조직 및 세포 배양물에서의 초음파 단백질 추출
- 단백질 추출은 단백질체학에서 필수적인 시료 전처리 단계입니다.
- 단백질은 식물 및 동물 조직, 효모와 미생물에서 추출할 수 있습니다.
- 초음파 처리는 짧은 추출 시간 내에 높은 단백질 수율을 제공하는 신뢰할 수 있고 효율적인 단백질 추출 방법입니다.
조직 및 세포에서의 단백질 추출
조직 및 배양 세포에서의 단백질 추출은 ELISA, PAGE, 웨스턴 블로팅, 질량 분석 또는 단백질 정제와 같은 다양한 생화학 및 분석 기법을 수행할 때 필수적인 시료 전처리 단계입니다. 초음파를 이용한 세포 파쇄, 세포 용해 및 추출은 높은 단백질 수율을 보장하기 위해 정밀하게 제어할 수 있는 비열적 기법입니다.
세포에서 단백질을 추출하는 데 사용하는 초음파 프로브 UP200St
- 신속한 처리
- 높은 수율
- 매우 높은 효율
- 매개변수의 정밀한 제어
- 재현 가능한 결과
- 선형 확장성
초음파 세포 용해 및 단백질 추출을 위한 일반 지침
- 온도 제어: 열변성 없이 높은 단백질 수율을 확보하려면 추출 중 온도를 제어해야 합니다. 초음파 파쇄기 또는 초음파 처리기라고도 하는 Hielscher의 최첨단 초음파 균질기는 정밀하게 제어할 수 있습니다. 이 장비에는 연결식 온도 센서가 제공됩니다. 초음파 균질기의 설정 옵션에서 최대 온도를 설정할 수 있습니다. 이 최대 온도에 도달하면 초음파 처리기는 시료가 식을 때까지 자동으로 작동을 멈춥니다.
- 완충액: 적합한 완충액의 선택과 적정 완충액 부피는 조직마다 다르므로 시행착오 실험을 통해 결정해야 합니다.
- 분리 / 정제: 단백질 용해물에는 DNA나 탄수화물과 같은 생체분자가 과도하게 포함될 수 있으며, 이러한 생체분자는 단백질 침전(데옥시콜레이트–트리클로로아세트산) 또는 완충액 교환으로 제거할 수 있습니다.
Chittapalo와 Noomhorm (2009)은 연구에서 초음파 처리를 사용하면 단백질 수율이 증가하고, 초음파 조직 균질화 및 세포 용해 공정이 기존 추출 공정을 크게 개선하여 새로운 상업적 추출 기회를 열 수 있다고 보고했습니다.
초음파 CupHorn 은 단백질 분리 및 DNA 단편화를 위해 동일한 조건에서 여러 시료를 동시에 매우 효과적으로 전처리하는 데 사용됩니다.
동물 조직에서의 단백질 추출
온전한 크기의 조직(예: 신장, 심장, 폐, 근육 등)을 전처리하려면 단백질분해효소에 의한 분해를 방지하기 위해 깨끗한 도구로 조직을 아주 작은 조각으로 절단해야 하며, 가급적 얼음 위에서 가능한 한 신속하게 작업해야 합니다(예: RIPA와 같은 세포 용해 완충액 또는 단백질분해효소 및 인산가수분해효소 억제제 혼합물이 포함된 저장성 세포 용해 완충액). 절단 후 시료를 액체 질소에 담가 급속 동결합니다. 시료는 나중에 사용하기 위해 -80°C에서 보관하거나 즉시 균질화하기 위해 얼음 위에 둘 수 있습니다. 초음파 추출 직전에 얼음처럼 차가운 세포 용해 완충액(단백질분해효소 억제제인 DTT, 류펩틴 및 아프로티닌 포함)을 시료 튜브에 신속하게 첨가합니다(조직 ~10 mg당 약 ~600 μL의 완충액 권장). 시료 튜브당 약 20–60mg의 조직을 권장합니다.
초음파 균질화, 세포 용해 및 추출은 마이크로팁 소노트로드가 장착된 UP100H 또는 UP200Ht와 같은 초음파 균질기로 수행합니다. 초음파 처리 시간은 60–90 sec.이며, 초음파 주기 모드에서 15 sec. 동안 초음파를 처리하고 10 sec. 동안 휴지합니다. 시료는 항상 얼음 속에 유지해야 합니다.
