조직 및 세포 배양 물로부터의 초음파 단백질 추출
- 단백질 추출은 프로테오믹스에서 필수 샘플 준비 단계입니다.
- 식물 및 동물 조직, 효모 및 미생물에서 단백질을 추출 할 수 있습니다.
- 초음파 분쇄는 짧은 추출 시간 내에 높은 단백질 수율을 제공하는 신뢰할 수 있고 효율적인 단백질 추출 방법입니다.
조직과 세포에서 단백질 추출
조직 및 배양된 세포에서 단백질을 추출하는 것은 ELISA, PAGE, 웨스턴 블로팅, 질량분석법 또는 단백질 정제와 같은 많은 생화학 및 분석 기술 중에 수행되는 필수 샘플 준비 단계입니다. 초음파 세포 파괴, 용해 및 추출은 단백질의 높은 수율을 보장하기 위해 정밀하게 제어 가능한 비 열 기술입니다.
를 이용한 세포로부터의 단백질 추출 초음파 프로브 UP200St
- 빠른
- 고수익
- 고효율
- 매개 변수에 대한 정확한 제어
- 재현 가능한 결과
- 선형 확장 성
초음파 용해 및 단백질 추출에 대한 일반 지침
- 온도 제어: 열 변성없이 높은 단백질 수율을 보장하기 위해서는 추출 중 온도를 제어해야합니다. Hielscher의 최첨단 초음파 균질 기 – 초음파 붕괴기 또는 초음파 장치라고도 함 – 정확하게 제어 할 수 있습니다. 그들은 플러그 형 온도 센서와 함께 제공됩니다. 초음파 호 모지 나이저의 설정 옵션에서 최대 온도를 설정할 수 있습니다. 최대 온도에 도달하면 샘플이 냉각 될 때까지 초음파 발생 장치가 자동으로 멈 춥니 다.
- 완충기: 적합한 완충액 및 완충액의 선택은 조직마다 다르며 시행 착오적 검사를 통해 알아 내야합니다.
- 분리 / 정제 : 단백질 용 해물은 단백질 침전 (deoxycholate-trichloroacetic acid) 또는 완충액 교환으로 제거 할 수있는 DNA 또는 탄수화물과 같은 과량의 생체 분자를 함유 할 수 있습니다.
Chittapalo와 Noomhorm (2009)은 초음파 처리를 사용하여 단백질 수율이 증가하고 초음파 조직 균질화 및 용해 공정이 기존 추출 공정을 크게 향상시킬 수 있다고보고했습니다. – 새로운 상업 추출 기회를 제공합니다.
동물 조직에서 단백질 추출
전체 크기의 조직 (예 : 신장, 심장, 폐, 근육 등)을 준비하려면 조직을 얼음 위에서 깨끗한 도구로 아주 작은 조각으로 해부해야하며 가능한 한 빨리 단백질 분해 효소 (예. RIPA 또는 프로테아제 및 포스 파타 아제 억제제 칵테일을 함유하는 저 삼투압 용해 완충액과 같은 용해 완충액). 해부 후 샘플을 액체 질소에 담그고 신속하게 고정시킵니다. 샘플은 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 보관하거나 즉각적인 균질화를 위해 얼음으로 보관할 수 있습니다. 초음파 추출 직전에 얼음 저온 용해 완충액 (protease inhibitor DTT, leupeptin 및 aprotinin)을 시료 튜브에 신속히 첨가합니다 (조직 약 10mg 당 약 600μL의 완충제 권장). 대략 샘플 튜브 당 20-60mg의 조직이 권장됩니다.
초음파 균질화, 용해 및 추출은 마이크로 팁 sonotrode가 장착 된 UP100H 또는 UP200Ht와 같은 초음파 균질 기로 수행됩니다. 초음파 처리 기간은 60-90 초입니다. 15 초의 초음파 사이클 모드에서. 초음파 처리 및 10 초. 휴식 시간. 샘플은 항상 얼음에 보관해야합니다.
