조직 및 세포 배양에서 초음파 단백질 추출
- 단백질 추출은 단백질체학에서 필수적인 시료 전처리 단계입니다.
- 단백질은 식물 및 동물 조직, 효모 및 미생물에서 추출할 수 있습니다.
- 초음파 처리는 짧은 추출 시간 내에 높은 단백질 수율을 제공하는 신뢰할 수 있고 효율적인 단백질 추출 방법입니다.
조직과 세포에서 단백질 추출
조직 및 배양된 세포에서 단백질을 추출하는 것은 ELISA, PAGE, 웨스턴 블로팅, 질량 분석법 또는 단백질 정제와 같은 많은 생화학 및 분석 기법 중에 수행되는 필수 시료 전처리 단계입니다. 초음파 세포 파괴, 용해 및 추출은 단백질의 높은 수율을 보장하기 위해 정밀하게 제어 가능한 비열 기술입니다.
를 가진 세포에서 단백질 추출 초음파 프로브 UP200St
- 빠른
- 높은 수율
- 고효율
- 파라미터에 대한 정밀한 제어
- 재현 가능한 결과
- 선형 확장성
초음파 용해 및 단백질 추출에 대한 일반 지침
- 온도 제어: 열 변성 없이 높은 단백질 수율을 보장하려면 추출 중 온도를 제어해야 합니다. Hielscher의 최첨단 초음파 균질화기 – 초음파 분해기 또는 초음파라고도합니다. – 정확하게 제어 할 수 있습니다. 플러그형 온도 센서가 함께 제공됩니다. 초음파 균질화기의 설정 옵션에서 최대 온도를 설정할 수 있습니다. 이 최대 온도에 도달하면 샘플이 냉각 될 때까지 초음파가 자동으로 멈 춥니 다.
- 완충기: 적절한 완충액과 적절한 양의 완충액을 선택하는 것은 조직마다 다르며 시행착오 테스트를 통해 파악해야 합니다.
- 격리/정화: 단백질 용해물에는 DNA 또는 탄수화물과 같은 생체 분자가 과도하게 포함될 수 있으며, 이는 단백질 침전(디옥시콜레이트-트리클로로아세트산) 또는 완충액 교환에 의해 제거될 수 있습니다.
Chittapalo와 Noomhorm (2009)은 연구에서 초음파 처리를 사용하여 단백질 수율이 증가했으며 초음파 조직 균질화 및 용해 과정이 기존 추출 과정을 크게 향상시킬 수 있다고보고했습니다 – 새로운 상업적 추출 기회를 가능하게 합니다.
초음파 CupHorn 단백질 분리 및 DNA 단편화를 위해 동일한 조건에서 여러 시료를 동시에 매우 효율적으로 전처리할 수 있습니다.
동물 조직에서 단백질 추출
전체 크기의 조직(예: 신장, 심장, 폐, 근육 등)을 준비하기 위해 조직을 깨끗한 도구를 사용하여 매우 작은 조각으로 절개해야 하며, 가급적이면 얼음 위에서 프로테아제(예: 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일을 함유한 RIPA 또는 저긴장성 용해 완충액과 같은 용해 완충액)에 의한 분해를 방지하기 위해 가능한 한 빨리 절개해야 합니다. 해부 후 샘플을 액체 질소에 담가 스냅 동결합니다. 샘플은 나중에 사용하기 위해 -80°C에서 보관하거나 즉각적인 균질화를 위해 얼음 위에 보관할 수 있습니다. 초음파 추출 직전에 얼음 냉간 용해 완충액(프로테아제 억제제 DTT, 류펩틴 및 아프로티닌 포함)을 시료 튜브에 빠르게 첨가합니다(조직 ~10mg당 약 ~600μL의 완충액 권장). 약 20-60mg의 조직이 샘플 튜브당 권장됩니다.
초음파 균질화, 용해 및 추출은 마이크로 팁 sonotrode가 장착 된 UP100H 또는 UP200Ht와 같은 초음파 균질화기로 수행됩니다. 초음파 처리 시간은 60-90 초입니다. 초음파 처리 모드는 15 초, 초음파 처리 및 10 초. 휴식 시간. 샘플은 항상 얼음 속에 보관해야 합니다.
