C. Elegans 시료의 초음파 전처리

선충인 C. elegans는 생물학에서 널리 사용되는 모델 생물입니다. 분석 전 시료 전처리에는 세포 용해, 단백질 및 지질 추출, RNA 단편화가 필요하며, 이러한 과정은 초음파 처리를 통해 신뢰성 있게 수행할 수 있습니다. 초음파 세포 파쇄기는 C. elegans 시료를 신속하게 전처리할 수 있는 신뢰성 높고 정교하며 사용하기 쉬운 장치입니다.

C. elegans 시료의 초음파 전처리

Caenorhabditis elegans는 유전체학, 발생생물학 및 질병을 연구하기 위해 연구실에서 널리 사용되는 선충입니다. C. elegans 유전체의 많은 유전자에는 인간에서 기능적으로 대응하는 유전자가 있습니다. 따라서 이 선충은 인간 질병 연구에 매우 유용한 모델입니다. C. elegans가 널리 사용되는 다른 장점으로는 세균(예: E. coli)이 포함된 배지 플레이트에서 쉽고 저렴하게 배양할 수 있다는 점, 투명성, 편리한 취급, 선충을 냉동하여 장기간 보관할 수 있다는 점이 있습니다.
단백질 및 지질 분석은 실험실에서 일상적으로 수행되는 절차이며, 초음파 시료 전처리는 모든 발생 단계(즉, 배아, L1–L4 유충, 성체)의 C. elegans 선충을 세포 용해하는 확립된 방법입니다. C. elegans는 표적 단백질을 과발현시키는 단백질 발현 시스템으로도 사용되므로, 높은 단백질 수율을 제공하는 신뢰성 있고 재현 가능한 세포 용해 및 단백질 추출 방법이 필요합니다. 초음파 세포 파쇄 및 추출 시스템은 프로브형 균질기와 다중 시료 초음파 처리기로 제공됩니다. Hielscher Ultrasonics는 편리한 시료 전처리와 다양한 시료 크기 및 개수에 대응하여 귀하의 실험실 절차에 이상적인 초음파 세포 파쇄기를 제공합니다.

C. Elegans 파쇄 및 세포 용해를 위한 초음파 프로토콜

C. elegans의 초음파 균질화 및 세포 용해와 후속 단백질 및 지질 추출은 서로 다른 균질화 및 용해 완충액 등을 사용하는 다양한 절차로 수행할 수 있습니다. 모든 세포 용해 프로토콜의 공통점은 단백질 분해를 방지하기 위해 시료를 계속 얼음 위에 유지해야 한다는 것입니다. 아래에서는 고품질의 단백질 또는 지질 함유 C. elegans 시료를 준비하기 위한 신뢰성 있고 신속한 초음파 세포 용해 및 추출 프로토콜을 소개합니다.

C. elegans의 초음파 세포 용해의 장점

• 높은 신뢰성
• 재현 가능
• 정밀한 온도 제어
• 신뢰성 있는 공정 제어
• 온화한 처리 방법
• 쉬운 적용
• 안전성

C. elegans 시료에서 초음파를 이용한 단백질 추출

C. elegans 선충의 초음파 세포 용해 및 단백질 추출은 다양한 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있습니다. 아래에서는 재현 가능한 단백질 추출 결과를 얻기 위한 신뢰성 있고 신속한 세포 용해 프로토콜 몇 가지를 소개합니다.

초음파 처리를 통한 C. elegans 선충의 세포질 추출물 신속 제조

다음 프로토콜을 사용하면 30분 미만에 C. elegans 용해물을 준비할 수 있습니다.
C. elegans 수집
원하는 C. elegans 선충을 인산 완충 식염수(PBS)가 담긴 1.5ml 튜브에 옮기거나, 1.5ml PBS로 플레이트에서 씻어 회수합니다. 펠릿을 얻기 위해 2000rpm에서 1min 동안 원심분리합니다. 시료는 항상 얼음 위에 유지합니다.
그런 다음 PBS로 선충을 두 번 세척합니다.
이어서 ddH₂O로 선충을 두 번 세척합니다.
최소 500ul의 균질화 완충액(HB)에 선충을 재현탁합니다. 이제 선충 시료의 초음파 세포 용해 준비가 완료되었습니다.
단백질 추출물의 품질을 높이려면 각각 5min 동안 선충을 세척하는 데 PBS와 멸균 초순수(ddH₂O)를 사용하거나 자당 부유법을 수행하여 세균 오염을 줄일 수 있습니다. 선충 시료를 계속 얼음 위에 유지합니다.