초음파 균질화 / 추출 후, 용 해물을 약 27,000g에서 원심 분리한다. 20 분. 이후에 상청액이 수집되어, 단백질 농도는 피어스 단백질 분석 BCA와 같은 단백질 분석에 의해 결정될 수있다.
혈청 단백질 추출
혈청과 인산염 완충액의 균질 혼합물의 경우, 샘플은 초음파 세포 용해 전에 먼저 소용돌이 처리됩니다. 초음파 용해의 경우, 샘플은 UP100H와 같은 초음파 실험실 균질 기로, 20 % 진폭에서 8 사이클, 각 5 초 켜기 및 15 초 끄기. Sonocation은 주기적으로 초음파 처리에 의해 수행되고 샘플을 얼음 위에 놓아 샘플의 과열 및 열 분해를 방지합니다. 혈청에는 IEF 동안 저 분자량 단백질의 분리를 방해하는 다량의 고 분자량 단백질 (예 : 알부민, α1- 항 트립신, 트랜스페린, 합 토글 로불린, 면역 글로불린 G 및 면역 글로불린 A)이 포함되어 있으므로 고갈 컬럼을 사용하여 혈청에서 고갈시키는 것이 좋습니다.
식물 조직에서 단백질 추출
신선하고 부드러운 식물 조직, 예를 들어 이끼 등은 잘게 자른 시료 물질을 초음파 처리를위한 용해 완충액에 넣기 만하면 쉽게 파열 될 수 있습니다. 종자, 전나무 바늘 등과 같이 거친 토착 식물 조직은 건조하게해야합니다. 일부 단단하고 우디 한 식물 재료는 초음파로 추출하기 전에 액체 질소로 얼리고 분쇄해야합니다. 식물 세포 배양 현탁액의 경우, 용해 완충액에서 30 초에서 150 초 사이의 초음파 처리로 대부분 충분합니다. 호박 씨앗과 같은 더 튼튼한 재료는 아래에서 설명하는 것처럼보다 강렬한 초음파 처리가 필요합니다.
호박 종자에서 알부민의 초음파 추출 프로토콜
미세한 호박씨 분말에서 알부민의 초음파 단백질 추출을 위해 탈지 호박씨 분말 10g과 탈이온수 100mL를 용매로 250mL 유리 비커에 첨가합니다. 단백질 추출은 두 단계로 구성됩니다. 첫째, 샘플은 초음파 처리됩니다. 프로브 형 초음파 처리기 UP400St (400W, 24kHz) sonotrode S24d7이 장착되어 있습니다. 유리 비커는 초음파 균질화 동안 냉수 욕조에 배치됩니다. 플러그형 온도 센서가 있는 초음파 처리기 UP400St의 설정은 샘플 온도가 항상 30°C 미만으로 유지되도록 했습니다. 초음파 처리 중 정확한 온도 제어에 의해 알부민의 변성을 피할 수 있습니다. 둘째, 추출은 200 rpm 속도 및 30 ° C에서 믹서로 수행되었다. 그 후 비커는 자동 온도 조절 셰이커로 옮겨집니다. 글로불린은 증류수로 투석을 통해 제거됩니다. 글로불린 제거 후, 단백질 추출물은 알부민 프로파일의 측정을 위해 샘플링 될 수 있으며, 이후 알부민 응고를 위해 0.1 M HCl을 사용하여 pI = 3.0으로 조정된다. 고체상은 5000g, 20°C에서 원심분리에 의해 분리되고 탈이온수에 재용해됩니다. 알부민 응고는 알부민 농축액에서 단백질 비율을 증가시키기 위해 두 번 수행됩니다.
쌀겨에서 단백질 농축 물을 제조하기위한 초음파 알칼리 단백질 추출은 초음파 처리가 추출 시간이 현저히 짧아 단백질 수율이 높아짐을 보여줍니다 – 기존의 추출 방법에 비해
기능성 iNOS 효소를위한 시료 준비 프로토콜
완전한 기능의 iNOS 효소 (예 : 약물 스크리닝 용)를 얻으려면 다음 프로토콜을 권장합니다. 세포 현탁액은 얼음 위에 놓아야하며 5 초 초음파 처리 및 25 초의 사이클 모드에서 10μm 진폭에서 UP100H로 초음파 처리됩니다. 절차는 약 3 번 반복해야합니다. 초음파 처리 사이클 사이의 휴식 시간은 온도 상승을 줄여 변성의 위험을 줄입니다.
