Hielscher 초음파 기술

서양 블 럿팅을위한 초음파 용해

  • 웨스턴 블랏은 조직 균질 액 또는 세포 추출물의 샘플에서 특정 단백질을 검출하기위한 분석 절차입니다.
  • 웨스턴 블 롯을 실행하거나 효소 활성을 측정하기 위해 많은 분석법에서 세포에 포집 된 물질 (예 : 단백질, DNA, 세포 내 파편)에 접근해야합니다.
  • Sonication은 제어 및 세포 분열 및 용해를위한 신뢰할 수 있고 다루기 쉬운 방법입니다.

초음파 세포 파괴

조직 및 배양 된 세포에서 단백질 추출은 많은 생물학적, 생화학 및 분석 기술 (PAGE, Western blotting, ELISA, 질량 분광법 등) 또는 단백질 정제를위한 첫 번째 단계입니다. 단백질 수율을 높이려면 세포 물질과 조직을 효율적으로 파쇄 / 용해해야합니다. 식물 세포 또는 동물 조직이든, 초음파 처리는 세포 용해를 쉽고 빠르게 준비하는 방법입니다.

Sonication의 장점

  • 빠른 & 실력 있는
  • 쉬운 조작
  • 고 단백질 수율
  • 재현성 / 반복성
  • 정밀하게 제어되는
  • 확장 성있는

Western Immunoblotting을위한 면역 침전 프로토콜

A. 시약

용액을 준비 할 때는 Milli-Q와 같은 정제수를 사용하십시오.

  • 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)
  • 1X 세포 용해 완충액 : 20mM 트리스 (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1 % 트리톤 X-100, 2.5mM 피로 인산 나트륨, 1mM β- 글리세로 포스페이트, 1mM Na3VO4, 1㎍ / ml Leupeptin
    중요 : 사용 직전에 1 mM PMSF를 첨가하십시오.
  • 15 μl Protein A + 15 μl Protein G가 IP에는 충분하지만 일차 항체와 샘플 용량에 따라 다를 수 있습니다. 미리 혼합 된 단백질 A / G 아가로 오스 (예 : 토끼 IgG 풀다운을위한 단백질 A 및 마우스 IgG 풀다운을위한 단백질 G)
  • 3X SDS 시료 완충액 : 187.5 mM Tris-HCl (25 ℃에서 pH 6.8), 6 % w / v SDS, 30 % 글리세롤, 150 mM DTT, 0.03 % w / v 브로 모 페놀 블루
Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

유리 병 초음파 시료 준비 용

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초음파 처리는 시료 준비 중 중요한 단계입니다.

샘플 초음파 처리를위한 마이크로 팁이 달린 UP200St

B. 세포 용해 액의 제조

  • 세포 수확. nondenaturing 조건에서 세포를 수확하기 위해, 미디어를 제거하고 얼음으로 차가운 PBS로 한 번 세포를 씻어.
  • PBS를 제거하고 각 접시 (10cm) 0.5 ML 얼음처럼 차가운 1X 세포 용해 버퍼를 추가하고 얼음에 판을 5 분 품어.
  • 플레이트에서 세포를 긁어 내고 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 얼음에 붙어.
  • 얼음 - 차가운 면역 침전 완충액 (IP 완충액 : 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1 % NP-40 및 프로테아제 억제제 혼합물)에서 10 초 동안 2 회 초음파 세정한다. 초음파 처리를 위해 유리 병 또는 프로브 초음파 발생기 (예 : UP100H 또는 UP200Ht 가장 적합합니다.
  • 4 ° C에서 10 분 동안 15,000 g에서 lysate를 원심 분리하십시오.
  • 상층 액을 새 튜브로 옮긴다. (필요하다면 lysate는 -80 ° C에 보관할 수 있습니다.)
  • 뜨는에 일차 항체를 추가합니다. 일차 항체와 뜨는은 가벼운 교반하에 4 ° C에서 1 시간 incubated 있습니다. 일차 항체는 전형적으로 웨스턴 블 랏팅에 사용되는 양보다 10 배 더 농축 된 양으로 첨가된다. (100μL 당 1μg부터 시작할 수 있습니다.)
  • 상등액을 같은 양의 Protein A-agarose (Invitrogen)와 Protein G 아가로 오스의 혼합물과 함께 1 시간 더 배양한다.
  • IP 버퍼로 아가로 오스 알약을 세 번 씻으십시오. 그런 다음 95 ° C에서 5 분간 가열하여 SDS-PAGE 로딩 완충액으로 결합 된 단백질을 추출합니다.