C. elegans의 초음파 세포 용해 프로토콜

• 초음파 균질기를 바로 사용할 수 있도록 초음파 처리기를 미리 준비하십시오(프로브 장착, 초음파 처리 프로그램 사전 설정). 

초음파 처리기가 스탠드에 장착되어 있다면 시료 튜브가 담긴 얼음 수조를 초음파 프로브 아래에 놓고 초음파 프로브를 1.5ml 튜브 안에 삽입하십시오.

• UP200St 또는 UP200Ht로 C. elegans를 세포 용해할 때는 마이크로팁(예: 2mm 프로브 S26d2; 왼쪽 그림 참조)을 사용하여 진폭 40%에서 1sec 동안 초음파 처리하고 처리 사이에 30sec씩 휴지해야 합니다. C. elegans 세포 용해에는 각 1초의 초음파 처리와 30sec의 휴지로 구성된 5회의 주기가 이상적입니다. 세포 용해를 처음 수행하는 경우 각 펄스 후 시료의 소량 분취액을 현미경으로 관찰하여 세포 용해 진행 상태를 확인할 수 있습니다.
• 선충이 파쇄되면 세포 용해가 성공적으로 완료된 것입니다. 과도한 초음파 처리는 핵 파괴를 일으키며, 이는 시료의 점성이 높아지거나 거품이 생기는 것으로 확인할 수 있습니다. 시료 분해를 방지하려면 필요한 경우 펄스 횟수를 늘리십시오. 고품질 단백질 추출물을 얻으려면 각 초음파 펄스 주기의 시간을 늘리지 마십시오.
• 초음파로 세포 용해한 선충을 4ºC에서 14,000rpm으로 10min 동안 원심분리하여 세포 용해액을 청징화하십시오.
• 그런 다음 상층액을 새 튜브로 옮기고 면역침강 또는 기타 분석을 준비하십시오.

균질화 완충액에 관한 참고 사항: 위의 초음파 세포 용해 프로토콜에 사용할 균질화 완충액을 다음과 같이 준비하십시오:

UIP400MTP 플레이트 초음파 처리기를 이용한 96웰 플레이트 내 C. elegans의 고처리량 세포 용해

C. elegans 세포 용해(성체 선충)
UIP400MTP 진폭 80%, 20회 주기(각 초음파 처리 주기: 30 sec 작동, 30 sec 정지)
세포 용해 완충액:

• 옵션 1) 4% SDS, 0.1 M Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA
• 옵션 2) 공동 면역침강(co-IP)용: 10 mM Tris HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.5 % NP-40(Complete 단백질분해효소 억제제 칵테일)

고처리량 DNA 단편화
C. elegans(성체 선충) DNA 200–300bp: UIP400MTP 플레이트 초음파 처리기 – 진폭 80%, 30회 펄스로 설정 – 각 펄스는 30sec 작동, 30sec 정지

고처리량 시료 전처리용 UIP400MTP 플레이트 초음파 처리기는 멀티웰 플레이트, 마이크로타이터 플레이트 및 96웰 플레이트의 시료를 균일하게 초음파 처리합니다

정량적 친화성 정제 분석을 위한 C. elegans의 초음파 세포 용해

어린 포란 자웅동체를 표백 처리하여 C. elegans 배아(반복당 ∼2백만 개)를 생물학적 삼중 반복으로 새로 수집한 후, 얼음 위에서 초음파 처리했습니다(주기: 0.5 s, 진폭: 40–45%, 세션당 5회 펄스, 5회 세션, 세션 간 간격: 30 s; UP200S 초음파 프로세서에 마이크로팁 S26d2(Hielscher Ultrasonics GmbH)를 장착하여 사용). 처리는 세포 용해 완충액(총 부피: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% 글리세롤, 프로테아제 억제제 혼합물, 0.1% Nonidet P-40 Substitute)에서 수행했습니다. 초음파 처리 후 Nonidet P-40 Substitute를 최대 1%까지 첨가하고 세포 용해액을 4°C에서 30 min 동안 상하 반전 회전시키며 배양한 다음, 4°C에서 20,000 × g로 20 min 동안 원심분리했습니다. 그런 다음 상부 지질층을 건드리지 않고 청징화된 세포 용해액을 흡인하여 절반씩 나누고, 각각 항-GFP 아가로스 비드 또는 블로킹 처리한 대조군 비드(40–50 μl)에 첨가했습니다. 4°C에서 60–90 min 동안 상하 반전 회전시킨 후, 비드를 0.1% Nonidet P-40 Substitute가 함유된 세포 용해 완충액으로 한 번 세척한 다음, 완충액 I(25 mm Tris-HCl, pH 7.4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) 또는 완충액 II(1 mm Tris-HCl, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2), 혹은 두 완충액 모두를 사용하여 두 번 세척했습니다. GFP:MBK-2 풀다운에서는 서로 다른 세척 조건을 사용하여 두 차례의 별도 실험을 수행했습니다. 단백질은 실온에서 6 m 요소/2 M 티오요소 용액 50 μl에 넣고 궤도 진탕하여 용출했습니다. MBK-1::GFP 풀다운 실험에서는 90°C에서 8 m 염화구아니디늄 용액 50μl에 넣고 진탕하여 단백질을 두 번 용출한 다음 에탄올 침전을 수행했습니다. 그런 다음 용출된 단백질 시료를 용액 상태에서 소화했습니다.
(참조: Chen et al., 2016)