초음파 균질화 / 추출 후 용해물을 27,000g에서 약 20 min. 동안 원심분리합니다. 이후 상층액을 회수하여 Pierce BCA 단백질 분석법과 같은 단백질 분석법으로 단백질 농도를 측정할 수 있도록 합니다.
혈청에서의 단백질 추출
혈청과 인산염 완충액을 균일하게 혼합하기 위해 초음파 세포 용해 전에 먼저 시료를 보텍싱합니다. 초음파 세포 용해를 위해 UP100H와 같은 실험실용 초음파 균질기로 시료를 20% 진폭에서 8회 주기로 초음파 처리하며, 각 주기는 5초 작동과 15초 정지로 구성됩니다. 시료의 과열과 열분해를 방지하기 위해 주기적으로 초음파 처리하고(펄스 모드) 시료를 얼음 위에 놓아 단백질을 추출합니다. 혈청에는 고분자량 단백질(알부민, α1-항트립신, 트랜스페린, 합토글로불린, 면역글로불린 G 및 면역글로불린 A 등)이 다량 함유되어 있으며, 이들은 IEF 중 저분자량 단백질의 분리를 방해하므로 제거용 컬럼을 사용하여 혈청에서 이들을 제거하는 것이 권장됩니다.
식물 조직에서 단백질 추출
이끼 등 신선하고 부드러운 식물 조직은 잘게 자른 시료를 세포 용해 완충액에 넣고 초음파 처리하는 것만으로 쉽게 파쇄할 수 있습니다. 종자, 전나무 잎 등 질기고 목질화된 식물 조직은 건조 상태로 분쇄해야 합니다. 일부 단단한 목질 식물 재료는 초음파 처리로 추출하기 전에 액체 질소에서 동결하고 분쇄해야 합니다. 식물 세포 배양 현탁액의 경우 세포 용해 완충액에서 30초에서 150초 동안 초음파 처리하면 대부분 충분합니다. 호박씨와 같이 더 질긴 재료는 아래에 설명된 것처럼 더 강한 초음파 처리가 필요합니다.
호박씨에서 알부민을 초음파로 추출하는 프로토콜
곱게 분쇄한 호박씨 분말에서 알부민을 초음파로 추출하기 위해 탈지 호박씨 분말 10 g과 용매로 사용할 탈이온수 100 mL를 250mL 유리 비커에 넣습니다. 단백질 추출은 두 단계로 이루어집니다. 먼저 시료는 소노트로드 S24d7이 장착된 프로브형 초음파 처리기 UP400St(400W, 24kHz)를 사용하여 초음파 처리합니다. 초음파 균질화 중에는 유리 비커를 냉수 욕조에 넣습니다. 초음파 처리기 UP400St의 연결식 온도 센서와 온도 제어 설정은 시료 온도가 항상 30°C 미만으로 유지되도록 합니다. 초음파 처리 중 정밀한 온도 제어로 알부민의 변성을 방지합니다. 두 번째로, 200 rpm의 속도와 30°C에서 믹서로 추출을 수행했습니다. 이후 비커를 항온 진탕기로 옮깁니다. 증류수로 투석하여 글로불린을 제거합니다. 글로불린을 제거한 후 알부민 프로파일을 확인하기 위해 단백질 추출물에서 시료를 채취할 수 있으며, 이어서 알부민 응고를 위해 0.1 M HCl을 사용하여 pI=3.0으로 조정합니다. 5000g, 20°C에서 원심분리하여 고체상을 분리하고 탈이온수에 다시 용해합니다. 알부민 농축물의 단백질 비율을 높이기 위해 알부민 응고를 두 번 수행합니다.
미강에서 단백질 농축물을 제조하기 위한 초음파 알칼리 단백질 추출은 초음파 처리가 기존 추출 방법에 비해 훨씬 짧은 추출 시간에 더 높은 단백질 수율을 제공함을 보여줍니다.
