput sequencing) 또는 2세대 염기서열분석(second-generation sequencing)은 수백만 개의 단편으로 구성된 매우 대량(대량)의 DNA를 한 번에 병렬로 동시에 염기서열분석하는 대규모 병렬 염기서열분석(massive parallel sequencing)의 접근 방식을 말합니다.
차세대 염기서열분석을 수행하기 위해서는 다음과 같은 3가지 기본 단계를 수행해야 합니다.
- 도서관 준비,
- 시퀀싱, 및
- 데이터 분석
가 필요합니다.
라이브러리 준비 중에 DNA 가닥은 특정 길이의 DNA 조각으로 단편화되어야 합니다. 초음파 처리는 DNA를 단편화하는 데 선호되는 기술 중 하나입니다.
DNA 염기서열 분석 과정에서 DNA의 뉴클레오티드 순서 – 핵산 서열로 알려져 있으며 이를 측정합니다. 핵산 서열은 4개의 뉴클레오티드 염기(아데닌, 시토신, 구아닌, 티민)로 구성됩니다 – 정보를 위한 코드입니다.
차세대 염기서열 분석은 DNA 및 RNA 염기서열 분석이 게놈 연구, 암 연구, 희귀 및 복합 질환 연구, 미생물 연구, 농업 유전체학 및 기타 여러 연구 분야에서 많이 사용되기 때문에 생명 과학 및 개인 맞춤형 의학 연구를 주도하고 있습니다.
차세대 염기서열분석 vs Sanger 염기서열분석
차세대 염기서열분석(NGS)을 사용하면 대량의 게놈 시료를 염기서열분석할 수 있지만, Sanger 염기서열분석(연쇄 종결 방법 또는 1세대 염기서열분석이라고도 함)은 소량의 시료 염기서열분석만 가능합니다. Sanger 염기서열분석은 한 번에 하나의 DNA 단편만 염기서열분석하며 하루 만에 완료할 수 있습니다. 정확성으로 인해 Sanger 염기서열분석은 차세대 염기서열분석으로 얻은 결과를 검증하는 데 사용되는 표준 기술로도 간주됩니다.
Sanger 염기서열분석은 약 800bp(비농축 DNA의 경우 일반적으로 500-600bp)의 판독 길이를 달성합니다. Sanger 염기서열분석의 더 긴 판독 길이는 다른 염기서열분석 방법에 비해 상당한 이점을 보여주며, 특히 게놈의 반복 영역 염기서열분석 측면에서 그렇습니다. 짧은 판독 염기서열 데이터의 문제는 특히 새로운 게놈(de novo) 염기서열 분석과 고도로 재배열된 게놈 세그먼트(일반적으로 암 게놈 또는 구조적 변이를 나타내는 염색체 영역에서 볼 수 있는 분절)의 염기서열 분석에서 문제가 됩니다. [cp. Morozova and Marra, 2008]
DNA (디엔자 – 디옥시리보핵산(Deoxyribonucleic Acid) – 그 형태와 기능
DNA의 각 형태는 고유한 특성과 응용 분야를 가지고 있어 종양학, 유전학, 법의학 및 진화 생물학을 포함한 광범위한 연구 분야에 기여하고 있습니다. Hielscher 초음파 발생기는 분석 목적으로 DNA와 RNA를 분리하고 단편화하는 매우 효율적이고 신뢰할 수있는 솔루션입니다. 아래 목록에서는 DNA의 특정 형태를 설명하고 생물학적 맥락과 기능에 따라 분류합니다.
- 게놈 DNA(gDNA)
게놈 DNA(gDNA): 코딩(유전자)과 비코딩 영역을 모두 포함하는 유기체의 완전한 DNA 세트입니다. - 세포외 DNA
순환 종양 DNA(ctDNA): 종양 세포에 의해 혈류로 방출되는 DNA 조각.
무세포 DNA(cfDNA): 다양한 조직에서 유래한 혈류를 자유롭게 순환하는 DNA 조각이 발견됩니다. - 염색체 외 원형 DNA(eccDNA): 진핵 세포의 염색체 외부에서 발견되는 원형 DNA 분자.
바이러스 DNA: 바이러스에서 유래한 DNA, 숙주 게놈에 통합되거나 에피솜 DNA로 통합됩니다. - 미토콘드리아 DNA
미토콘드리아 DNA(mtDNA): DNA는 미토콘드리아에 위치하고 있으며 모계로 유전되며 에너지 생산에 관여합니다. - 플라스미드 DNA
플라스미드 DNA: 염색체 DNA와 독립적으로 복제되는 작은 원형 DNA 분자로, 박테리아에서 흔히 발견되며 유전 공학에 사용됩니다. - 핵 DNA
핵 DNA(nDNA): 진핵 세포의 핵 내에 포함된 DNA로, 유기체의 유전 물질의 대부분을 구성합니다. - 단세포 DNA
단일 세포 DNA(scDNA): 단일 세포에서 추출한 DNA로, 개별 세포 수준에서 상세한 게놈 분석에 사용됩니다. - 재조합 DNA
재조합 DNA(rDNA): 여러 출처의 유전 물질을 결합하기 위해 유전자 재조합의 실험실 방법으로 형성된 DNA 분자. - 전문화된 양식
환경 DNA(eDNA): 환경 시료(토양, 물)에서 채취한 DNA는 원본 유기체를 분리하지 않습니다.
고대 DNA(aDNA): 고대 표본에서 추출한 DNA는 진화 생물학과 고대 인구에 대한 통찰력을 제공합니다. - 염색체 DNA
염색체 DNA: 세포핵 내의 염색체를 구성하는 DNA로, 코딩 영역과 비코딩 영역을 모두 포함합니다. - 바이러스 및 합성 형태
바이러스 DNA: 바이러스에서 파생된 DNA는 숙주 게놈에 통합되거나 독립적인 개체로 존재할 수 있습니다.
합성 DNA: 화학 과정을 통해 생성된 인공적으로 합성된 DNA 염기서열로 연구 및 생명 공학에 자주 사용됩니다.