초음파를 이용한 선충 균질화 및 세포 용해

C.elegans의 세포 용해 및 단백질 추출을 위해 시료당 해당 발달 단계의 선충 30,000마리를 수집하고 얼음처럼 차가운 S-basal로 세척한 다음, 1500 rpm에서 2 min 동안 원심분리하여 농축하고, 잔류 세균을 제거하기 위해 얼음처럼 차가운 S-basal로 여섯 번 세척한 후 사용 준비가 될 때까지 얼음 위에 보관했습니다. 단백질 추출을 위해 알을 품은 성체 선충이 마지막 S-basal 세척 후 조밀한 펠릿을 형성하도록 했습니다. 그런 다음 선충 펠릿을 얼음처럼 차가운 추출 완충액[20 mM 인산칼륨, pH 7.4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, 프로테아제 억제제(Sigma P2714)] 1 ml에 재현탁하고 즉시 처리했습니다.
알을 품은 성체 선충 ∼30,000마리(습중량 ∼100 mg에 해당)를 얼음처럼 차가운 추출 완충액 1 ml에 넣고, 프로브형 초음파 처리기(예: 마이크로팁 MS2가 장착된 UP50H)를 사용하여 얼음 위에서 40% 진폭으로 3 sec 작동, 30 sec 정지를 한 주기로 하여 10주기 동안 초음파 처리했습니다. (참조: Baskharan et al. 2012)

C. elegans의 초음파 지질 추출

대사체학의 한 분야인 지질체학에서는 생물학적 시스템에 존재하는 지질 전체의 특성을 규명하고 분석합니다. C. elegans는 대사 지질의 상호작용과 이러한 지질이 건강 및 수명에 미치는 영향을 연구하기 위해 지질체학에서 널리 사용됩니다.
초음파 세포 용해 및 추출은 C. elegans의 배아, 유충 및 성체 선충에서 스핑고지질과 같은 지질을 방출시키는 데 사용됩니다. 초음파 처리는 선충 균질액을 준비하고 이어서 시료에서 지질을 추출하는 데 사용됩니다.
C. elegans의 초음파 지질 추출 프로토콜
C. elegans 펠릿을 얼음 위에서 해동하고 초순수 0.5 ml로 재현탁합니다. C. elegans 시료를 계속 얼음 위에 유지하면서 1.5mL 시험관에서 초음파 처리합니다.
초음파 처리는 프로브형 초음파 처리기인 UP200Ht, 초음파 시료 전처리 장치인 VialTweeter (시료 10개 동시 초음파 처리) 또는 UIP400MTP (96웰 플레이트와 같은 다중 웰 플레이트의 초음파 처리용)를 사용하여 수행할 수 있습니다. UP200Ht로 초음파 세포 용해를 수행할 때는 마이크로팁 S26d2를 사용합니다. 디지털 메뉴에서 초음파 주기 모드를 미리 설정합니다. 진폭을 10%로 설정하고 초음파 주기 모드를 2 sec 펄스 20주기로 설정하되, 각 초음파 펄스 사이에 30 sec의 정지 시간을 둡니다.
상등액을 나사식 마개가 있는 유리 시험관으로 옮깁니다. 각 유리 시험관에 초순수 1 ml를 첨가한 다음 클로로포름/메탄올 혼합물(비율 = 2:1) 6 ml를 첨가하여 Folch 추출을 수행합니다.
각 유리 시험관을 30 sec씩 4회 보텍싱합니다. 상 분리를 더욱 촉진하기 위해 시험관을 1,258 x g에서 15 min 동안 원심분리합니다(Eppendorf, 5810 R). 유리 파스퇴르 피펫으로 하부 소수성 분획을 깨끗한 유리 시험관에 옮깁니다. 질소 증발기에서 질소를 흘려주면서 하부 소수성 분획을 건조합니다. 건조된 펠릿은 사용할 때까지 -80 °C 냉동고에 보관합니다. 