기능성 iNOS 효소를 위한 시료 준비 프로토콜
완전한 기능을 갖춘 iNOS 효소를 얻기 위해(예: 약물 스크리닝용) 다음 프로토콜이 권장됩니다. 세포 현탁액을 얼음 위에 놓고 UP100H를 사용하여 10µm 진폭에서 5초 초음파 처리와 얼음 위에서 25초 휴식으로 구성된 주기 모드로 초음파 처리해야 합니다. 이 절차를 약 3회 반복해야 합니다. 초음파 처리 주기 사이의 휴식 시간은 온도 상승을 줄여 변성 위험을 낮춥니다.
초음파 단백질 가용화
초음파 처리는 일반적으로 몇 시간이 걸리는 단백질 가용화 과정을 가속할 수 있습니다. 시료가 과열되지 않도록 하고 요소가 함유된 용액에서 단백질의 분해와 변형을 방지하려면 초음파를 한 번에 수 초보다 길게 가하지 않아야 합니다.
초음파 처리기 UP200Ht – 소량 시료의 초음파 처리를 위한 2mm 마이크로팁 S26d2 장착.
단백질 추출용 초음파 장비
Hielscher Ultrasonics는 세포, 조직, 박테리아, 미생물, 효모 및 포자의 파쇄를 위한 다양한 초음파 균질기를 제공합니다.
Hielscher 실험실용 초음파 처리기는 강력하고 작동이 간편합니다. 24/7 운전이 가능하도록 제작되었으며, 견고하고 효율적인 실험실용 및 탁상형 장치로 설계되었습니다. 모든 장치에서 에너지 출력과 진폭을 정밀하게 제어할 수 있습니다. 다양한 액세서리를 통해 구성 옵션을 더욱 확장할 수 있습니다. VialTweeter, UP200Ht, UP200St 및 UP400St와 같은 디지털 초음파 처리기에는 온도 제어 기능과 자동 데이터 기록용 SD 카드가 내장되어 있습니다.
여러 시료를 교차 오염 없이 동시에 간접적으로 초음파 처리할 수 있도록 VialTweeter 또는 초음파 CupHorn을 제공합니다.
아래 표에서 시료 전처리, 세포 파쇄 및 추출용 초음파 처리기를 한눈에 살펴볼 수 있습니다. 각 초음파 균질기에 대한 자세한 정보를 보려면 장치 유형을 클릭하십시오. 충분한 교육을 받고 오랜 경험을 쌓은 기술진이 시료 전처리에 가장 적합한 초음파 처리기를 선택하실 수 있도록 기꺼이 도와드리겠습니다!
| 배치 부피 | 유량 | 권장 장치 |
|---|---|---|
| 최대 10개의 바이알 또는 튜브 | n.a. | VialTweeter |
| 멀티웰 / 마이크로타이터 플레이트 | n.a. | UIP400MTP |
| 여러 튜브 / 용기 | n.a. | CupHorn |
| 1–500mL | 10–200mL/min | UP100H |
| 10–1000mL | 20–200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10–2000mL | 20–400mL/min | UP400St |
응용 분야, 재료 및 시료 부피에 따라 시료 전처리에 가장 적합한 구성을 추천해 드립니다. 지금 문의하십시오!
연락하십시오! / 문의하십시오!
Hielscher 디지털 초음파 처리기는 브라우저를 통한 원격 제어 기능과 내장 SD 카드에 데이터를 자동으로 기록하는 기능을 갖추고 있습니다.
VialTweeter 를 이용한 간접 초음파 처리.
알아두면 유용한 정보
단백질체학
단백질체학은 단백질과 단백질체를 연구하는 분야입니다. 단백질은 생물체 내에서 매우 다양한 생명 유지 기능을 수행합니다. 단백질체는 특정 시점에 유전체, 세포, 조직 또는 생물체에서 발현되는 단백질 전체를 뜻합니다. 단백질체는 시간과 세포 또는 생물체가 겪는 특정한 요구나 스트레스에 따라 달라집니다. 더 구체적으로는 정해진 조건에서 특정 시점에 특정 유형의 세포 또는 생물체에서 발현되는 단백질의 집합입니다. 이 용어는 단백질과 유전체를 뜻하는 영어 단어를 결합한 것입니다. 단백질체학은 단백질체를 연구하는 학문입니다.
