초음파에 의한 BL21 세포의 세포 용해
BL21 세포는 단백질을 매우 효율적으로 발현할 수 있는 능력으로 인해 연구 실험실, 생명 공학 및 산업 생산에 널리 사용되는 대장균의 균주입니다. 초음파 세포 파괴, 용해 및 단백질 추출은 BL21 세포의 세포 내부에서 표적 단백질을 분리하고 수집하는 일반적인 방법입니다. 초음파는 세포를 완전히 파괴하고 포획 된 모든 단백질을 방출하여 단백질의 100 %를 사용할 수 있도록합니다.
단백질 발현을 위한 BL21 세포
BL21 cell은 T7 RNA polymerase-IPTG 유도 시스템을 사용하여 형질전환 및 높은 수준의 단백질 발현에 적합한 화학적으로 유능한 E. coli 박테리아 균주입니다. BL21 세포는 T7 프로모터의 제어 하에 있는 모든 유전자의 고효율 단백질 발현을 가능하게 합니다. 대장균 균주 BL21(DE3)은 T7 프로모터 기반 발현 벡터와 결합된 T7 RNA 중합효소 기반 단백질 생산 균주이며 재조합 단백질을 생산하기 위해 실험실 및 산업에서 널리 적용됩니다. BL21(DE3)에서 재조합 단백질을 암호화하는 유전자의 발현은 염색체로 인코딩된 T7 RNA 중합효소(T7 RNAP)에 의해 전사되며, 이는 기존 E. coli RNAP보다 8배 빠르게 전사됩니다. 이것은 균주 BL21 (DE3)을 매우 효율적으로 만들고 가장 선호되는 단백질 발현 세포 시스템 중 하나로 바꿉니다.
BL21 세포에서 초음파 용해 및 단백질 추출을 위한 프로토콜
BL21 세포의 세포 용해는 주로 용해 완충액으로 라우로일 사르코시네이트 나트륨(사르코실이라고도 함)과 함께 초음파를 사용하여 수행됩니다. 초음파 세포 파괴 및 단백질 추출의 장점은 초음파기의 신뢰성, 재현성 및 간단하고 안전하며 신속한 작동에 있습니다. 아래 프로토콜은 초음파 BL21 세포 용해에 대한 단계별 지침을 제공합니다.
- 샤페론 단백질을 제거하기 위해, BL21 박테리아 펠릿을 50ml의 얼음처럼 차가운 트리스-EDTA(Sodium Tris-EDTA(STE) 완충액(10mM Tris-HCL, pH 8.0, 1mM EDTA, 100mM PMSF가 보충된 150mM NaCl로 구성)에 재현탁시켰다.
- 500ul의 라이소자임(10mg/ml)을 첨가하고 세포를 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.
- 그 후, 500 ul의 DTT와 7 ml의 사르코실(STE 완충액에 구성된 10%(w/v))을 첨가한다.
- 모든 정제 버퍼를 얼음처럼 차갑게 유지하고 샘플을 항상 얼음 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 모든 정화 단계는 가능하면 냉장실에서 수행해야 합니다.
- 초음파 용해 및 단백질 추출을 위해, 샘플은 초음파 처리됩니다. VialTweeter MultiSample 초음파발생기 4 x 30 초 동안 100 % 진폭으로 각 초음파 처리 사이에 2 분 간격이 있습니다. 대안적으로, 마이크로 팁이 있는 프로브형 초음파 균질화기(예: UP200HT S26d2 (3 x 30 초, 초음파 사이클 사이 2 분 일시 중지, 80 % 진폭)를 사용할 수 있습니다.
- 추가 정제 단계를 위해 샘플을 얼음 위에 보관하거나 추가 처리 시까지 -80°C에서 보관해야 합니다.
Ultrasonic Lysis under Prescise Temperature Control
The precise and reliable temperature control is crucial when handling biological samples. High temperatures initiate thermally-induced protein degradation in samples.
As all mechanical sample preparation techniques, sonication creates heat. However, the temperature of the samples can be well controlled when using the VialTweeter. We present you various options to monitor and control the temperature of your samples whilst preparing them with the VialTweeter and VialPress for analysis.