초음파 균질화/추출 후 용해물을 27,000g에서 약 20분 동안 원심분리합니다. 그 후 상층액을 수집하여 단백질 농도를 Pierce protein assay BCA와 같은 단백질 분석으로 결정할 수 있습니다.
혈액 혈청에서 단백질 추출
혈청과 인산염 완충액의 균질한 혼합물의 경우, 샘플은 초음파 세포 용해 전에 먼저 소용돌이칩니다. 초음파 용해의 경우, 샘플은 UP100H와 같은 초음파 실험실 균질화기로 20 % 진폭에서 8 사이클 동안 각 5 초 켜기 및 15 초 끄기의주기에 대해 초음파 처리됩니다. 단백질 추출은 사이클 (맥동 모드)로 초음파 처리하고 샘플의 과열 및 열 저하를 방지하기 위해 샘플을 얼음 위에 올려 놓음으로써 수행됩니다. 혈청에는 고분자량 단백질(예: 알부민, α1-항트립신, 트랜스페린, 햅토글로불린, 면역글로불린 G, 면역글로불린 A 등)이 다량 포함되어 있으므로 고갈 컬럼을 사용하여 혈청에서 고갈시키는 것이 권장됩니다.
식물 조직에서 단백질 추출
예를 들어 이끼 등과 같은 신선하고 부드러운 식물 조직은 초음파 처리를 위해 잘게 잘린 샘플 물질을 용해 완충액에 넣기만 하면 쉽게 파괴될 수 있습니다. 씨앗, 전나무 바늘 등과 같은 거칠고 탄력적인 식물 조직은 건조시켜야 합니다. 일부 단단하고 목질이 많은 식물 재료는 초음파 처리로 추출하기 전에 액체 질소로 얼고 분쇄해야합니다. 식물 세포 배양 현탁액의 경우, 용해 완충액에서 30초에서 150초 사이의 초음파 처리로 대부분 충분합니다. 호박씨와 같은 더 단단한 물질은 아래에 설명된 대로 더 강렬한 초음파 처리가 필요합니다.
호박씨에서 알부민의 초음파 추출을 위한 프로토콜
곱게 간 호박씨 분말에서 알부민의 초음파 단백질 추출을 위해 250mL 유리 비커에 10g의 탈지 호박씨 분말과 100mL의 탈이온수를 용매로 첨가합니다. 단백질 추출은 두 단계로 구성됩니다 : 먼저, 샘플은 다음과 같이 초음파 처리됩니다. 프로브 형 초음파 증폭기 UP400St (400W, 24kHz)에는 sonotrode S24d7이 장착되어 있습니다. 유리 비커는 초음파 균질화 중에 냉수 수조에 넣어집니다. 초음파기 UP400St의 플러그형 온도 센서 및 온도 제어 설정은 샘플 온도가 항상 30°C 미만으로 유지되도록 합니다. 초음파 처리 중 정확한 온도 제어에 의해 알부민의 변성을 피할 수 있습니다. 둘째, 200rpm 속도와 30°C에서 믹서를 사용하여 추출을 수행했습니다. 그 후, 비커는 자동 온도 조절 셰이커로 옮겨집니다. 글로불린은 증류수로 투석을 통해 제거됩니다. 글로불린 제거 후, 단백질 추출물을 샘플링하여 알부민 프로필을 측정할 수 있으며, 이어서 알부민 응고를 위해 0.1M HCl을 사용하여 pI=3.0으로 조정합니다. 고체상은 5000g, 20°C에서 원심분리로 분리되고 탈이온수에 재용해됩니다. 알부민 농축액의 단백질 비율을 증가시키기 위해 알부민 응고를 두 번 수행합니다.
쌀겨에서 단백질 농축액을 준비하기 위한 초음파 알칼리성 단백질 추출은 초음파 처리가 훨씬 더 짧은 추출 시간에 더 높은 단백질 수율 결과를 가져온다는 것을 보여줍니다 – 기존의 추출 방법과 비교하여.
기능성 iNOS 효소를 위한 시료 전처리 프로토콜
완전한 기능을 갖춘 iNOS 효소 (예 : 약물 스크리닝 용)를 얻으려면 다음 프로토콜이 권장됩니다 : 세포 현탁액은 얼음 위에 놓아야하며 5 초 초음파 처리 및 25 초 얼음 위의 사이클 모드에서 10μm 진폭의 UP100H로 초음파 처리됩니다. 이 절차는 약 3회 반복해야 합니다. 초음파 처리 주기 사이의 휴식 시간은 온도 상승을 감소시켜 변성의 위험을 줄입니다.
