서양 블 럿팅을위한 초음파 용해

  • 웨스턴 블랏은 조직 균질 액 또는 세포 추출물의 샘플에서 특정 단백질을 검출하기위한 분석 절차입니다.
  • 웨스턴 블 롯을 실행하거나 효소 활성을 측정하기 위해 많은 분석법에서 세포에 포집 된 물질 (예 : 단백질, DNA, 세포 내 파편)에 접근해야합니다.
  • Sonication은 제어 및 세포 분열 및 용해를위한 신뢰할 수 있고 다루기 쉬운 방법입니다.

초음파 세포 파괴

조직 및 배양 된 세포에서 단백질 추출은 많은 생물학적, 생화학 및 분석 기술 (PAGE, Western blotting, ELISA, 질량 분광법 등) 또는 단백질 정제를위한 첫 번째 단계입니다. 단백질 수율을 높이려면 세포 물질과 조직을 효율적으로 파쇄 / 용해해야합니다. 식물 세포 또는 동물 조직이든, 초음파 처리는 세포 용해를 쉽고 빠르게 준비하는 방법입니다.

Sonication의 장점

  • 빠른 & 실력 있는
  • 쉬운 조작
  • 고 단백질 수율
  • 재현성 / 반복성
  • 정밀하게 제어되는
  • 확장 성있는

정보 요청




우리의 주의 개인 정보 정책.


Hielscher's VialTweeter is ideal for the lysis of multiple samples

VialTweeter 초음파 처리기 세포 파괴 및 단백질 분리와 같은 초음파 샘플 준비용

Western Immunoblotting을위한 면역 침전 프로토콜

A. 시약

용액을 준비 할 때는 Milli-Q와 같은 정제수를 사용하십시오.

  • 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)
  • 1X 세포 용해 완충액 : 20mM 트리스 (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1 % 트리톤 X-100, 2.5mM 피로 인산 나트륨, 1mM β- 글리세로 포스페이트, 1mM Na3VO4, 1㎍ / ml Leupeptin
    중요 : 사용 직전에 1 mM PMSF를 첨가하십시오.
  • 15 μl Protein A + 15 μl Protein G가 IP에는 충분하지만 일차 항체와 샘플 용량에 따라 다를 수 있습니다. 미리 혼합 된 단백질 A / G 아가로 오스 (예 : 토끼 IgG 풀다운을위한 단백질 A 및 마우스 IgG 풀다운을위한 단백질 G)
  • 3X SDS 시료 완충액 : 187.5 mM Tris-HCl (25 ℃에서 pH 6.8), 6 % w / v SDS, 30 % 글리세롤, 150 mM DTT, 0.03 % w / v 브로 모 페놀 블루

B. 세포 용해 액의 제조

  • 세포 수확. nondenaturing 조건에서 세포를 수확하기 위해, 미디어를 제거하고 얼음으로 차가운 PBS로 한 번 세포를 씻어.
  • PBS를 제거하고 각 접시 (10cm) 0.5 ML 얼음처럼 차가운 1X 세포 용해 버퍼를 추가하고 얼음에 판을 5 분 품어.
  • 플레이트에서 세포를 긁어 내고 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 얼음에 붙어.
  • 얼음 - 차가운 면역 침전 완충액 (IP 완충액 : 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1 % NP-40 및 프로테아제 억제제 혼합물)에서 10 초 동안 2 회 초음파 세정한다. 초음파 처리를 위해 유리 병 또는 프로브 초음파 발생기 (예 : UP100H 또는 UP200Ht 가장 적합합니다.
  • 4 ° C에서 10 분 동안 15,000 g에서 lysate를 원심 분리하십시오.
  • 상층 액을 새 튜브로 옮긴다. (필요하다면 lysate는 -80 ° C에 보관할 수 있습니다.)
  • 뜨는에 일차 항체를 추가합니다. 일차 항체와 뜨는은 가벼운 교반하에 4 ° C에서 1 시간 incubated 있습니다. 일차 항체는 전형적으로 웨스턴 블 랏팅에 사용되는 양보다 10 배 더 농축 된 양으로 첨가된다. (100μL 당 1μg부터 시작할 수 있습니다.)
  • 상등액을 같은 양의 Protein A-agarose (Invitrogen)와 Protein G 아가로 오스의 혼합물과 함께 1 시간 더 배양한다.
  • IP 버퍼로 아가로 오스 알약을 세 번 씻으십시오. 그런 다음 95 ° C에서 5 분간 가열하여 SDS-PAGE 로딩 완충액으로 결합 된 단백질을 추출합니다.

