산업 생산에서 생물공학적으로 개량된 세포의 초음파 용해

E. coli와 같은 생물공학적으로 개량된 세균 종과 유전자 변형 포유류 및 식물 세포 유형은 분자를 발현하기 위해 생명공학 분야에서 널리 사용됩니다. 이렇게 합성된 생체분자를 방출하려면 신뢰할 수 있는 세포 파쇄 기술이 필요합니다. 고성능 초음파 처리는 효율적이고 신뢰할 수 있는 세포 용해를 위한 검증된 방법으로, 대규모 처리량에 맞춰 쉽게 확장할 수 있습니다. Hielscher Ultrasonics는 고품질 생체분자를 대량으로 생산할 수 있도록 효과적인 세포 용해를 위한 고성능 초음파 장비를 제공합니다.

세포 공장에서 분자 추출

다양한 생체분자를 생산하기 위해 여러 가지로 개량된 미생물과 식물 세포를 미생물 세포 공장으로 사용할 수 있으며, 여기에는 Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, 남세균, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana 및 조류를 비롯한 수많은 생물이 포함됩니다. 이러한 세포 공장은 단백질, 지질, 생화학 물질, 고분자, 바이오연료 및 유지화학 물질을 생산할 수 있으며, 이들은 식품이나 산업용 원료로 사용됩니다. 세포 공장으로 사용되는 세포는 밀폐형 생물반응기에서 배양되며, 그 안에서 높은 효율과 특이성, 낮은 에너지 요구량을 달성할 수 있습니다.
생물공학적으로 개량된 세포 배양물에서 표적 분자를 분리하려면 세포를 파쇄하여 세포 내 물질이 방출되도록 해야 합니다. 초음파 세포 파쇄기는 세포 파쇄와 화합물 방출을 위한 매우 신뢰할 수 있고 효율적인 기술로 확고히 자리 잡았습니다.

미생물 세포 공장은 다양한 유용 화합물의 합성에 사용되는 대사공학적으로 개량된 세포입니다. 초음파 세포 파쇄는 세포 내부에서 유용 화합물을 방출하는 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법입니다.
연구 및 도해: ©Villaverde, 2010.

초음파 세포 파쇄기의 장점

초음파 파쇄는 비열적이고 온화하면서도 매우 효율적인 기술로, 초음파 파쇄기는 실험실과 산업 현장에서 세포를 용해하고 고품질 추출물을 생산하는 데 사용됩니다. 예를 들어 세포 공장에서 분자를 분리하는 데 사용됩니다.

미생물 세포 공장의 효율적인 파쇄를 위한 고출력 초음파

초음파 세포 파쇄기의 작동 원리와 효과:
초음파 세포 파쇄는 초음파의 힘을 이용합니다. 초음파 균질기 / 세포 파쇄기에는 약 20 kHz의 높은 주파수로 진동하는 티타늄 합금 소재의 프로브(소노트로드라고도 함)가 장착되어 있습니다. 이는 초음파 프로브가 초음파 처리되는 액체에 초당 20,000회의 진동을 전달한다는 뜻입니다. 액체에 전달된 초음파는 고압 / 저압 주기가 번갈아 나타나는 특성이 있습니다. 저압 주기에는 액체가 팽창하고 미세한 진공 기포가 발생합니다. 이 매우 작은 기포들은 압력 주기가 여러 차례 번갈아 반복되는 동안 더 이상 에너지를 흡수할 수 없을 때까지 성장합니다. 이 시점에서 캐비테이션 기포가 격렬하게 내파하면서 국소적으로 에너지 밀도가 극도로 높은 환경을 형성합니다. 이 현상은 음향 캐비테이션으로 알려져 있으며, 국소적으로 매우 높은 온도, 매우 높은 압력 및 전단력이 발생하는 것이 특징입니다. 이러한 전단 응력은 세포벽을 효율적으로 파괴하고 세포 내부와 주변 용매 사이의 물질 전달을 증가시킵니다. 초음파로 생성된 전단력을 이용하는 방식은 순수한 기계적 기법으로, 세균 세포 파쇄와 단백질 분리에 널리 사용되며 권장되는 방법입니다. 초음파 처리는 간단하고 신속한 세포 파쇄 방법으로, 소량, 중간 용량 및 대용량 시료에서 물질을 분리하는 데 이상적입니다. Hielscher의 디지털 초음파 처리기에는 초음파 처리를 정밀하게 제어할 수 있는 명확한 설정 메뉴가 갖추어져 있습니다. 모든 초음파 처리 데이터는 내장 SD 카드에 자동으로 저장되며 쉽게 확인할 수 있습니다. 초음파 파쇄 과정에서 외부 냉각, 펄스 모드 초음파 처리 등 정교한 방열 옵션을 사용하면 이상적인 공정 온도를 유지하여 추출된 열 민감성 화합물이 온전하게 보존되도록 할 수 있습니다.