단백질
단백질은 아미노산 잔기로 이루어진 하나 이상의 긴 사슬로 구성된 큰 생체분자로, 이른바 거대분자입니다. 단백질은 식물과 동물을 포함한 모든 생물체에 존재하며 대부분의 생물학적 기능에 필수적입니다. 단백질은 많은 생물학적 정보를 담고 있으므로 단백질체 연구와 같은 분석 목적으로 추출됩니다. 단백질이 수행하는 가장 중요한 기능에는 대사 반응의 촉매 작용, DNA 복제, 자극에 대한 반응, 한 위치에서 다른 위치로의 분자 수송이 포함됩니다. 단백질은 주로 아미노산 서열에서 서로 차이가 나며, 이 서열은 해당 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 의해 결정됩니다. 이 아미노산 서열에 따라 단백질은 일반적으로 그 활성을 결정하는 특정한 삼차원 구조로 접힙니다. 단백질은 펩타이드와 더불어 식품의 핵심 성분 중 하나입니다. 따라서 단백질체학은 식품 과학에서 공정, 식품 안전성 및 영양 평가를 최적화하는 강력한 도구입니다.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction 은 분석 대상 물질을 분리하고 사전 농축하는 분석 전 절차입니다. 초음파 처리와 결합하면 운점 추출을 강화하여 공정을 더 효율적이고 빠르며 환경친화적으로 만들 수 있습니다. 초음파 처리를 적용한 운점 추출은 분석 대상 물질의 전처리에 훨씬 더 효율적인 방법입니다. 초음파 보조 운점 추출에 대해 자세히 알아보십시오!
겔 전기영동
겔 전기영동은 DNA, RNA, 단백질과 같은 거대분자와 그 절편을 크기와 전하에 따라 분리하고 분석하는 주요 방법입니다. 임상화학에서는 전하 및/또는 크기에 따라 단백질을 분리하는 데 사용되며(IEF 아가로스는 본질적으로 크기와 무관함), 생화학, 분자생물학 및 단백질체학에서는 DNA와 RNA 절편의 혼합물을 길이에 따라 분리하거나, DNA와 RNA 절편의 크기를 추정하거나, 전하에 따라 단백질을 분리하는 데 사용됩니다.
세포 배양
세포 배양은 통제된 조건에서 세포를 기르는 제어된 성장 과정입니다. 세포 배양 조건은 세포 유형마다 다릅니다. 일반적으로 세포 배양 환경은 필수 영양소(아미노산, 탄수화물, 비타민, 무기질), 성장 인자, 호르몬 및 기체(CO2, O2)를 공급하고 물리화학적 환경(pH 완충, 삼투압, 온도)을 조절하는 기질 또는 배지가 담긴 적절한 용기(예: 페트리 접시)로 구성됩니다. 대부분의 세포는 표면이나 인공 기질이 필요하지만, 다른 세포 배양물은 배양 배지에 자유롭게 부유하는 상태로 배양할 수 있습니다(현탁 배양, 세포 현탁액).
동물 세포주의 대량 배양은 바이러스 백신과 기타 생명공학 유래 제품의 산업적 생산에 사용됩니다. 인간 줄기세포는 세포 수를 늘리고 이식 목적으로 다양한 체세포 유형으로 분화시키기 위해 배양합니다.
조직 시료
조직이라는 용어는 세포 물질이 세포와 완전한 기관 사이의 조직화 수준에 있는 세포성 중간 단위를 가리킵니다. 조직에는 기원이 같고 함께 특정 기능을 수행하는 유사한 세포들이 모여 있습니다. 여러 조직이 기능적으로 모여 기관의 복잡한 구조를 형성합니다.
조직은 생물학, 조직학/조직병리학, 기생충학, 생화학, 면역조직화학 연구뿐 아니라 배양 및 DNA 추출을 위해서도 채취합니다. 조직은 동물 조직(하위 분류: 포유류 조직)과 식물 조직으로 구분할 수 있습니다. 동물 조직은 결합 조직, 근육 조직, 신경 조직, 상피 조직의 네 가지 기본 유형으로 분류됩니다. 식물 조직은 표피 조직계, 기본 조직계, 관다발 조직계의 세 가지 조직계로 세분됩니다.
조직 시료는 뼈, 근육, 잎 등 동물이나 식물의 일부에서 준비할 수 있습니다.