C. 면역 침전

  • 200 μl 세포 lysate을 가지고 일차 항체를 추가합니다. 4 ° C에서 온화한 로킹으로 밤새 품을 수 있습니다.
  • 단백질 A 또는 G 아가로 오스 비드 (50 % 비드 슬러리 20 μl)를 첨가하십시오. 4 ° C에서 1 ~ 3 시간 부드럽게 흔들어주십시오.
  • 4 ℃에서 30 초 동안 Microcentrifuge. 1X 세포 용해 버퍼 500 μl로 펠렛을 5 번 씻으십시오. 세척 중에 얼음을 계속하십시오.
  • 20 μl 3X SDS 샘플 버퍼와 쥐똥을 Resuspend. 소용돌이 치고 나서 30 초 동안 미세 원심 분리하십시오.
  • 샘플을 95 ~ 100 ℃로 2 ~ 5 분간 가열하고 1 분간 14,000 X g으로 미세 원심 분리기에 넣습니다.
  • SDS-PAGE 젤 (12-15 %)에 샘플 (15-30 μl)을로드하십시오.
  • Western blotting으로 시료를 분석한다.

초음파 처리기를 사용한 웨스턴 블롯 분석 UP50H

프로브 형 초음파 처리기 UP50H를 사용하는 다음 프로토콜은 Kriebisch et al. (2011) :
초음파 프로브 형 균질화 UP50H는 일반적으로 웨스턴 블로팅 전 샘플 준비 단계로 세포 파괴 및 단백질 분리에 사용됩니다총 단백질은 1,25 (OH)로 처리 된 MC3T3-E1 세포로부터 분리하였고,2 (10-8 M) 또는 차량. 세포를 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich)을 함유하는 완충액으로 용해시켰다; 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) (Fisher Scientific); 1 % IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) 및 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 (Merck). 세포 용 해물을 사이클 1 및 진폭 80에서 2 x 10 s 동안 UP50H 초음파 프로세서 (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germany). 그 후, 물질을 14,000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하고, 상등액을 웨스턴 블 랏팅에 사용 하였다. 샘플 완충액 및 환원제 (Invitrogen)에서 단백질 25 μg을 끓인 후 4-12 % 폴리 아크릴 아미드 겔 (Invitrogen)을 사용하여 SDS-PAGE로 분리하고 니트로 셀룰로오스 막 (GE 건강 관리)으로 옮겼다. 막을 1 % 카세인 (Sigma-Aldrich) 및 1 % Tris (1M)를 함유하는 TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl)로 1 시간 동안 차단시켰다. 차단 후, 막을 1 차 항체 (토끼 항 인간 CBS 1/500, R. Banerjee 교수, 미국 미시건 주 Ann Arbor 소재 연구소에서 개발)와 함께 4 ℃에서 밤새 교반하면서 항온 배양 하였다. 와사비니 퍼 옥시다아제 (HPR) - 접합 된 2 차 항체 (Dako)와의 배양을 실온에서 1 시간 동안 수행 하였다. 모든 도말은 향상된 화학 발광 (Perkin Elmer)에 의해 개발되었습니다.
 

이 튜토리얼은 실험실, 분석 및 연구에서 용해, 세포 파괴, 단백질 분리, DNA 및 RNA 단편화와 같은 샘플 준비 작업에 가장 적합한 초음파 발생기 유형을 설명합니다. 응용 분야, 시료 부피, 시료 수 및 처리량에 이상적인 초음파 처리기 유형을 선택하십시오. Hielscher 초음파는 당신에게 이상적인 초음파 균질화기를 가지고 있습니다!

과학 및 분석에서 세포 파괴 및 단백질 추출을위한 완벽한 초음파 발생기를 찾는 방법

동영상 썸네일

 

초음파 세포 용해 및 추출, 용해물 준비 및 공정 개선을 위한 권장 사항에 대한 모범 사례에 대해 자세히 알아보려면 여기를 클릭하십시오!
 
아래 표는 실험실 크기의 초음파 발생기의 대략적인 처리 용량을 나타냅니다.

