예쁜꼬마선충(C. elegans) 샘플의 초음파 전처리

예쁜꼬마선충(C. elegans)은 생물학에서 널리 사용되는 모델 유기체입니다. 분석 전 시료 전처리에는 용해, 단백질 및 지질 추출, RNA 단편화가 필요하며, 이는 초음파 처리를 통해 안정적으로 수행할 수 있습니다. 초음파 세포 파괴기는 예쁜꼬마선충(C. elegans) 시료의 빠른 준비를 위한 신뢰할 수 있고 정교하며 사용하기 쉬운 장치입니다.

예쁜꼬마선충(C. elegans) 샘플의 초음파 전처리

예쁜꼬마선충(C. elegans)은 회충으로 유전체학, 발달생물학 및 질병을 조사하기 위한 연구 실험실에서 널리 사용됩니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 게놈에 있는 많은 유전자는 인간의 기능적 대응물을 가지고 있습니다. 따라서 선충 벌레는 인간 질병에 대한 매우 유용한 모델입니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 광범위한 사용을 위한 다른 장점은 박테리아(예: 대장균)가 포함된 플레이트에서 쉽고 저렴하게 재배할 수 있고, 투명성, 편리한 취급, 지렁이를 더 오랜 기간 동안 얼렸다가 보관할 수 있다는 것입니다.
단백질 및 지질 분석은 실험실의 일반적인 절차이며 초음파 시료 전처리는 모든 발달 단계(예: 배아, 유충 L1-L4, 성체)에서 예쁜꼬마선충을 용해하는 확립된 방법입니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 표적 단백질을 과도하게 발현하기 위한 단백질 발현 시스템으로도 사용되기 때문에 높은 단백질 수율을 제공하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 용해 및 단백질 추출 방법이 필요합니다. 초음파 세포 파괴 및 추출 시스템은 프로브 형 균질화 기 및 다중 샘플 초음파기로 사용할 수 있습니다. 편리한 샘플 준비와 모든 종류의 샘플 크기 수를 제공하는 Hielscher 초음파는 실험실 절차에 이상적인 초음파 세포 교란기를 보유하고 있습니다.

예쁜꼬마선충(C. elegans) 파괴 및 용해(Disruption and Lysis)에 대한 초음파 프로토콜

예쁜꼬마선충(C. elegans)의 초음파 균질화 및 용해, 그리고 그에 따른 단백질 및 지질 추출은 다양한 균질화 및 용해 완충액 등을 사용하여 다양한 절차를 사용하여 수행할 수 있습니다. 모든 lysis 프로토콜은 단백질 분해를 방지하기 위해 샘플을 지속적으로 얼음 위에 보관해야 한다는 공통점이 있습니다. 아래에서는 고품질 단백질 또는 지질 함유 예쁜꼬마선충(C. elegans) 시료를 준비하기 위한 신뢰할 수 있고 신속한 초음파 용해 및 추출 프로토콜을 제시합니다.

초음파 예쁜꼬마선충 용해의 장점

• 믿음직한
• 재현할
• 정밀하게 온도 제어
• 신뢰할 수 있는 공정 제어
• 젠틀 메소드
• 적용하기 쉬움
• 금고

예쁜꼬마선충(C. elegans) 샘플에서 초음파 단백질 추출

예쁜꼬마선충(C. elegans worms)의 초음파 용해 및 단백질 추출은 다양한 프로토콜을 사용하여 수행할 수 있습니다. 아래에서는 재현성 있는 단백질 추출 결과를 위한 몇 가지 신뢰할 수 있고 신속한 lysis 프로토콜을 제시합니다.

초음파 처리에 의한 예쁜꼬마선충 (C. elegans Worms)의 세포질 추출물의 신속한 준비

다음 프로토콜을 사용하면 30분 이내에 예쁜꼬마선충(C. elegans) 용해물을 준비할 수 있습니다.
예쁜꼬마선충(C. elegans) 컬렉션
원하는 예쁜꼬마선충을 1.5ml 튜브 인산염 완충 식염수(PBS)에 선택하거나 1.5ml PBS가 있는 접시에서 세척합니다. 펠릿에 2000rpm에 1분 동안 분리하기. 샘플을 항상 얼음 위에 보관하십시오.
그런 다음 PBS로 웜을 두 번 씻으십시오.
그런 다음 ddH로 벌레를 두 번 씻으십시오₂O.
웜을 최소 500ul의 균질화 완충액(HB)에 재현탁시킵니다. 이제 웜 샘플은 초음파 용해를 위해 준비되었습니다.
더 높은 단백질 추출물 품질을 위해 PBS와 멸균 초순수(ddH₂O) 또는 자당 부양을 수행합니다. 웜 샘플을 얼음 위에 계속 보관하십시오.