체액
혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 타액 및 활액은 진단과 관련된 풍부한 정보를 제공하는 체액입니다. 따라서 분석을 위한 체액 시료의 정교한 전처리가 중요합니다. 첫 번째 어려움은 체액에 존재하는 성분 농도의 동적 범위가 넓다는 점과 관련이 있습니다.
단백질 농도 측정
Bradford 분석법, Lowry 분석법 및 비신코닌산(BCA) 분석법은 단백질 농도를 측정하는 데 흔히 사용되는 분석법입니다. 소 혈청 알부민(BSA)은 가장 자주 사용되는 단백질 표준물질 중 하나입니다.
세포 용해 완충액
세포 용해 완충액은 세포 물질이나 조직(조직 배양, 식물, 세균, 진균 등), 세포가 구조를 이루고 있는지 여부 및 그 구조의 유형에 따라 선택해야 합니다. 단백질, 막 및 세포 소기관을 추출하기 위한 다양한 세포 용해 완충액에는 하나 이상의 계면활성제가 배합됩니다. 계면활성제는 일반적으로 시행착오 실험을 통해 선택하거나, 기존 단백질 추출 프로토콜이 있는 경우 이에 따라 선택합니다. 계면활성제는 조직의 유래 및 단백질과 적합해야 합니다. 일반적으로 추출물의 기능을 최대로 유지하기 위해 특정 조직 / 단백질에 효과가 있는 가장 순한 계면활성제를 선택합니다. 또한 막과 세포 소기관을 추출하는 경우 순한 계면활성제는 막을 온전하게 유지합니다. 세포 용해 완충액에 흔히 사용되는 계면활성제는 대부분 비이온성 또는 양쪽성 이온성이며, 예로는 CHAPS, 데옥시콜레이트, Triton™ X-100, NP40 및 Tween 20이 있습니다.
예를 들어 뇌, 간, 장, 신장, 비장 등의 조직은 RIPA만으로 간단히 완충 처리할 수 있습니다. 그러나 단백질분해효소 억제제와 DTT(예: 겔 전기영동용)를 포함해야 합니다.
골격근 조직용 세포 용해 완충액(얼음처럼 차가운 상태): 20 mM Tris(pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) 글리세롤, 1 mM EDTA, 1 mM 디티오트레이톨에 단백질분해효소 및 인산가수분해효소 억제제 혼합물을 첨가
일반적인 완충액과 그 pH 범위를 정리한 표입니다. 일반적으로 이러한 완충액은 보통 20–50 mM 농도로 사용됩니다.
| 완충액 | pH 범위 |
|---|---|
| 구연산 – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| 구연산나트륨 – 구연산 | 3.0 – 6.2 |
| 아세트산나트륨 – 아세트산 | 3.6 – 5.6 |
| 카코딜산 나트륨염 – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| 인산이수소나트륨 – 인산수소이나트륨 | 5.8 – 8.0 |
| 이미다졸 – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| 트리에탄올아민 염산염 – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| 트리신 – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| 사붕산나트륨 – 붕산 | 7.6 – 9.2 |
| 비신 – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| 글리신 – NaOH | 8.6 – 10.6 |
대부분의 완충액은 온도에 따라 pH가 달라집니다. 특히 Tris 완충액에서 이러한 특성이 두드러집니다. pKa는 25°C에서 8.06이며, 0°C에서는 8.85로 변합니다.
(완충액의 pH와 pKa: pH는 수용액 내 수소 이온의 농도를 측정하는 척도입니다. pKa(= 산 해리 상수)는 이와 관련된 척도이지만, 특정 pH 값에서 분자가 어떻게 거동할지 예측하는 데 도움이 된다는 점에서 더 구체적인 척도입니다.)
TRIzol
TRIzol은 구아니디늄 티오시아네이트–페놀–클로로포름 추출 과정에서 RNA/DNA/단백질을 추출하는 데 사용되는 화학 용액입니다. 초음파 보조 TRIzol 추출을 사용하면 동일한 시료에서 DNA, RNA 및 단백질을 높은 수율로 얻을 수 있으며, 이로써 다른 추출 방법보다 우수한 성능을 발휘합니다.
문헌/참고문헌
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.