초음파 단백질 가용화
초음파 처리는 단백질 가용화 과정을 가속화하는데, 보통 수 시간이 소요됩니다. 시료를 과열시키지 않고 단백질 분해 및 요소가 포함 된 용액의 변형을 방지하기 위해 초음파 버스트는 몇 초 이상 지속되지 않아야합니다.
초음파 처리기 UP200Ht with 2mm microtip S26d2 for the sonication of small samples.
단백질 추출을위한 초음파 장비
Hielscher Ultrasonics는 세포, 조직, 박테리아, 미생물, 효모 및 포자의 분해를위한 광범위한 초음파 균질기를 제공합니다.
Hielscher 실험실 초음파 는 강력하고 작동하기 쉽습니다. 24/7 작동을 위해 제작 된이 제품은 견고하고 효율적인 실험실 및 벤치 탑 장치로 설계되었습니다. 모든 장치에 대해 에너지 출력과 진폭을 정밀하게 제어할 수 있습니다. 다양한 액세서리는 추가 설정 옵션을 제공합니다. 바이알트위터, UP200Ht, UP200St, UP400St와 같은 디지털 초음파 에는 통합 온도 제어 장치와 자동 데이터 기록을 위한 내장 SD 카드가 있습니다.
여러 샘플의 간접적이고 교차 오염이없고 동시에 초음파 처리를 위해 VialTweeter 또는 초음파 CupHorn을 제공합니다.
아래 표는 샘플 준비, 세포 파괴 및 추출을 위한 초음파 에 대한 개요를 제공합니다. 각 초음파 균질화기에 대한 자세한 정보를 얻으려면 장치 유형을 클릭하십시오. 우리의 잘 훈련되고 오랜 경험 기술 직원은 샘플 준비에 가장 적합한 초음파 를 선택하는 데 기꺼이 도움을 드릴 것입니다!
| 일괄 볼륨 | 유량 | 권장 장치 |
|---|---|---|
| 최대 10개의 바이알 또는 튜브 | N.A. | 유리 병 |
| 멀티웰/마이크로타이터 플레이트 | N.A. | UIP400MTP |
| 다중 튜브 / 용기 | N.A. | 쿠펀 |
| 1 ~ 500mL | 10 ~ 200mL / min | UP100H |
| 10 내지 1000 밀리람베르트 | 20 내지 200mL/분 | UP200Ht, UP200St |
| 10 ~ 2000mL | 20 ~ 400 mL / min | UP400St |
신청서, 재료 및 샘플 양에 따라 샘플 준비에 가장 적합한 설정을 권합니다. 오늘 저희에게 연락하십시오!
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Hielscher 디지털 초음파 는 통합 SD 카드에 브라우저 원격 제어 및 자동 데이터 프로토콜을 갖추고 있습니다.
유리 병 간접 초음파.
알만한 가치가있는 사실
프로테오믹스
Proteomics는 단백질과 프로테옴을 연구하는 연구 분야입니다. 단백질은 유기체 내에서 광범위한 기능을 충만합니다. 프로테옴은 특정 시간에 게놈, 세포, 조직 또는 유기체에 의해 발현되는 전체 단백질 집합체입니다. 프로테옴은 세포 또는 유기체가 겪는 시간과 뚜렷한 요구 사항 또는 스트레스에 따라 달라집니다. 보다 구체적으로 말하자면, 주어진 시간에 정의 된 조건 하에서 주어진 유형의 세포 또는 유기체에서 발현 된 단백질의 집합입니다. 이 용어는 단백질과 게놈을 혼합 한 것입니다. Proteomics는 프로테옴의 연구입니다.
