Western Blotting을 위한 초음파 용해

• 웨스턴 블랏은 조직 균질화 또는 세포 추출물 샘플에서 특정 단백질을 검출하기 위한 분석 절차입니다.
• 웨스턴 블롯을 실행하거나 효소 활성을 측정하기 위해 많은 분석법은 세포에 갇힌 물질(예: 단백질, DNA, 세포 내 단편)에 접근해야 합니다.
• 초음파 처리는 제어 된 세포 파괴 및 용해를위한 신뢰할 수 있고 다루기 쉬운 방법입니다.

초음파 세포 파괴

조직 및 배양된 세포에서 단백질을 추출하는 것은 많은 생물학적, 생화학적 및 분석 기술(PAGE, 웨스턴 블로팅, ELISA, 질량 분석법 등) 또는 단백질 정제의 첫 번째 단계입니다. 높은 단백질 수율을 얻으려면 세포 물질과 조직을 효율적으로 파괴/용해해야 합니다. 식물 세포든 동물 조직이든 초음파 처리는 세포 용해물을 쉽고 빠르게 준비하는 방법입니다.

Sonication의 장점

• 빠른 & 능률적인
• 쉬운 조작
• 높은 단백질 수율
• 재현 가능/반복 가능
• 정밀하게 제어됨
• 확장성

Western Immunoblotting을 위한 면역침전 프로토콜

A. 시약

용액을 준비하려면 Milli-Q와 같은 정제수를 사용하십시오.

• 1X 인산염 완충 식염수(PBS)
• 1X 세포 용해 완충액: 20mM Tris(pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5mM 피로인산나트륨, 1mM β-글리세로인산염, 1mM Na3VO4, 1μg/ml 루펩틴
  중요: 사용 직전에 1mM PMSF를 추가하십시오.
• 15 μl 단백질 A+15 μl 단백질 G는 IP에 충분하지만 1차 항체 및 시료 부피에 따라 달라질 수 있습니다. 사전 혼합 단백질 A/G 아가로스를 사용할 수도 있습니다(예: 토끼용 단백질 A, IgG 풀다운, 마우스 IgG 풀다운용 단백질 G).
• 3X SDS 샘플 버퍼 : 187.5 mM Tris-HCl (25 ° C에서 pH 6.8), 6 % w / v SDS, 30 % 글리세롤, 150 mM DTT, 0.03 % w / v 브로 모 페놀 블루

B. 세포 용해물의 준비

• 세포를 채취합니다. 비변성 조건에서 세포를 채취하려면 배지를 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 한 번 헹굽니다.
• PBS를 제거하고 각 플레이트(10cm)에 얼음처럼 차가운 1X 세포 용해 완충액 0.5ml를 추가하고 플레이트를 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
• 플레이트에서 세포를 긁어내고 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 얼음 위에 두십시오.
• 얼음처럼 차가운 면역침전 완충액(IP 완충액: 50mM Tris-HCl[pH 7.4], 150mM NaCl, 5mM EDTA, 0.1% NP-40 및 프로테아제 억제제 혼합물)에서 10초 동안 두 번 초음파 처리합니다. 초음파 처리의 경우 바이알트위터 또는 프로브 초음파기와 같은 업100H 또는 UP200HT 가장 적합합니다.
• 15,000g에서 용해물을 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
• 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. (필요한 경우 용해물을 -80°C에서 보관할 수 있습니다.)
• 상층액에 1차 항체를 추가합니다. 1차 항체가 있는 상층액을 광 교반 하에 4°C에서 1시간 동안 배양합니다. 1차 항체는 일반적으로 웨스턴 블로팅에 사용되는 것보다 10배 더 농축된 양으로 추가됩니다. (100μL당 1μg부터 시작할 수 있습니다.)
• 그런 다음 상층액을 동일한 양의 단백질 A-아가로스(Invitrogen)와 단백질 G 아가로스의 혼합물로 1시간 더 배양합니다.
• IP 버퍼로 아가로스 펠릿을 세 번 세척합니다. 그 후, 95°C에서 5분 동안 가열하여 SDS-PAGE 로딩 버퍼로 결합된 단백질을 추출합니다.

C. 면역침전

• 200 μl 세포 용해물을 취하고 1 차 항체를 추가하십시오. 4°C에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.
• 단백질 A 또는 G 아가로스 비드(50% 비드 슬러리 20μl)를 추가합니다. 4°C에서 1-3시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.
• 4°C에서 30초 동안 마이크로 원심분리기. 500 μl의 1X 세포 용해 완충액으로 펠릿을 5회 세척합니다. 세탁하는 동안 얼음에 보관하십시오.
• 20 μl 3X SDS 샘플 버퍼로 펠릿을 재현탁시킵니다. 소용돌이를 일으킨 다음 30초 동안 미세 원심분리기를 사용합니다.
• 샘플을 95-100°C로 2-5분 동안 가열하고 미세 원심분리기를 14,000 X g에서 1분 동안 가열합니다.
• 샘플(15–30 μl)을 SDS-PAGE 겔(12–15%)에 로드합니다.
• 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 시료를 분석합니다.

Sonicator UP50H를 사용한 웨스턴 블랏 분석

프로브 형 초음파 발생기 UP50H를 사용하는 다음 프로토콜은 Kriebisch et al. (2011)의 연구에서 사용되었습니다.
총 단백질은 1,25(OH)로 처리된 MC3T3-E1 세포에서 분리하였다.₂d₃ (10⁻⁸ M) 또는 차량. 세포를 50mM Tris HCl, pH 8(Sigma-Aldrich)을 함유하는 완충액으로 용해시켰다. 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630(Sigma-Aldrich) 및 0.5% 데옥시콜산나트륨(Merck). 세포 용해물을 사이클 1에서 2 × 10 초 동안 초음파 처리하고 진폭 80을 사용하여 UP50H 초음파 프로세서 (Hielscher, 초음파 기술, Teltow, 독일). 그 후, 물질을 14,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 웨스턴 블로팅에 사용하였다. 25 μg의 단백질을 샘플 완충액 및 환원제(Invitrogen)에서 끓인 후 4–12% 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen)을 사용하여 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스 막(GE health care)으로 옮겼습니다. 멤브레인을 1% 카제인(Sigma-Aldrich) 및 1% Tris(1M)를 함유하는 TBS(10mM Tris-HCl; pH 7.6; 150mM NaCl)로 1시간 동안 차단했습니다. 차단 후, 멤브레인을 1차 항체(토끼 항인간 CBS 1/500, 미국 미시건주 앤아버 R. Banerjee 교수의 실험실에서 개발)로 4°C에서 밤새 약간의 교반으로 배양했습니다. 양고추냉이 과산화효소(HPR)-접합 2차 항체(Dako)로 배양하여 실온에서 1시간 동안 수행했습니다. 모든 블롯은 향상된 화학발광(Perkin Elmer)에 의해 개발되었습니다.
 

초음파 세포 용해 및 추출을 위한 모범 사례, 용해물 준비 및 공정 개선을 위한 권장 사항에 대해 자세히 알아보려면 여기를 클릭하십시오!
 
아래 표는 실험실 크기의 초음파기의 대략적인 처리 용량을 나타냅니다.

문헌 / 참고문헌