- 시료 온도 모니터링 : VialTweeter를 구동하는 초음파 프로세서 UP200St에는 지능형 소프트웨어와 플러그형 온도 센서가 장착되어 있습니다. 온도 센서를 UP200St에 연결하고 온도 센서의 끝을 샘플 튜브 중 하나에 삽입합니다. 디지털 컬러 터치 디스플레이를 통해 UP200St의 메뉴에서 샘플 초음파 처리에 대한 특정 온도 범위를 설정할 수 있습니다. 초음파기는 최대 온도에 도달하면 자동으로 중지되고 샘플 온도가 설정 온도 ∆의 낮은 값으로 내려갈 때까지 일시 중지됩니다. 그런 다음 초음파 처리가 자동으로 다시 시작됩니다. 이 스마트 기능은 열로 인한 성능 저하를 방지합니다.
- VialTweeter 블록은 사전 냉각할 수 있습니다. VialTweeter 블록(변환기가 없는 sonotrode만 해당)을 냉장고나 냉동고에 넣어 티타늄 블록을 사전 냉각하면 샘플의 온도 상승을 연기하는 데 도움이 됩니다. 가능한 경우 샘플 자체도 사전 냉각할 수 있습니다.
- 초음파 처리 중에 식히기 위해 드라이 아이스를 사용하십시오. 드라이 아이스를 채운 얕은 트레이를 사용하고 열이 빠르게 발산될 수 있도록 VialTwitterter를 얼음 위에 놓습니다.
전 세계 고객들은 생물학, 생화학, 의료 및 임상 실험실에서 매일 시료 전처리 작업을 위해 VialTweeter 및 VialPress를 사용합니다. UP200St 프로세서의 지능형 소프트웨어 및 온도 제어, 온도가 안정적으로 제어되고 열로 인한 샘플 저하가 방지됩니다. VialTweeter 및 VialPress를 사용한 초음파 시료 전처리는 매우 신뢰할 수 있고 재현성 있는 결과를 제공합니다!
Lysis Application에 맞는 최적의 초음파 교쇄기 찾기
Hielscher Ultrasonics is long-time experienced manufacturer of high-performance ultrasonic cell disrupters and homogenizers for laboratories, bench-top and industrial scale systems. Your bacterial cell culture size, your research or production goal and the volume of cell to process per hour or day are essential factors to find the right ultrasonic cell disruptor for your application.
Hielscher 초음파는 다중 샘플 (VialTweeter를 사용하여 최대 10 개의 바이알) 및 대량 샘플 (즉, UIP400MTP 마이크로 타이 터 플레이트 / ELISA 플레이트)의 동시 초음파 처리를위한 다양한 솔루션을 제공합니다. 모든 Hielscher 초음파기는 최대 부하에서 24/7/365 작동을 위해 제작되었습니다. 견고성과 신뢰성은 초음파 장치의 핵심 기능입니다.
All digital ultrasonic homogenizers are equipped with smart software, coloured touch display and automatic data protocolling, which make the ultrasonic device into a convenient work tool in lab and production facilities.
생물학적 시료를 처리하기 위해 어떤 종류의 세포, 어떤 부피, 어떤 빈도, 어떤 타겟으로 처리해야 하는지 알려주십시오. 귀하의 공정 요구 사항에 가장 적합한 초음파 세포 교란기를 추천해 드립니다.