초음파 예쁜꼬마선충 Lysis 프로토콜

• 초음파 균질화기를 사용할 준비가 될 수 있도록 초음파기를 미리 준비해야합니다 (프로브 장착, 초음파 처리 프로그램 사전 설정).

초음파기가 스탠드 장착되어있는 경우 초음파 프로브 아래에 샘플 튜브가있는 얼음 욕조를 놓고 초음파 프로브를 1.5ml 튜브에 삽입합니다.

• UP200St 또는 UP200Ht를 사용한 예쁜꼬마선충 용해의 경우, 초음파는 1 초 동안 40 % 진폭에서 마이크로 팁 (예 : 2mm 프로브 S26d2, 왼쪽 그림 참조)을 사용하여 수행해야하며 그 사이에 30 초가 일시 중지됩니다. 30 초의 일시 중지와 함께 각 1 초마다 5 개의 초음파 처리주기는 예쁜꼬마선충 용해에 이상적입니다. 처음으로 lysis를 수행하는 경우 현미경을 사용하여 각 펄스 후 샘플의 작은 부분 표본에서 용해 진행을 확인할 수 있습니다.
• 웜이 파괴되면 용해가 성공적으로 완료됩니다. 과잉 초음파 처리는 핵의 파손을 초래하고 샘플이 점성 또는 거품을 얻을 때 볼 수 있습니다. 샘플 분해를 방지하려면 필요한 경우 더 많은 펄스를 사용하십시오. 고품질 단백질 추출물을 얻기 위해 각 초음파 펄스 주기의 시간을 늘리지 마십시오.
• 14,000rpm에서 4ºC에서 10분 동안 초음파로 용해된 웜을 원심분리하여 세포 용해물을 제거합니다.
• 그런 다음 상층액을 새 튜브로 옮기고 면역침전 또는 기타 분석을 준비합니다.

균질화 버퍼에 대한 참고 사항: 위의 초음파 용해 프로토콜에 대한 균질화 버퍼를 다음과 같이 준비합니다.

UIP400MTP 플레이트 초음파 발생기를 사용하여 96-Well Plates에서 예쁜꼬마선충의 고처리량 용해

예쁜꼬마선충(C. elegans Lysis, 성체 선충)
UIP400MTP 80 % 진폭, 20 사이클 (각 초음파 처리주기 : 30 초 ON, 30 초 OFF)
용해 버퍼:

• 옵션 1) 4% SDS, 0.1M Tris/HCl pH 8.0, 1mM EDTA
• 옵션 2) 공동 면역침전(co-IP): 10 mM Tris HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.5 % NP-40 (완전 단백질 분해효소 억제제 칵테일)

고처리량 DNA 단편화
예쁜꼬마선충(성인 선충류) DNA 200-300bp: UIP400MTP판 초음파 발생기 – 80% 진폭 설정, 30펄스 – 각 30초 켜기, 30초 끄기

고스루츄 시료 전처리를 위한 UIP400MTP Plate Sonicator는 다중 웰, 마이크로타이터 플레이트 및 96웰 플레이트에서 시료를 균일하게 초음파 처리합니다.

정량적 친화성 정제 분석을 위한 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 초음파 용해

예쁜꼬마선충(C. elegans) 배아(복제당 ∼200만개)는 어린 중력 자웅동체를 표백하여 생물학적 삼중으로 신선하게 수확하고 얼음에서 초음파 처리했습니다(주기: 0.5초, 진폭: 40–45%, 5스트로크/세션, 5세션, 세션 간 간격: 30초; UP200S 초음파 프로세서 용해 완충액 (총 부피 : ∼ 600 μl, 50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10 % 글리세롤, 프로테아제 억제제 혼합물, 0.1 % Nonidet P-40 대체물). 초음파 처리 후, Nonidet P-40 Substitute를 1 %까지 첨가하고 용해물을 4 ° C에서 30 분 동안 꼬리 회전으로 머리를 배양 한 후 4 ° C에서 20 분 동안 20,000 × g에서 원심 분리했습니다. 그런 다음 투명화된 용해물을 상부 지질층을 방해하지 않고 흡인하고 항-GFP 아가로스 비드 또는 차단된 대조군 비드(40–50 μl)로 반으로 분할했습니다. 60-90분 동안 4°C에서 헤드 오버 테일 회전한 후, 비드를 0.1% Nonidet P-40 대체물을 함유한 용해 완충액으로 한 번 세척한 후 완충액 I(25mm Tris-HCl, pH 7.4, 300mm NaCl, 1mm MgCl2) 또는 완충액 II(1mm Tris-HCl, pH 7.4, 150mm NaCl, 1mm MgCl2) 또는 둘 다. GFP:MBK-2 풀다운의 경우 서로 다른 세척 조건을 사용하여 두 가지 개별 실험을 수행했습니다. 단백질은 실온에서 50μl의 6m 요소/2M 티오우레아에서 궤도 진탕에 의해 용출되었습니다. MBK-1::GFP 풀다운 실험의 경우 90°C에서 8m 염화구아니디늄 50μl를 흔든 후 에탄올 침전을 하여 단백질을 두 번 용출시켰습니다. 그런 다음 용리된 단백질 샘플을 용액 내에서 분해했습니다.
(참조: Chen et al., 2016)