초음파를 이용한 선충 용해물 준비

선충 용해물: L4 단계 선충을 수확하고 세 번에 걸쳐 M9 완충액(42.26 mM Na₂HPO₄, 22.04 mM KH₂PO₄, 85.56 mM NaCl 및 0.87 mM MgSO₄)를 사용한 세척으로 모든 세균을 제거했습니다. M9 완충액을 최대한 제거한 후, 선충을 세포 용해 완충액에 재현탁했습니다. 완충액의 조성은 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-글리세롤 인산염, 0.1% (v/v) Triton X-100, 50 mM 플루오린화 나트륨, 1 mM 오르토바나듐산 나트륨, 5 mM 피로인산 나트륨, 0.2 mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드 및 프로테아제 억제제였습니다. 선충을 액체 질소에서 동결하고 37°C에서 해동하는 과정을 세 번 반복한 다음, 시료 튜브 10 개를 동시에 전처리하는 초음파 VialTweeter 장치를 사용하여 드라이아이스 위에서 초음파 처리했습니다. 초음파 처리는 진폭 50%에서 각 2 sec.의 10 주기로 수행했으며, 초음파 처리 사이에 30 sec의 휴지 시간을 두었습니다. 이후 시료를 4°C에서 12,000 rpm으로 15 min 동안 원심분리했습니다. 상층액을 회수하여 -70°C에 보관했습니다. 분취액은 Bradford 분석법을 이용한 단백질 정량에 사용했습니다.
총 글루타티온, GSH 및 GSSG 측정: 글루타티온 정량을 위한 용해물 준비와 측정은 같은 날 수행했습니다. 포도당을 공급한 L4 유충과 대조군 L4 유충을 수집하여 M9 완충액으로 세 번 세척했습니다. M9 완충액을 최대한 제거한 후, 선충을 얼음처럼 차가운 메타인산(5% w/v)에 재현탁한 다음, 초음파 VialTweeter를 사용하여 얼음 속에서 진폭 50%로 각 2 sec.의 초음파 처리를 열 주기 수행했으며, 각 주기 사이에 30 sec.의 휴지 시간을 두었습니다. 이후 4 ̊C에서 12,000 rpm으로 15 min 동안 원심분리했습니다.
(참조: Alcántar-Fernández et al., 2018)

면역침강 및 웨스턴 블로팅 전 C. elegans 시료 준비

간단히 설명하면, 배아 추출물을 얻기 위해 C. elegans L1 유충을 대규모 액체 S 배지에서 성체가 될 때까지 배양했습니다. 표준 표백법으로 배아를 수집하여 세포 용해 완충액(50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8.7% 글리세롤, 0.05% NP-40, 1􏰅 프로테아제 억제제 칵테일 및 1􏰅 포스파타제 억제제 칵테일 I 및 II)에 현탁하고 액체 질소에서 빠르게 동결했습니다. 이어서 마이크로팁이 장착된 UP200Ht와 같은 초음파 처리기에 S26d2를 장착하여 30% 진폭에서 10 s 동안 10회의 펄스로 초음파 세포 파쇄를 수행하여 용해했습니다. 더 많은 시료를 준비해야 하는 경우에는 초음파 장치인 VialTweeter 또는 웰 플레이트용 다중 시료 초음파 처리기 UIP400MTP가 권장됩니다. 초음파 처리 후, 추출물을 4°C에서 30,000g로 20 min 동안 원심분리하여 사전 청징화했습니다. 사전 청징화한 추출물(총 단백질 300µg)을 단백질 A-아가로스에 가교 결합한 친화성 정제 anti-CDC-25.1 항체(본 연구) 40µ􏰂g과 함께 배양하거나, 대조군으로 단백질 A-아가로스에 가교 결합한 유사한 양의 토끼 면역글로불린 (Ig)G를 사용했습니다. 이 과정은 1% NP-40을 함유한 세포 용해 완충액 총 200µl에서 수행했으며, NP-40의 첨가는 매트릭스에 대한 단백질의 비특이적 결합을 감소시켰습니다. 시료를 4°C에서 1 h 동안 회전시키고, 비드를 세포 용해 완충액으로 세 번 세척한 다음, 글리신/HCl 30µl 및 200 mM NaCl, pH 2.2로 용출했습니다. 면역침강 후, 용출액을 SDS 시료 완충액 30µ􏰂l로 희석하고 95°C에서 4 min 동안 가열했습니다. 일반적으로 투입 시료는 전체의 3%, 용출액은 전체의 30%를 SDS-PAGE에 적용한 다음, anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), 항-유비퀴틴 (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) 또는 항-􏰁β-액틴 (1:2000) 항체로 웨스턴 블로팅을 수행했습니다. 추출물에 면역침강을 수행하지 않은 경우에는 해당 추출물에서 유래한 동일한 양의 총 단백질을 SDS 시료 완충액에 재현탁하고 95°C로 가열한 다음, SDS-PAGE에 직접 적용하여 웨스턴 블로팅으로 분석했습니다. (참조: Segref et al. 2020)

