웨스턴 블로팅을 위한 초음파 세포 용해

• 웨스턴 블롯은 조직 균질액이나 세포 추출물 시료에서 특정 단백질을 검출하기 위한 분석 절차입니다.
• 웨스턴 블롯을 수행하거나 효소 활성을 측정하려면 많은 분석법에서 세포 내부에 갇혀 있는 물질(예: 단백질, DNA, 세포 내 소기관 조각)에 접근해야 합니다.
• 초음파 처리는 세포 파쇄와 세포 용해를 제어할 수 있는 신뢰성 높고 다루기 쉬운 방법입니다.

초음파 세포 파쇄

조직과 배양 세포에서 단백질을 추출하는 것은 여러 생물학적, 생화학적 및 분석 기법(PAGE, 웨스턴 블로팅, ELISA, 질량 분석법 등)이나 단백질 정제의 첫 단계입니다. 높은 단백질 수율을 얻으려면 세포 물질과 조직을 효율적으로 파쇄/용해해야 합니다. 식물 세포든 동물 조직이든 초음파 처리는 세포 용해액을 쉽고 빠르게 준비할 수 있는 방법입니다.

초음파 처리의 장점

• 빠르고 효율적
• 쉬운 조작
• 높은 단백질 수율
• 재현성/반복성
• 정밀한 제어
• 규모 확장 가능

웨스턴 면역블로팅을 위한 면역침강 프로토콜

A. 시약

용액을 준비할 때는 Milli-Q와 같은 정제수를 사용합니다.

• 1X 인산 완충 식염수(PBS)
• 1X 세포 용해 완충액: 20 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM 피로인산나트륨, 1 mM β-글리세로인산, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml 류펩틴
  중요: 사용 직전에 1 mM PMSF를 첨가합니다.
• 15 μl 단백질 A+15 μl 단백질 G는 IP에 충분하지만, 일차 항체와 시료 부피에 따라 달라질 수 있습니다. 미리 혼합된 단백질 A/G 아가로스도 사용할 수 있습니다(예: 토끼 IgG 풀다운에는 단백질 A, 마우스 IgG 풀다운에는 단백질 G).
• 3X SDS 시료 완충액: 187.5 mM Tris-HCl(25°C에서 pH 6.8), 6% w/v SDS, 30% 글리세롤, 150 mM DTT, 0.03% w/v 브로모페놀 블루

B. 세포 용해액 준비

• 세포를 수확합니다. 비변성 조건에서 세포를 수확하려면 배지를 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 한 번 세척합니다.
• PBS를 제거하고 각 플레이트(10 cm)에 얼음처럼 차가운 1X 세포 용해 완충액 0.5 ml를 첨가한 뒤, 플레이트를 얼음 위에서 5분간 배양합니다.
• 플레이트에서 세포를 긁어내어 미세원심분리 튜브로 옮깁니다. 얼음 위에 보관합니다.
• 10초씩 두 번 초음파 처리할 때는 얼음처럼 차가운 면역침강 완충액(IP 완충액: 50 mM Tris-HCl [pH 7.4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40 및 단백질분해효소 억제제 혼합물)을 사용합니다. 초음파 처리에는 VialTweeter 또는 UP100H 또는 UP200Ht 와 같은 프로브형 초음파 처리기가 가장 적합합니다.
• 세포 용해액을 4°C에서 15,000 g로 10분간 원심분리합니다.
• 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. (필요한 경우 세포 용해액을 –80°C에서 보관할 수 있습니다.)
• 상층액에 일차 항체를 첨가합니다. 일차 항체가 첨가된 상층액을 가볍게 교반하면서 4°C에서 1 h 동안 배양합니다. 일차 항체는 일반적으로 웨스턴 블로팅에 사용하는 농도보다 10x 높은 농도가 되도록 첨가합니다. (100μL당 1μg으로 시작할 수 있습니다.)
• 그런 다음 상층액에 동일한 양의 단백질 A-아가로스(Invitrogen)와 단백질 G 아가로스의 혼합물을 넣고 추가로 1 h 동안 배양합니다.
• 아가로스 펠릿을 IP 완충액으로 세 번 세척합니다. 그런 다음 SDS-PAGE 로딩 완충액을 넣고 95°C에서 5분간 가열하여 결합된 단백질을 추출합니다.

C. 면역침강

• 세포 용해액 200 μl를 취하고 일차 항체를 첨가합니다. 부드럽게 흔들면서 4°C에서 밤새 배양합니다.
• 단백질 A 또는 G 아가로스 비드(50% 비드 슬러리 20 μl)를 첨가합니다. 부드럽게 흔들면서 4°C에서 1–3시간 동안 배양합니다.
• 4°C에서 30초간 미세원심분리합니다. 1X 세포 용해 완충액 500 µl로 펠릿을 다섯 번 세척합니다. 세척 중에는 얼음 위에 둡니다.
• 3X SDS 시료 완충액 20 μl로 펠릿을 재현탁합니다. 볼텍스 혼합 후 30초간 미세원심분리합니다.
• 시료를 95–100°C로 2–5분간 가열하고 14,000 X g에서 1분간 미세원심분리합니다.
• 시료(15–30 μl)를 SDS-PAGE 겔(12–15%)에 로딩합니다.
• 웨스턴 블로팅으로 시료를 분석합니다.

UP50H 초음파 처리기를 이용한 웨스턴 블롯 분석

프로브형 초음파 처리기 UP50H를 사용하는 다음 프로토콜은 Kriebisch 등의 연구(2011)에 사용되었습니다.
MC3T3-E1 세포를 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) 또는 용매 대조군으로 처리한 후 총 단백질을 분리하였습니다. 세포는 50 mM Tris HCl, pH 8(Sigma-Aldrich), 150 mM NaCl(Fisher Scientific), 0.1% 도데실황산나트륨(SDS)(Fisher Scientific), 1% IGEPAL CA-630(Sigma-Aldrich) 및 0.5% 데옥시콜산나트륨(Merck)을 함유한 완충액으로 용해하였습니다. 세포 용해액은 사이클 1, 진폭 80에서 2 × 10 s 동안 UP50H 초음파 프로세서 (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germany)를 사용하여 초음파 처리하였습니다. 이후 시료를 14,000 rpm에서 10 min 동안 원심분리하고 상층액을 웨스턴 블로팅에 사용하였습니다. 단백질 이십오 μg을 시료 완충액 및 환원제(Invitrogen)와 함께 끓인 후, 4–12% 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen)을 사용하는 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로스 막(GE health care)으로 전이하였습니다. 막은 1% 카세인(Sigma-Aldrich)과 1% Tris(1 M)를 함유한 TBS(10 mM Tris-HCl; pH 7.6; 150 mM NaCl)로 1 h 동안 블로킹하였습니다. 블로킹 후 막을 일차 항체(토끼 유래 항인간 CBS 항체 1/500, 미국 미시간주 앤아버 소재 R. Banerjee 교수 연구실에서 개발)와 함께 4°C에서 밤새 가볍게 교반하면서 배양하였습니다. 서양고추냉이 과산화효소(HPR)가 접합된 이차 항체(Dako)와의 반응은 실온에서 1 h 동안 수행하였습니다. 모든 블롯은 증강 화학발광법(Perkin Elmer)으로 발색하였습니다.
 

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아래 표는 당사 실험실용 초음파 처리기의 대략적인 처리 용량을 보여줍니다.

문헌 / 참고문헌

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.