초음파 세포 파쇄 및 추출의 강점을 뒷받침하는 연구

Chemat 교수 등(2017)은 연구에서 다음과 같이 요약합니다. “초음파 보조 추출은 식품 및 천연물에 사용하는 기존 기법을 대체할 수 있는 친환경적이고 경제적으로 실현 가능한 방법입니다. 주요 이점은 추출 및 처리 시간, 에너지 및 용매 사용량, 단위 조작 수, CO₂ 배출량이 감소한다는 점입니다.”
Gabig-Ciminska 등(2014)은 DNA를 방출시키기 위해 포자를 용해하는 연구에서 고압 균질기와 초음파 세포 파쇄기를 사용했습니다. 두 세포 파쇄 방법을 비교한 연구팀은 포자 DNA를 얻기 위한 세포 용해에 관해 다음과 같이 결론 내립니다. “고압 균질화로 얻은 세포 용해물을 사용하여 분석을 수행했습니다. 이후 초음파 세포 파쇄가 이 목적에 탁월한 이점이 있다는 것을 알게 되었습니다. 상당히 빠르고 소량의 시료에도 적용할 수 있습니다.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

식품 생산을 위한 세포 공장 유래 생체분자

미생물 세포 공장은 세균, 효모, 진균 등의 미생물에 대사 생명공학 기술을 적용하여 고유 및 비고유 대사산물을 높은 수율로 생산하는, 실용적이고 효율적인 생산 방식이다. 예를 들어, 대량 생산 효소는 Aspergillus oryzae, 진균, 세균 등의 미생물을 이용하여 생산한다. 이러한 대량 생산 효소는 식품 및 음료 생산뿐만 아니라 농업, 바이오에너지 및 가정용 관리 제품 분야에서도 사용된다.
Acetobacter xylinum 및 Gluconacetobacter xylinus와 같은 특정 세균은 발효 과정에서 셀룰로오스를 생산하며, 이때 나노섬유는 상향식 공정으로 합성된다. 세균 셀룰로오스(미생물 셀룰로오스라고도 함)는 식물 셀룰로오스와 화학적으로 동등하지만, 높은 결정화도와 높은 순도(리그닌, 헤미셀룰로오스, 펙틴 및 기타 생물 유래 성분이 없음)를 가지며, 셀룰로오스 나노섬유가 엮인 삼차원(3D) 망상 네트워크라는 독특한 구조를 갖는다. (참조: Zhong, 2020) 식물 유래 셀룰로오스와 비교하면 세균 셀룰로오스는 지속 가능성이 더 높으며, 생산된 셀룰로오스는 순수하여 복잡한 정제 단계가 필요하지 않다. 초음파 처리와 NaOH 또는 SDS(도데실황산나트륨)를 이용한 용매 추출은 세균 세포에서 세균 셀룰로오스를 분리하는 데 매우 효과적이다.