초음파 단백질 가용화
초음파 처리는 단백질 가용화 과정을 가속화 할 수 있으며, 이는 일반적으로 몇 시간이 필요합니다. 샘플이 과열되지 않고 요소가 포함된 용액에서 단백질 분해 및 변형을 방지하기 위해 초음파 파열은 몇 초 이상 지속되지 않아야 합니다.
초음파기 UP200Ht 작은 샘플의 초음파 처리를위한 2mm microtip S26d2 포함.
단백질 추출을 위한 초음파 장비
Hielscher 초음파는 세포, 조직, 박테리아, 미생물, 효모 및 포자의 분해를위한 광범위한 초음파 균질화를 제공합니다.
Hielscher 실험실 초음파는 강력하고 작동하기 쉽습니다. 연중무휴(24/7) 작동을 위해 제작된 이 제품은 견고하고 효율적인 실험실 및 벤치탑 장치로 설계되었습니다. 모든 장치에 대해 에너지 출력과 진폭을 정밀하게 제어할 수 있습니다. 광범위한 액세서리는 추가 설정 옵션을 제공합니다. VialTweeter, UP200Ht, UP200St 및 UP400St와 같은 디지털 초음파기에는 통합 온도 제어 장치와 자동 데이터 기록을위한 내장 SD 카드가 있습니다.
여러 샘플의 간접적이고 교차 오염이없는 동시 초음파 처리를 위해 VialTweeter 또는 초음파 CupHorn을 제공합니다.
아래 표는 시료 준비, 세포 파괴 및 추출을 위한 초음파기에 대한 개요를 제공합니다. 각 초음파 균질화기에 대한 자세한 정보를 보려면 장치 유형을 클릭하십시오. 우리의 잘 훈련되고 오랜 경험을 가진 기술 직원은 샘플 준비에 가장 적합한 초음파기를 선택하는 데 기꺼이 도움을 드릴 것입니다!
| 배치 볼륨(Batch Volume) | 유량 | 권장 장치 |
|---|---|---|
| 최대 10개의 바이알 또는 튜브 | N.A. 개시 | 바이알트위터 |
| Multiwell / Microtiter 플레이트 | N.A. 개시 | UIP400MTP |
| 여러 튜브 / 용기 | N.A. 개시 | 컵혼 |
| 1 내지 500mL | 10 내지 200mL/분 | 업100H |
| 10 내지 1000mL | 20 - 200mL/분 | UP200HT, UP200세인트 |
| 10 내지 2000mL | 20 내지 400mL/분 | UP400ST |
응용 분야, 재료 및 시료 부피에 따라 시료 전처리에 가장 적합한 설정을 추천해 드립니다. 오늘 저희에게 연락하십시오!
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Hielscher 디지털 초음파는 통합 SD 카드에 브라우저 원격 제어 및 자동 데이터 프로토콜 링 기능을 갖추고 있습니다.
바이알트위터 간접 초음파 처리를 위해.
알아 둘 만한 가치가 있는 사실
프로테오믹스(Proteomics)
단백질체학(Proteomics)은 단백질과 단백질체를 조사하는 연구 분야입니다. 단백질은 유기체 내에서 다양한 생명 기능을 수행합니다. 단백질체는 특정 시간에 게놈, 세포, 조직 또는 유기체에 의해 발현되는 전체 단백질 집합입니다. 단백질체는 세포나 유기체가 겪는 시간과 뚜렷한 요구 사항 또는 스트레스에 따라 달라집니다. 보다 구체적으로, 그것은 주어진 유형의 세포 또는 유기체에서 지정된 시간 내에 정의 된 조건에서 발현 된 단백질 세트입니다. 이 용어는 단백질과 게놈의 혼합물입니다. 단백질체학(Proteomics)은 단백질체에 대한 연구입니다.