정밀한 온도 제어하에서의 초음파 세포 용해

생물학적 시료를 취급할 때는 정밀하고 신뢰할 수 있는 온도 제어가 매우 중요합니다. 고온은 시료에서 열에 의한 단백질 분해를 유발합니다.
모든 기계적 시료 전처리 기법과 마찬가지로 초음파 처리도 열을 발생시킵니다. 그러나 VialTweeter를 사용하면 시료 온도를 잘 제어할 수 있습니다. VialTweeter와 VialPress로 분석용 시료를 전처리하는 동안 시료 온도를 모니터링하고 제어할 수 있는 다양한 방법을 소개합니다.

1. 시료 온도 모니터링: VialTweeter를 구동하는 초음파 프로세서 UP200St에는 지능형 소프트웨어와 탈착식 온도 센서가 장착되어 있습니다. 온도 센서를 UP200St에 연결하고 센서 끝을 시료 튜브 중 하나에 삽입하십시오. 디지털 컬러 터치 디스플레이를 통해 UP200St 메뉴에서 시료의 초음파 처리에 사용할 특정 온도 범위를 설정할 수 있습니다. 초음파 처리기는 최고 온도에 도달하면 자동으로 정지하고 시료 온도가 설정된 온도 ∆의 하한값까지 내려갈 때까지 일시 정지 상태를 유지합니다. 이후 초음파 처리가 자동으로 다시 시작됩니다. 이 스마트 기능은 열에 의한 분해를 방지합니다.
2. VialTweeter 블록은 사전 냉각할 수 있습니다. VialTweeter 블록(변환기를 제외한 소노트로드만!)을 냉장고나 냉동고에 넣어 티타늄 블록을 사전 냉각하면 시료의 온도 상승을 늦추는 데 도움이 됩니다. 가능하면 시료 자체도 사전 냉각할 수 있습니다.
3. 초음파 처리 중 냉각을 위해 드라이아이스를 사용하십시오. 드라이아이스를 채운 얕은 트레이를 사용하고 그 위에 VialTweeter를 놓아 열이 빠르게 방출되도록 하십시오.

세포 용해 용도에 최적인 초음파 세포 파쇄기 찾기

Hielscher Ultrasonics는 실험실, 벤치탑 및 산업 규모 시스템용 고성능 초음파 세포 파쇄기와 균질기를 제조하는 오랜 경험을 갖춘 제조업체입니다. 세균 세포 배양 규모, 연구 또는 생산 목표, 시간당 또는 일일 처리할 세포의 부피는 용도에 적합한 초음파 세포 파쇄기를 찾는 데 필수적인 요소입니다.
Hielscher Ultrasonics는 다중 시료(최대 10개 바이알) 및 대량 시료(즉, 마이크로타이터 플레이트 / 96웰 플레이트)의 동시 초음파 처리를 위한 다양한 솔루션을 제공하며, 50–400와트의 다양한 출력 수준을 갖춘 기존의 프로브형 실험실용 초음파 처리기부터 대규모 생산에서 상업적 세포 파쇄 및 단백질 추출에 사용되는 장치당 최대 16,000와트의 완전한 산업용 초음파 프로세서까지 제공합니다. 모든 Hielscher 초음파 처리기는 최대 부하에서 24/7/365 가동하도록 제작됩니다. 견고성과 신뢰성은 당사 초음파 장치의 핵심 특성입니다.
모든 디지털 초음파 균질기는 스마트 소프트웨어, 컬러 터치 디스플레이 및 자동 데이터 기록 기능을 갖추고 있어 실험실과 생산 시설에서 편리한 작업 도구로 사용할 수 있습니다.
어떤 종류의 세포를, 어느 정도의 부피로, 얼마나 자주, 어떤 목표로 생물학적 시료를 처리해야 하는지 알려주십시오. 공정 요구 사항에 가장 적합한 초음파 세포 파쇄기를 추천해 드리겠습니다.

아래 표는 소형 휴대용 균질기와 다중 시료 초음파 처리기부터 상업적 용도의 산업용 초음파 프로세서까지 당사 초음파 시스템의 대략적인 처리 용량을 보여줍니다.