The table below gives you an indication of the approximate processing capacity of our ultrasonic systems from compact hand-held homogenizers and MultiSample Ultrasonicators to industrial ultrasonic processors for commercial applications:
배치 볼륨(Batch Volume) | 유량 | 권장 장치 |
---|---|---|
96-well / microtiter plates | N.A. 개시 | UIP400MTP |
10 vials à 0.5 to 1.5mL | N.A. 개시 | VialTweeter at UP200St |
0.01 to 250mL | 5 to 100mL/min | 업50H |
0.01 to 500mL | 10 내지 200mL/분 | 업100H |
10 내지 2000mL | 20 내지 400mL/분 | UP200HT, UP400ST |
0.1 내지 20L | 0.2 내지 4L/min | UIP2000hdT 님 |
10에서 100L | 2 내지 10L/min | UIP4000hdt 님 |
N.A. 개시 | 10 내지 100L/min | UIP16000 |
N.A. 개시 | 큰 | 의 클러스터 UIP16000 |
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알아 둘 만한 가치가 있는 사실
대장균 박테리아
대장균(Escherichia coli)은 포자를 형성하지 않는 박테리아 유형으로, 그람 음성이며 직선 막대 형태가 특징입니다. 대장균은 인간과 동물의 환경, 식품 및 장에 존재합니다. 대장균은 일반적으로 peririchous flagella를 사용하여 운동성이 있지만 비운동성 유형도 있습니다. 대장균은 소위 기능적 혐기성 화학유기영양 유기체라고 불리며, 이는 호흡 대사와 발효 대사를 모두 수행할 수 있음을 의미합니다. 대부분의 대장균 유형은 양성이며 해로운 박테리아 종의 성장 억제, 비타민 합성 등과 같은 신체의 유용한 기능을 수행합니다.
소위 B형이라고 하는 대장균 박테리아 세포는 대장균 균주의 특수 범주로, 박테리오파지 민감성 또는 제한 수정 시스템과 같은 메커니즘을 조사하기 위한 연구에 널리 사용됩니다. 또한 E.coli 박테리아는 생명 공학 및 생명 과학 실험실에서 단백질 발현을 위한 신뢰할 수 있는 장비로 평가받고 있습니다. 예를 들어, E.coli는 단백질 및 올리고당과 같은 화합물을 산업 규모로 합성하는 데 사용됩니다. 프로테아제 결핍, 높은 수준의 포도당에서 낮은 아세테이트 생성, 향상된 투과성과 같은 특정 특성으로 인해 대장균 B 세포는 유전자 조작 단백질 생산에 가장 자주 사용되는 숙주 세포입니다.
재조합 단백질
재조합 단백질(rProt)은 화학 생산, 제약, 화장품, 인간 및 동물 의학, 농업, 식품 및 폐기물 처리 산업을 포함한 다양한 분야에서 상당한 중요성을 얻고 있습니다.
재조합 단백질의 생산은 발현 시스템의 사용을 필요로 합니다. 재조합 DNA의 생산을 위한 세포 시스템을 발현하는 것으로서, 원핵 세포와 진핵 세포를 모두 사용할 수 있습니다. 박테리아 세포는 저렴한 비용, 쉬운 확장성 및 간단한 배지 조건과 같은 요인으로 인해 단백질 발현에 가장 널리 사용되지만 포유류, 효모, 조류, 곤충 및 cell-free 시스템이 대안으로 확립되었습니다. 단백질 유형, 기능적 활성, 발현된 단백질의 필요한 수율은 단백질 발현에 사용되는 세포 시스템의 선택에 영향을 미칩니다.
재조합 단백질을 발현하기 위해서는 특정 세포에 재조합 DNA 템플릿이 포함된 DNA 벡터로 transfection해야 합니다. 그런 다음 템플릿으로 transfection된 세포를 배양합니다. 세포 메커니즘의 결과로, 세포는 관심 단백질을 전사하고 번역하여 표적 단백질을 생산합니다.
발현된 단백질이 세포 기질에 갇히면 단백질을 방출하기 위해 세포를 용해(파괴 및 파괴)해야 합니다. 후속 정제 단계에서 단백질을 분리하고 정제합니다.
치료에 사용된 최초의 재조합 단백질은 1982년 재조합 인간 인슐린이었습니다. 오늘날 전 세계적으로 170가지 이상의 재조합 단백질이 의학적 치료를 위해 생산되고 있습니다. 의학에서 일반적으로 사용되는 재조합 단백질로는 당뇨병, 왜소증, 심근경색, 울혈성 심부전, 뇌 무력증, 다발성 경화증, 호중구 감소증, 혈소판 감소증, 빈혈, 간염, 류마티스 관절염, 천식, 크론병, 암 치료와 같은 주요 질환을 치료하기 위한 재조합 호르몬, 인터페론, 인터류킨, 성장 인자, 종양 괴사 인자, 혈액 응고 인자, 혈전 용해제, 효소 등이 있습니다. (Phuc V. Pham, Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018 참조)
문헌 / 참고문헌
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.