C. 면역 침전

  • 200 μl 세포 lysate을 가지고 일차 항체를 추가합니다. 4 ° C에서 온화한 로킹으로 밤새 품을 수 있습니다.
  • 단백질 A 또는 G 아가로 오스 비드 (50 % 비드 슬러리 20 μl)를 첨가하십시오. 4 ° C에서 1 ~ 3 시간 부드럽게 흔들어주십시오.
  • 4 ℃에서 30 초 동안 Microcentrifuge. 1X 세포 용해 버퍼 500 μl로 펠렛을 5 번 씻으십시오. 세척 중에 얼음을 계속하십시오.
  • 20 μl 3X SDS 샘플 버퍼와 쥐똥을 Resuspend. 소용돌이 치고 나서 30 초 동안 미세 원심 분리하십시오.
  • 샘플을 95 ~ 100 ℃로 2 ~ 5 분간 가열하고 1 분간 14,000 X g으로 미세 원심 분리기에 넣습니다.
  • SDS-PAGE 젤 (12-15 %)에 샘플 (15-30 μl)을로드하십시오.
  • Western blotting으로 시료를 분석한다.

문의 / 추가 정보 요청

귀하의 처리 요구 사항에 대해 우리에게 이야기하십시오. 우리는 당신의 프로젝트에 가장 적합한 설정 및 처리 매개 변수를 권장합니다.





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더 많은 초음파 프로토콜

ultrasonicator UP50H로 Western Blot 분석

다음의 프로토콜은 Kriebisch et al. (2011) :
총 단백질은 1,25 (OH)로 처리 된 MC3T3-E1 세포로부터 분리하였고,2 (10-8 M) 또는 차량. 세포를 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich)을 함유하는 완충액으로 용해시켰다; 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) (Fisher Scientific); 1 % IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) 및 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 (Merck). 세포 용 해물을 사이클 1 및 진폭 80에서 2 x 10 s 동안 UP50H 초음파 프로세서 (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germany). 그 후, 물질을 14,000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하고, 상등액을 웨스턴 블 랏팅에 사용 하였다. 샘플 완충액 및 환원제 (Invitrogen)에서 단백질 25 μg을 끓인 후 4-12 % 폴리 아크릴 아미드 겔 (Invitrogen)을 사용하여 SDS-PAGE로 분리하고 니트로 셀룰로오스 막 (GE 건강 관리)으로 옮겼다. 막을 1 % 카세인 (Sigma-Aldrich) 및 1 % Tris (1M)를 함유하는 TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl)로 1 시간 동안 차단시켰다. 차단 후, 막을 1 차 항체 (토끼 항 인간 CBS 1/500, R. Banerjee 교수, 미국 미시건 주 Ann Arbor 소재 연구소에서 개발)와 함께 4 ℃에서 밤새 교반하면서 항온 배양 하였다. 와사비니 퍼 옥시다아제 (HPR) - 접합 된 2 차 항체 (Dako)와의 배양을 실온에서 1 시간 동안 수행 하였다. 모든 도말은 향상된 화학 발광 (Perkin Elmer)에 의해 개발되었습니다.

문학 / 참고 문헌



웨스턴 블 롯팅에 대하여

블롯은 DNA, RNA 및 단백질이 분리 될 수 있도록 캐리어에 옮겨지는 분석 과정입니다.
Southern blot은 DNA의 검출, RNA의 Northern blot, 단백질의 Western blot을 위해 사용됩니다.
웨스턴 블 랏팅 (Western blotting)은 항체가 항원을 특이 적으로 검출하기 위해 단백질 면역 블로 팅 (protein immunoblotting)이라고도 불립니다. 웨스턴 블 랏팅은 샘플에서 특정 단백질을 검출하는 가장 중요한 분석 방법 중 하나입니다. Western blot에서 단백질은 막에 고정화되어 단일 클론 항체 또는 다 클론 항체를 사용하여 막을 검출합니다.
SDS- 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 천연 단백질은 폴리 펩타이드의 길이에 의해 3 차원 구조 또는 변성 된 단백질에 의해 분리된다. 그런 다음 단백질은 막 (일반적으로 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF)으로 옮겨지고 대상 단백질에 특이적인 항체로 염색됩니다. 겔 전기 영동 단계는 항체의 교차 반응성 문제를 해결하기 위해 웨스턴 블랏 분석에 포함됩니다.
그 후에, 분리 된 단백질은 항체로 염색되는 매트릭스 (주로 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인) 상에 흡착된다. 항체는 프로브로서 기능하고 표적 단백질에 특이 적으로 선택된다. 특정 반응의 위치 및 강도의 분석은 주어진 샘플에서 표적 단백질의 발현 세부 사항을 나타낸다. 웨스턴 블 랏팅은 젤 전기 영동의 높은 분해능과 면역 특이성의 강한 특이성 및 높은 민감성으로 인해 1ng 정도의 낮은 목표 단백질을 검출 할 수있었습니다. Western blot 방법은 분자 생물학, 생화학, 면역 유전학 및 기타 분자 연구 분야에서 사용됩니다.
다른 관련 기술로는 도트 블랏 분석, 면역 조직 화학 및 면역 세포 화학 법, 항체가 면역 염색에 의한 조직 및 세포의 단백질 검출에 사용되는 방법, 효소 결합 면역 흡착 분석법 (ELISA)이 있습니다.