Ultrasonic Worm Homogenization and Lysis

예쁜꼬마선충(C.elegans) 용해 및 단백질 추출 절차를 위해 해당 단계의 선충 30,000개를 샘플당 채취하여 얼음처럼 차가운 S-basal에서 세척하고, 1500rpm에서 원심분리로 2분 동안 농축한 후, 얼음처럼 차가운 S-basal로 6회 세척하여 잔류 박테리아를 제거한 후 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 보관했습니다. 단백질 추출을 위해, gravid-adult worms는 마지막 S-basal 세척 후에 소형 펠릿을 형성하도록 허용되었습니다. 그런 다음 웜 펠릿을 1ml의 얼음처럼 차가운 추출 완충액[20mM 인산칼륨, pH 7.4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, 프로테아제 억제제(Sigma P2714)]에 재현탁시키고 즉시 처리했습니다.
∼30,000 gravid-adult worms (∼ 100 mg 습식 중량에 해당)는 프로브 형 초음파 발생기 (예 : 마이크로 팁 MS2가있는 UP50H)를 사용하여 얼음 위에서 초음파 처리되었습니다. (Baskharan et al. 2012 참조)

예쁜꼬마선충(C. elegans)의 초음파 지질 추출

대사체학(metabolomics)의 한 분야인 지질체학(lipidomics)에서는 생물학적 시스템의 지질 보체를 특성화하고 분석합니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 대사 지질의 상호 작용과 건강 및 수명에 미치는 영향을 조사하기 위해 지질체학에서 널리 사용됩니다.
초음파 용해 및 추출은 예쁜꼬마선충(C. elegans) 배아, 유충 및 성충에서 스핑고지질과 같은 지질을 방출하는 데 사용됩니다. 초음파는 웜 균질액을 준비하고 샘플에서 지질을 추출하는 데 사용됩니다.
예쁜꼬마선충(C. elegans)의 초음파 지질 추출을 위한 프로토콜
예쁜꼬마선충(C. elegans) 펠릿을 얼음 위에서 해동하고 0.5ml의 초강력수로 재현탁합니다. 
예쁜꼬마선충(C. elegans) 샘플을 1,5mL 시험관에서 초음파 처리하면서 샘플을 얼음 위에 계속 유지합니다.
초음파 처리는 다음과 같은 프로브 초음파를 사용하여 수행 할 수 있습니다. UP200HT, 초음파 시료 전처리 장치 바이알트위터 (10 샘플의 동시 초음파 처리) 또는 UIP400MTP (96-well plates와 같은 multi-well plates의 초음파 처리를 위해). UP200Ht를 사용한 초음파 용해의 경우 마이크로 팁 S26d2를 사용하십시오. 디지털 메뉴에서 초음파 사이클 모드를 미리 설정합니다. 진폭을 10 %로 설정하고 초음파 발생주기 모드를 2 초 펄스로 설정하고 각 초음파 맥동 버스트 사이에 30 초의 일시 중지를 제공합니다.
상층액을 스크류 캡이 있는 유리관으로 옮깁니다. 
각 유리관에 1ml의 초미수를 첨가한 다음 각 유리관에 6ml의 클로로포름/메탄올(비율 = 2:1) 혼합물을 첨가하여 Folch 추출을 수행합니다.
각 유리관을 30초 동안 4회 소용돌이칩니다. 
튜브를 1,258 x g에서 15분 동안 원심분리하여(Eppendorf, 5810 R) 상 분리를 더욱 강화합니다. 
더 낮은 소수성 분획을 유리 파스퇴르 피펫으로 깨끗한 유리관으로 옮깁니다. 
질소 증발기에서 질소 흐름 하에서 더 낮은 소수성 분율을 건조시킵니다. 
건조된 펠릿을 사용할 때까지 -80 °C 냉동고에 보관하십시오.