단백질
단백질은 소위 거대분자라고 불리는 큰 생체 분자입니다. – 이는 하나 이상의 긴 아미노산 잔기로의 사슬로 구성됩니다. 단백질은 식물과 동물에서 기원한 모든 유기체에 존재하며 대부분의 생물학적 기능에 매우 중요합니다. 단백질은 많은 생물학적 정보를 포함하고 있기 때문에 단백질체 연구와 같은 분석 목적으로 추출됩니다. 단백질이 수행하는 가장 중요한 기능에는 대사 반응의 촉매 작용, DNA 복제, 자극에 대한 반응 및 한 위치에서 다른 위치로 분자 이동이 포함됩니다. 단백질은 주로 아미노산의 서열에서 서로 다르며, 이는 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 결정되며, 일반적으로 단백질이 활성을 결정하는 특정 3차원 구조로 접히는 결과를 낳습니다. 단백질은 다음과 같습니다. – 펩티드 외에 – 식품의 핵심 구성 요소 중 하나입니다. 따라서 단백질체학은 식품 과학에서 공정, 식품 안전 및 영양 평가를 최적화하는 강력한 도구입니다.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction 는 분석물을 분리하고 사전 접합하기 위한 사전 분석 절차입니다. 초음파와 함께 흐림 점 추출을 강화하여 프로세스를보다 효율적이고 빠르며 환경 친화적으로 만들 수 있습니다. 초음파를 사용하면 흐림 점 추출이 훨씬 더 효율적인 분석물 준비 방법입니다. 초음파 보조 구름 점 추출에 대해 자세히 알아보십시오!전기영동
겔 전기영동은 DNA, RNA 및 단백질과 같은 거대분자와 그 파편을 크기와 전하에 따라 분리하고 분석하는 주요 방법입니다. 임상 화학에서 전하 및/또는 크기(IEF 아가로스, 본질적으로 크기 독립적)로 단백질을 분리하는 데 사용되며 생화학, 분자 생물학 및 단백질체학에서 DNA 및 RNA 단편의 혼합 집단을 길이별로 분리하거나 DNA 및 RNA 단편의 크기를 추정하거나 전하로 단백질을 분리하는 데 사용됩니다.
세포 배양
세포 배양은 통제된 조건에서 세포를 배양하는 통제된 성장 과정입니다. 세포 배양 조건은 각 세포 유형에 따라 다릅니다. 일반적으로 세포 배양 환경은 필수 영양소(아미노산, 탄수화물, 비타민, 미네랄), 성장 인자, 호르몬 및 가스(CO2, O2)을 조절하고 물리화학적 환경(pH 완충액, 삼투압, 온도)을 조절합니다. 대부분의 세포는 표면 또는 인공 기질이 필요한 반면, 다른 세포 배양은 배양 배지(현탁 배양, 세포 현탁액)에서 자유롭게 부유하여 배양할 수 있습니다.
동물 세포주의 대량 배양은 바이러스 백신 및 기타 생명 공학적으로 파생된 제품의 산업 생산에 사용됩니다. 인간 줄기 세포는 세포 수를 늘리고 이식 목적으로 세포를 다양한 체세포 유형으로 분화하기 위해 배양됩니다.
조직 샘플
조직이라는 용어는 세포 물질이 세포와 완전한 장기 사이의 조직 수준에있는 세포 중간체를 설명합니다. 조직에서는 특정 기능을 함께 수행하는 동일한 기원의 유사한 세포가 조립됩니다. 여러 조직의 기능적 그룹화에 의해 장기의 복잡한 구조가 형성됩니다.
생물학, 조직학/조직병리학, 기생충학, 생화학, 면역조직화학 연구를 위해 조직을 샘플링하고 DNA를 배양 및 추출합니다. 동물(세분: 포유류 조직)과 식물 조직으로 구별할 수 있습니다. 동물 조직은 결합 조직, 근육 조직, 신경 조직 및 상피 조직의 네 가지 기본 유형으로 분류됩니다. 식물 조직은 표피, 지상 조직 및 혈관 조직의 세 가지 조직 시스템으로 세분됩니다.
조직 샘플은 뼈, 근육, 잎 등과 같은 동물 또는 식물 부분에서 준비할 수 있습니다.
체액
혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 타액 및 활액은 체액으로, 진단적으로 관련된 정보의 훌륭한 원천을 제공합니다. 따라서 분석을 위해 체액 샘플을 정교하게 준비하는 것이 중요합니다. 첫 번째 어려움은 체액에 존재하는 구성 요소의 광범위한 동적 범위와 관련이 있습니다.