단백질
단백질은 큰 생체 분자, 소위 거대 분자 – 이는 아미노산 잔기의 하나 이상의 긴 사슬로 구성된다. 단백질은 식물과 동물 기원의 모든 유기체에 존재하며 대부분의 생물학적 기능에 중요합니다. 단백질은 많은 생물학적 정보를 포함하고 있기 때문에, 예를 들어 proteomic 연구와 같은 분석 목적으로 추출됩니다. 단백질이 수행하는 가장 중요한 기능은 대사 반응의 촉매 작용, DNA 복제, 자극에 대한 반응 및 한 위치에서 다른 위치로의 분자 수송을 포함합니다. 단백질은 그들의 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 의해 지시되며 일반적으로 그 단백질의 활성을 결정하는 특정 3 차원 구조로 폴딩 (folding)하는 아미노산 서열에서 주로 서로 상이하다. 단백질은 – 펩타이드 외에 – 음식의 주요 구성 요소 중 하나. 따라서 프로테오믹스는 프로세스, 식품 안전 및 영양 평가를 최적화하기위한 식품 과학의 강력한 도구입니다.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction 분석물을 분리하고 사전 컨세타이트하기 위한 사전 분석 절차입니다. 초음파와 함께 구름 점 추출을 강화하여 공정을보다 효율적이고 빠르며 환경 친화적으로 만들 수 있습니다. 초음파를 사용하면 구름 점 추출이 분석 물 준비의 훨씬 더 효율적인 방법입니다. 초음파 보조 구름 점 추출에 대해 자세히 읽어보십시오!겔 전기 영동
겔 전기 영동은 DNA, RNA 및 단백질과 같은 거대 분자와 그 단편을 크기와 전하에 따라 분리하고 분석하는 주요 방법입니다. 그것은 DNA와 RNA 단편의 혼합 된 집단을 길이별로 분리하여 DNA의 크기를 추정하기 위해 전하 및 / 또는 크기 (IEF 아가로 오스, 본질적으로 크기에 무관) 및 생화학, 분자 생물학 및 단백체학에서 단백질을 분리하기 위해 임상 화학에 사용됩니다 RNA 단편을 분리하거나 단백질을 전하로 분리 할 수 있습니다.
세포 배양
세포 배양은 제어 된 조건 하에서 세포가 재배되는 조절 된 성장 과정이다. 세포 배양 조건은 각 세포 유형에 따라 다릅니다. 일반적으로 세포 배양 환경은 필수 영양소 (아미노산, 탄수화물, 비타민, 미네랄), 성장 인자, 호르몬 및 가스 (CO)를 공급하는 기질 또는 배지가있는 적합한 혈관 (예 : 페트리 접시)2, O2), 물리 화학적 환경 (pH 완충제, 삼투압, 온도)을 조절합니다. 대부분의 세포는 표면이나 인공 기질이 필요하지만 다른 세포 배양 물은 배지 (부유 배양, 세포 현탁액)에서 자유롭게 배양 할 수 있습니다.
동물 세포주의 대량 배양은 바이러스 백신 및 기타 생물 공학적으로 추출 된 제품의 산업 생산에 사용됩니다. 인간 줄기 세포는 배양되어 세포 수를 늘리고 이식 목적으로 다양한 체세포 유형으로 분화시킵니다.
조직 샘플
조직이라는 용어는 세포 중간 물질을 말하며 세포 물질은 세포와 완전한 장기 사이의 조직적 수준에 있습니다. 조직에서 특정 기능을 수행하는 동일한 원점의 유사한 세포가 조립됩니다. 여러 조직의 기능적 그룹화로 인해 기관의 복잡한 구조가 형성됩니다.
조직은 생물학, 조직학 / 조직 병리학, 기생충학, 생화학, 면역 조직 화학 연구뿐만 아니라 DNA 배양 및 추출을 위해 샘플링됩니다. 그것은 동물 (세분 : 포유류 조직)과 식물 조직을 구별 할 수 있습니다. 동물 조직은 결합, 근육, 신경 및 상피 조직의 네 가지 기본 유형으로 분류됩니다. 식물 조직은 표피, 지상 조직 및 혈관 조직의 세 가지 조직 체계로 세분됩니다.
조직 샘플은 뼈, 근육, 잎 등과 같은 동물 또는 식물 부분으로부터 준비 할 수 있습니다.