Worm Lysate의 초음파 준비

웜 용해물: L4 단계 웜을 수확하여 M9 완충액(42.26 mM Na₂HPO(주)₄, 22.04 mM KH₂포₄, 85.56mM NaCl 및 0.87mM MgSO₄) 모든 박테리아를 제거하기 위해. M9 완충액을 가능한 한 많이 제거한 후, 웜을 용해 완충액에 재현탁시켰다: 50mM HEPES, 50mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5mM 인산β-글리세롤, 0.1%(v/v) Triton X-100, 50mM 불화나트륨, 1mM 소듐 오르토바나데이트, 5mM 피로인산나트륨, 0.2mM 페닐메탄설포닐플루오라이드 및 프로테아제 억제제. 웜을 액체 질소에 얼린 다음 37°C에서 3회 해동한 다음 10개의 샘플 튜브를 동시에 준비하기 위해 초음파 VialTweeter 장치를 사용하여 드라이아이스에서 웜을 초음파 처리했습니다. 초음파 처리는 2 초의 10 사이클로 50 % 진폭으로 수행되었으며, 초음파 파열 사이에 30 초의 일시 중지가 있었다. 그 후, 샘플을 4°C에서 12000rpm으로 15분 동안 원심분리했습니다. 상층액을 채취하여 -70°C에서 보관하였다. 부분 표본은 Bradford assay에 의한 단백질 정량화에 사용되었습니다.
총 글루타치온, GSH 및 GSSG 측정: 글루타치온 정량을 위해 용해물과 측정은 당일에 이루어졌습니다. 포도당을 먹인 유충 및 대조군 L4 유충을 수확하고 M9 완충액으로 3회 세척하였다. M9 완충액을 가능한 한 많이 제거한 후, 웜을 얼음처럼 차가운 메타 인산 (5 % w? v)에 재현 탁 한 후, 웜을 2 초의 10 개의 초음파 처리 사이클에서 50 % 진폭으로 초음파 바이알트위터로 얼음에서 초음파 처리했습니다. 각 사이클 사이에 30 초 일시 중지. 그 후, 4°C에서 12000rpm으로 15분 동안 원심분리합니다.
(Alcántar-Fernández et al., 2018 참조)

예쁜꼬마선충(C. elegans) 면역침전 전 시료 전처리 및 웨스턴 블로팅(Western Blotting)

요컨대, 배아 추출물의 경우, 예쁜꼬마선충(C. elegans L1) 유충은 성체가 될 때까지 대규모 액체 S-medium 배양에서 성장했습니다. 배아를 표준 표백법을 사용하여 채취하고 용해 완충액(50mM Tris, pH 7.5, 100mM KCl, 1mM EDTA, 1mM MgCl2, 8.7% 글리세롤, 0.05% NP-40, 1Shr�g Protease Inhibitor Cocktail 및 1Phosphatase Inhibitor Cocktail I 및 II)에 현탁하고, 액체 질소에 급속 동결하고, 다음과 같은 마이크로팁이 있는 초음파발생기를 사용하여 초음파 세포 파괴에 의해 용해시켰다. UP200HT 26% 진폭에서 10초 동안 10초 동안 20펄스에 대해 S30d2를 사용합니다. 더 많은 수의 샘플을 준비해야 하는 경우 초음파 바이알트위터 또는 웰 플레이트 용 MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP 권장됩니다. 초음파 처리 후, 추출물을 4 ° C에서 20 분 동안 30,000g에서 원심 분리하여 사전 투명 하 졌다. 사전 승인된 추출물(총 단백질 300μg)을 단백질 A-아가로스와 가교 결합된 항-CDC-25.1 친화성 정제 항체(본 연구) 40μg와 함께 배양하거나, 대조군으로 단백질 A-아가로스에 가교 결합된 유사한 양의 토끼 면역글로불린(Ig)G를 1% NP-40을 함유한 총 부피 200μl의 용해 완충액에 사용했으며, 이를 포함하면 매트릭스에 대한 단백질의 비특이적 결합이 감소했습니다. 샘플을 4°C에서 1시간 동안 회전시키고 비드를 용해 완충액으로 3회 세척한 다음 30μl의 글리신/HCl 및 200mM NaCl, pH 2.2로 용출했습니다. 면역침전 후 용출액을 SDS 시료 완충액 30μc에 희석하고 95°C로 4분 동안 가열한 후 통상적으로 투입액의 3%를 투입액의 3%, 용출액의 30%를 SDS-PAGE에 도포한 후 항-CDC-25.1(1:400), 항-LIN-23(1:750), 항-유비퀴틴(1:1000), 항-GSK300(1:500) 또는 항-기β-액틴(1:2000) 항체로 웨스턴 블로팅하였다. 추출물이 면역침전을 거치지 않은 경우, 해당 추출물에서 파생된 동일한 양의 총 단백질을 SDS 샘플 버퍼에 재현탁시키고 95°C로 가열한 다음 SDS-PAGE에 직접 적용하고 웨스턴 블로팅으로 분석했습니다. (Segref et al. 2020 참조)