단백질 농도 측정
Bradford assay, Lowry assay 및 bicinchoninic acid (BCA) assay는 단백질의 농도를 측정하기 위한 일반적인 assay입니다. 소 혈청 알부민(BSA)은 가장 자주 사용되는 단백질 표준물질 중 하나입니다.
리시스 버퍼
Lysis buffer는 세포 물질 또는 조직(조직 배양, 식물, 박테리아, 곰팡이 등), 세포가 구조 내에 있는지 여부 및 구조 유형에 따라 선택해야 합니다. 단백질, 멤브레인 및 소기관을 추출하기 위한 광범위한 용해 완충액은 하나 이상의 세제로 제조됩니다. 세제는 일반적으로 시행 착오 테스트를 통해 선택되거나 – 사용 가능한 경우 – 기존 단백질 추출 프로토콜에 따름. 세제는 조직 공급원 및 단백질과 호환되어야 합니다. 일반적으로 특정 조직/단백질에 작용하는 가장 순한 세제는 추출물의 최대한의 기능을 유지하기 위해 선택됩니다. 또한, 멤브레인과 소기관을 추출하는 경우 중성 세제가 멤브레인을 손상되지 않게 유지합니다. 용해 완충액에 일반적으로 사용되는 세제는 대부분 비이온성 또는 쌍성이온성입니다(예: CHAPS, deoxycholate, Triton™ X-100, NP40 및 Tween 20).
예를 들어, 뇌, 간, 장, 신장, 비장 등과 같은 조직은 RIPA로 간단하게 완충할 수 있습니다 – 그러나 프로테아제 억제제 및 DTT(예: 겔 전기영동)가 포함되어야 합니다.
골격근 조직용 용해 완충액(얼음처럼 차가움): 20mM Tris(pH 7.8), 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 1mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10%(w/v) 글리세롤, 1mM EDTA, 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일이 보충된 1mM 디티오트레이톨
일반적인 완충액 및 pH 범위 표. 일반적으로 이러한 완충액은 일반적으로 20-50mM의 농도에서 사용됩니다.
| 완충기 | pH 범위 |
|---|---|
| 구연산 – 나오 | 2.2 – 6.5 |
| 소듐시트레이트 – 구연산 | 3.0 – 6.2 |
| 소듐 아세테이트 – 아세트산 | 3.6 – 5.6 |
| 카코딜산 나트륨 염 – HCl | 5.0 – 7.4 |
| 증권 시세 표시기 – 나오 | 5.6 – 6.8 |
| 인산이수소나트륨 – 인산이수소이나트륨 | 5.8 – 8.0 |
| 이미다졸 – HCl | 6.2 – 7.8 |
| 걸레 – 코 | 6.6 – 7.8 |
| 트리에탄올아민 염산염 – 나오 | 6.8 – 8.8 |
| 트리스 – HCl | 7.0 – 9.0 |
| 헤페스 – 나오 | 7.2 – 8.2 |
| 트리신 – 나오 | 7.6 – 8.6 |
| 소듐 테트라보레이트 – 붕산(Boric Acid) | 7.6 – 9.2 |
| 비신 – 나오 | 7.7 – 8.9 |
| 글리신 – 나오 | 8.6 – 10.6 |
대부분의 완충액은 온도에 따른 pH 의존성을 보여줍니다. 이것은 특히 Tris 버퍼에 해당됩니다. pKa는 25°C에서 8.06에서 0°C에서 8.85로 변합니다.
(완충액의 pH 및 pKa: pH는 수용액 내 수소 이온의 농도를 측정합니다. pKa(= 산 해리 상수)는 분자가 특정 pH 값에서 어떻게 작용하는지 예측하는 데 도움이 된다는 점에서 관련이 있지만 보다 구체적인 측정입니다.)
트리졸
TRIzol은 구아니디늄 티오시아네이트-페놀-클로로포름 추출 중에 RNA/DNA/단백질을 추출하는 데 사용되는 화학 용액입니다. 초음파 보조 TRIzol 추출을 사용하면 동일한 샘플에서 DNA, RNA 및 단백질 수율이 높아지고 다른 추출 방법을 능가합니다.
문헌/참고문헌
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.