체액
혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 타액 및 활액은 체액이며 이는 진단 관련 정보를 제공합니다. 따라서 분석을위한 체액 샘플의 정교한 준비가 중요합니다. 첫 번째 어려움은 체액에 존재하는 구성 요소의 광범위한 동적 범위와 관련이 있습니다.
단백질 농도의 결정
Bradford 분석, Lowry 분석 및 bicinchoninic acid (BCA) 분석은 단백질 농도를 결정하기위한 일반적인 분석법입니다. 소 혈청 알부민 (BSA)은 가장 빈번하게 사용되는 단백질 표준 중 하나입니다.
용해 완충액
용해 완충액은 세포 물질 또는 조직 (조직 배양, 식물, 박테리아, 곰팡이 등) 및 세포가 구조 및 유형의 구조에 있는지 여부에 따라 선택해야합니다. 단백질, 멤브레인 및 세포 소기의 추출을위한 광범위한 완충 완충액이 하나 이상의 세제로 제형 화됩니다. 세제는 일반적으로 시행 착오 시험 또는 – 가능한 경우 – 기존 단백질 추출 프로토콜에 따르면. 세제는 조직 공급원 및 단백질과 호환되어야합니다. 일반적으로 추출물의 최대 기능을 유지하기 위해 특정 조직 / 단백질에 적합한 가장 순한 세제를 선택합니다. 또한 멤브레인과 세포 소기류를 추출하는 경우 중성 세제로 인해 멤브레인이 손상되지 않습니다. 용해 완충액에 일반적으로 사용되는 세제는 주로 비이 온성 또는 양성 이온입니다 (예 : CHAPS, 데 옥시 콜레이트, Triton ™ X-100, NP40 및 Tween 20).
예를 들어, 뇌, 간, 내장, 신장, 비장 등과 같은 조직은 RIPA로 간단히 버퍼링 될 수 있습니다 – 그러나 단백 분해 효소 억제제와 DTT (예 : 겔 전기 영동)가 포함되어야한다.
골격근 조직 (빙냉) 용 용해 완충액 : 20 mM Tris (pH 7.8), 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w / v) 글리세롤, 1 mM EDTA , 프로 테아 제 및 포스파타제 억제제 칵테일이 보충 된 1 mM 디티 오 트레이 톨
일반적인 버퍼 및 pH 범위 표. 일반적으로 이들 완충액은 일반적으로 20-50 mM 농도에서 사용됩니다.
| 완충기 | pH 범위 |
|---|---|
| 구연산 – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| 구연산 나트륨 – 구연산 | 3.0 – 6.2 |
| 나트륨 아세테이트 – 아세트산 | 3.6 – 5.6 |
| 카코 딜산 나트륨 염 – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| 인산이 수소 나트륨 – 인산 수소이 나트륨 | 5.8 – 8.0 |
| 이미 다졸 – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – 코 | 6.6 – 7.8 |
| 트리에탄올 아민 염산염 – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| 트리스 – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| 나트륨 테트라 보레이트 – 붕산 | 7.6 – 9.2 |
| 바이 신 – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| 글리신 – NaOH | 8.6 – 10.6 |
대부분의 완충액은 온도에 따라 pH 의존성을 보입니다. 트리스 버퍼의 경우 특히 그렇습니다. pKa는 0 ° C에서 25 ° C에서 8.06 °에서 8.85 °로 변합니다.
(버퍼의 pH와 pKa : pH는 수용액에서 수소 이온의 농도를 측정합니다 .pKa (= 산 해리 상수)는 분자가 특정 분자에서 어떻게 작용할지 예측하는 데 도움이된다는 점에서보다 구체적인 측정입니다. pH 값.)
트리 졸
TRIzol은 구아니딘 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출 동안 RNA / DNA / 단백질을 추출하는 데 사용되는 화학 용액입니다. 초음파를 이용한 TRIzol 추출을 사용하면 동일한 시료의 높은 DNA, RNA 및 단백질 수확량을 얻을 수 있으며 다른 추출 방법보다 뛰어납니다.
문학 / 참고 문헌
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.