Prescise 온도 조종의 밑에 초음파 용해

정밀하고 신뢰할 수 있는 온도 제어는 생물학적 시료를 취급할 때 매우 중요합니다. 고온은 시료에서 열로 인한 단백질 분해를 시작합니다.
모든 기계적 샘플 준비 기술과 마찬가지로 초음파 처리는 열을 생성합니다. 그러나 샘플의 온도는 VialTweeter를 사용할 때 잘 제어할 수 있습니다. 분석을 위해 VialTweeter 및 VialPress로 시료를 준비하는 동안 시료의 온도를 모니터링하고 제어할 수 있는 다양한 옵션을 제공합니다.

1. 시료 온도 모니터링 : VialTweeter를 구동하는 초음파 프로세서 UP200St에는 지능형 소프트웨어와 플러그형 온도 센서가 장착되어 있습니다. 온도 센서를 UP200St에 연결하고 온도 센서의 끝을 샘플 튜브 중 하나에 삽입합니다. 디지털 컬러 터치 디스플레이를 통해 UP200St의 메뉴에서 샘플 초음파 처리에 대한 특정 온도 범위를 설정할 수 있습니다. 초음파기는 최대 온도에 도달하면 자동으로 중지되고 샘플 온도가 설정 온도 ∆의 낮은 값으로 내려갈 때까지 일시 중지됩니다. 그런 다음 초음파 처리가 자동으로 다시 시작됩니다. 이 스마트 기능은 열로 인한 성능 저하를 방지합니다.
2. VialTweeter 블록은 사전 냉각할 수 있습니다. VialTweeter 블록(변환기가 없는 sonotrode만 해당)을 냉장고나 냉동고에 넣어 티타늄 블록을 사전 냉각하면 샘플의 온도 상승을 연기하는 데 도움이 됩니다. 가능한 경우 샘플 자체도 사전 냉각할 수 있습니다.
3. 초음파 처리 중에 식히기 위해 드라이 아이스를 사용하십시오. 드라이 아이스를 채운 얕은 트레이를 사용하고 열이 빠르게 발산될 수 있도록 VialTweeter를 드라이 아이스 위에 놓습니다.

Lysis Application을 위한 최적의 초음파 세포 교란기 찾기

Hielscher 초음파는 실험실, 벤치 탑 및 산업 규모 시스템을위한 고성능 초음파 세포 교란기 및 균질화기의 오랜 경험 많은 제조업체입니다. 박테리아 세포 배양 크기, 연구 또는 생산 목표, 시간당 또는 하루에 처리할 세포의 양은 응용 분야에 적합한 초음파 세포 교란기를 찾는 데 필수적인 요소입니다.
Hielscher 초음파는 다중 샘플 (최대 10 개의 바이알)과 대량 샘플 (즉, 마이크로 타이터 플레이트? 96 웰 플레이트)의 동시 초음파 처리를위한 다양한 솔루션을 제공합니다. 모든 Hielscher 초음파기는 최대 부하에서 24/7/365 작동을 위해 제작되었습니다. 견고성과 신뢰성은 초음파 장치의 핵심 기능입니다.
모든 디지털 초음파 균질화기에는 스마트 소프트웨어, 컬러 터치 디스플레이 및 자동 데이터 프로토콜이 장착되어있어 초음파 장치를 실험실 및 생산 시설의 편리한 작업 도구로 만듭니다.
생물학적 샘플을 처리하기 위해 어떤 종류의 세포, 어떤 부피, 어떤 빈도, 어떤 타겟으로 처리해야 하는지 알려주십시오. 귀하의 공정 요구 사항에 가장 적합한 초음파 세포 교쇄기를 추천해 드립니다.

아래 표는 소형 휴대용 균질화 기 및 MultiSample 초음파에서 상업용 응용 프로그램을위한 산업용 초음파 프로세서에 이르기까지 초음파 시스템의 대략적인 처리 용량을 나타냅니다.