서양 블 럿팅을위한 초음파 용해

• 웨스턴 블랏은 조직 균질 액 또는 세포 추출물의 샘플에서 특정 단백질을 검출하기위한 분석 절차입니다.
• 웨스턴 블 롯을 실행하거나 효소 활성을 측정하기 위해 많은 분석법에서 세포에 포집 된 물질 (예 : 단백질, DNA, 세포 내 파편)에 접근해야합니다.
• Sonication은 제어 및 세포 분열 및 용해를위한 신뢰할 수 있고 다루기 쉬운 방법입니다.

초음파 세포 파괴

조직 및 배양 된 세포에서 단백질 추출은 많은 생물학적, 생화학 및 분석 기술 (PAGE, Western blotting, ELISA, 질량 분광법 등) 또는 단백질 정제를위한 첫 번째 단계입니다. 단백질 수율을 높이려면 세포 물질과 조직을 효율적으로 파쇄 / 용해해야합니다. 식물 세포 또는 동물 조직이든, 초음파 처리는 세포 용해를 쉽고 빠르게 준비하는 방법입니다.

Sonication의 장점

• 빠른 & 실력 있는
• 쉬운 조작
• 고 단백질 수율
• 재현성 / 반복성
• 정밀하게 제어되는
• 확장 성있는

Western Immunoblotting을위한 면역 침전 프로토콜

A. 시약

용액을 준비 할 때는 Milli-Q와 같은 정제수를 사용하십시오.

• 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)
• 1X 세포 용해 완충액 : 20mM 트리스 (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1 % 트리톤 X-100, 2.5mM 피로 인산 나트륨, 1mM β- 글리세로 포스페이트, 1mM Na3VO4, 1㎍ / ml Leupeptin
  중요 : 사용 직전에 1 mM PMSF를 첨가하십시오.
• 15 μl Protein A + 15 μl Protein G가 IP에는 충분하지만 일차 항체와 샘플 용량에 따라 다를 수 있습니다. 미리 혼합 된 단백질 A / G 아가로 오스 (예 : 토끼 IgG 풀다운을위한 단백질 A 및 마우스 IgG 풀다운을위한 단백질 G)
• 3X SDS 시료 완충액 : 187.5 mM Tris-HCl (25 ℃에서 pH 6.8), 6 % w / v SDS, 30 % 글리세롤, 150 mM DTT, 0.03 % w / v 브로 모 페놀 블루

B. 세포 용해 액의 제조

• 세포 수확. nondenaturing 조건에서 세포를 수확하기 위해, 미디어를 제거하고 얼음으로 차가운 PBS로 한 번 세포를 씻어.
• PBS를 제거하고 각 접시 (10cm) 0.5 ML 얼음처럼 차가운 1X 세포 용해 버퍼를 추가하고 얼음에 판을 5 분 품어.
• 플레이트에서 세포를 긁어 내고 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 얼음에 붙어.
• 얼음 - 차가운 면역 침전 완충액 (IP 완충액 : 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1 % NP-40 및 프로테아제 억제제 혼합물)에서 10 초 동안 2 회 초음파 세정한다. 초음파 처리를 위해 유리 병 또는 프로브 초음파 발생기 (예 : UP100H 또는 UP200Ht 가장 적합합니다.
• 4 ° C에서 10 분 동안 15,000 g에서 lysate를 원심 분리하십시오.
• 상층 액을 새 튜브로 옮긴다. (필요하다면 lysate는 -80 ° C에 보관할 수 있습니다.)
• 뜨는에 일차 항체를 추가합니다. 일차 항체와 뜨는은 가벼운 교반하에 4 ° C에서 1 시간 incubated 있습니다. 일차 항체는 전형적으로 웨스턴 블 랏팅에 사용되는 양보다 10 배 더 농축 된 양으로 첨가된다. (100μL 당 1μg부터 시작할 수 있습니다.)
• 상등액을 같은 양의 Protein A-agarose (Invitrogen)와 Protein G 아가로 오스의 혼합물과 함께 1 시간 더 배양한다.
• IP 버퍼로 아가로 오스 알약을 세 번 씻으십시오. 그런 다음 95 ° C에서 5 분간 가열하여 SDS-PAGE 로딩 완충액으로 결합 된 단백질을 추출합니다.

C. 면역 침전

• 200 μl 세포 lysate을 가지고 일차 항체를 추가합니다. 4 ° C에서 온화한 로킹으로 밤새 품을 수 있습니다.
• 단백질 A 또는 G 아가로 오스 비드 (50 % 비드 슬러리 20 μl)를 첨가하십시오. 4 ° C에서 1 ~ 3 시간 부드럽게 흔들어주십시오.
• 4 ℃에서 30 초 동안 Microcentrifuge. 1X 세포 용해 버퍼 500 μl로 펠렛을 5 번 씻으십시오. 세척 중에 얼음을 계속하십시오.
• 20 μl 3X SDS 샘플 버퍼와 쥐똥을 Resuspend. 소용돌이 치고 나서 30 초 동안 미세 원심 분리하십시오.
• 샘플을 95 ~ 100 ℃로 2 ~ 5 분간 가열하고 1 분간 14,000 X g으로 미세 원심 분리기에 넣습니다.
• SDS-PAGE 젤 (12-15 %)에 샘플 (15-30 μl)을로드하십시오.
• Western blotting으로 시료를 분석한다.

ultrasonicator UP50H로 Western Blot 분석

다음의 프로토콜은 Kriebisch et al. (2011) :
총 단백질은 1,25 (OH)로 처리 된 MC3T3-E1 세포로부터 분리하였고,₂디_삼 (10^-8 M) 또는 차량. 세포를 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich)을 함유하는 완충액으로 용해시켰다; 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) (Fisher Scientific); 1 % IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) 및 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 (Merck). 세포 용 해물을 사이클 1 및 진폭 80에서 2 x 10 s 동안 UP50H 초음파 프로세서 (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germany). 그 후, 물질을 14,000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하고, 상등액을 웨스턴 블 랏팅에 사용 하였다. 샘플 완충액 및 환원제 (Invitrogen)에서 단백질 25 μg을 끓인 후 4-12 % 폴리 아크릴 아미드 겔 (Invitrogen)을 사용하여 SDS-PAGE로 분리하고 니트로 셀룰로오스 막 (GE 건강 관리)으로 옮겼다. 막을 1 % 카세인 (Sigma-Aldrich) 및 1 % Tris (1M)를 함유하는 TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl)로 1 시간 동안 차단시켰다. 차단 후, 막을 1 차 항체 (토끼 항 인간 CBS 1/500, R. Banerjee 교수, 미국 미시건 주 Ann Arbor 소재 연구소에서 개발)와 함께 4 ℃에서 밤새 교반하면서 항온 배양 하였다. 와사비니 퍼 옥시다아제 (HPR) - 접합 된 2 차 항체 (Dako)와의 배양을 실온에서 1 시간 동안 수행 하였다. 모든 도말은 향상된 화학 발광 (Perkin Elmer)에 의해 개발되었습니다.

문학 / 참고 문헌