권장 장치일괄 볼륨유량
UIP400MTP 96웰 플레이트 초음파 처리기다중 웰/마이크로타이터 플레이트N.A.
초음파 cuphorn바이알 또는 비커용 CupHornN.A.
GDmini2초음파 마이크로 플로우 반응기N.A.
유리 병0.5 ~ 1.5mLN.A.
UP100H1 ~ 500mL10 ~ 200mL / min
UP200Ht, UP200St10 내지 1000 밀리람베르트20 내지 200mL/분
UP400St10 ~ 2000mL20 ~ 400 mL / min
초음파 체 쉐이커N.A.N.A.

연락주세요! / 저희에게 물어보세요!

추가 정보 요청

Western Blots 전에 샘플 준비, 자세한 응용 프로토콜 및 가격을 위한 초음파 처리기에 대한 추가 정보를 요청하려면 아래 양식을 사용하십시오. 우리는 당신과 함께 샘플 준비 과정을 논의하고 당신에게 당신의 요구 사항을 충족 초음파 시스템을 제공하게되어 기쁩니다!









주의 하시기 바랍니다 개인 정보 정책.


마이크로플레이트, 멀티웰 플레이트, PCR 플레이트 및 96웰 플레이트는 UIP400MTP 플레이트 초음파 처리기를 사용하여 편안하고 균일하게 초음파 처리할 수 있습니다

UIP400MTP 플레이트 초음파 처리기 96웰 플레이트의 고처리량 초음파 처리를 위해



웨스턴 블 롯팅에 대하여

블롯은 DNA, RNA 및 단백질이 분리 될 수 있도록 캐리어에 옮겨지는 분석 과정입니다.
Southern blot은 DNA의 검출, RNA의 Northern blot, 단백질의 Western blot을 위해 사용됩니다.
웨스턴 블 랏팅 (Western blotting)은 항체가 항원을 특이 적으로 검출하기 위해 단백질 면역 블로 팅 (protein immunoblotting)이라고도 불립니다. 웨스턴 블 랏팅은 샘플에서 특정 단백질을 검출하는 가장 중요한 분석 방법 중 하나입니다. Western blot에서 단백질은 막에 고정화되어 단일 클론 항체 또는 다 클론 항체를 사용하여 막을 검출합니다.
SDS- 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 천연 단백질은 폴리 펩타이드의 길이에 의해 3 차원 구조 또는 변성 된 단백질에 의해 분리된다. 그런 다음 단백질은 막 (일반적으로 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF)으로 옮겨지고 대상 단백질에 특이적인 항체로 염색됩니다. 겔 전기 영동 단계는 항체의 교차 반응성 문제를 해결하기 위해 웨스턴 블랏 분석에 포함됩니다.
그 후에, 분리 된 단백질은 항체로 염색되는 매트릭스 (주로 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인) 상에 흡착된다. 항체는 프로브로서 기능하고 표적 단백질에 특이 적으로 선택된다. 특정 반응의 위치 및 강도의 분석은 주어진 샘플에서 표적 단백질의 발현 세부 사항을 나타낸다. 웨스턴 블 랏팅은 젤 전기 영동의 높은 분해능과 면역 특이성의 강한 특이성 및 높은 민감성으로 인해 1ng 정도의 낮은 목표 단백질을 검출 할 수있었습니다. Western blot 방법은 분자 생물학, 생화학, 면역 유전학 및 기타 분자 연구 분야에서 사용됩니다.
다른 관련 기술로는 도트 블랏 분석, 면역 조직 화학 및 면역 세포 화학 법, 항체가 면역 염색에 의한 조직 및 세포의 단백질 검출에 사용되는 방법, 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)이 있습니다.


문학 / 참고 문헌

VialTweeter 설정 완료 : VialTweeter 초음파 처리기에서 초음파 처리 UP200St

VialTweeter 초음파 처리기 여러 바이알의 동시 시료 전처리용

연락주세요! / 저희에게 물어보세요!





주의 하시기 바랍니다 개인 정보 정책.


초음파 처리는 시료 준비 중 중요한 단계입니다.

샘플 초음파 처리를위한 마이크로 팁이 달린 UP200St

우리는 당신의 과정을 논의하는 것을 기쁘게 생각합니다.

연락합시다.