의약품 및 백신 생산을 위한 세포 공장 유래 생체분자

세포 공장에서 생산되는 가장 대표적인 의약품 중 하나는 인간 인슐린이다. 생명공학적으로 인슐린을 생산할 때는 주로 E. coli와 Saccharomyces cerevisiae를 사용한다. 생합성된 나노 크기 분자는 높은 생체적합성을 제공하므로, 페리틴과 같은 생물학적 나노입자는 다양한 바이오제조 응용 분야에서 유리하다. 또한 대사공학적으로 개량된 미생물을 이용한 생산은 확보되는 수율 측면에서 훨씬 더 효과적인 경우가 많다. 예를 들어, 아르테미신산, 레스베라트롤 및 라이코펜의 생산량은 열 배에서 수백 배까지 증가했으며, 산업 규모 생산이 이미 확립되었거나 이를 위한 개발이 진행 중이다. (참조: Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
예를 들어, 페리틴 및 바이러스 유사 입자와 같이 자가조립 특성을 갖는 단백질 기반 나노 크기 생체분자는 병원체의 크기와 구조를 모두 모방하고, 면역세포와의 상호작용을 촉진하기 위해 표면에 항원을 접합할 수 있으므로 백신 개발에서 특히 관심을 끈다. 이러한 분자는 특정 표적 분자를 생산하는 이른바 세포 공장(예: 공학적으로 개량된 E. coli 균주)에서 발현된다.

페리틴 방출을 위한 E. coli BL21의 초음파 세포 용해 프로토콜

페리틴은 철 저장을 주요 기능으로 하는 단백질이다. 페리틴은 백신에서 자가조립 나노입자로서 유망한 가능성을 보이며, 백신 전달체(예: SARS-Cov-2 스파이크 단백질)로 사용된다. Sun et. al. (2016)의 과학적 연구는 낮은 NaCl 농도(≤50 mmol/L)에서 재조합 페리틴을 Escherichia coli로부터 가용성 형태로 방출할 수 있음을 보여준다. E. coli BL21에서 페리틴을 발현시키고 방출하기 위해 다음 프로토콜을 성공적으로 적용하였다. 재조합 pET-28a/ferritin 플라스미드로 E coli BL21 (DE3) 균주를 형질전환하였다. 페리틴 E coli BL21 (DE3) 세포를 0.5% 카나마이신이 포함된 LB 배양 배지에서 37°C로 배양하고, OD600이 0.6일 때 0.4% 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드로 37°C에서 3시간 동안 발현을 유도하였다. 그런 다음 최종 배양물을 4°C에서 8000g로 10분간 원심분리하여 수확하고 펠릿을 회수하였다. 이어서 펠릿을 LB 배지(1% NaCl, 1% Typone, 0.5% 효모 추출물)/세포 용해 완충액(20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.6) 및 서로 다른 농도의 NaCl 용액(각각 0, 50, 100, 170 및 300 mmol/L)에 재현탁하였다. 세균 세포 용해를 위해 펄스 모드로 초음파 처리를 적용하였다: 예를 들어, 초음파 처리기 UP400St를 사용해 진폭 100%에서 켜짐 5초, 꺼짐 10초의 듀티 사이클로 40회 반복하여 처리한 다음, 4°C에서 10 000g로 15분간 원심분리했습니다. 상등액과 침전물은 도데실황산나트륨 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석했습니다. 도데실황산나트륨으로 염색한 모든 겔은 고해상도 스캐너로 스캔했습니다. 겔 이미지는 Magic Chemi 1D 소프트웨어로 분석했습니다. 최적의 선명도를 얻기 위해 매개변수를 조정하여 단백질 밴드를 검출했습니다. 밴드 데이터는 세 번의 기술적 반복 실험에서 생성했습니다. (참조: Sun et al., 2016)

세포 공장의 산업적 세포 용해를 위한 초음파 세포 파쇄기

초음파 세포 용해 및 추출은 세포 공장에서 대사산물을 방출하는 신뢰할 수 있고 편리한 방법으로, 표적 분자의 효과적인 생산을 돕습니다. 초음파 세포 파쇄기는 실험실용부터 산업용 규모까지 제공되며, 공정은 완전히 선형적으로 규모를 확장할 수 있습니다.
Hielscher Ultrasonics는 고성능 초음파 파쇄기 분야의 전문 파트너로, 벤치탑 및 산업 환경에 초음파 시스템을 도입한 오랜 경험을 보유하고 있습니다.
정교한 하드웨어와 소프트웨어 측면에서 Hielscher Ultrasonics 세포 파쇄 시스템은 최적의 공정 제어, 간편한 조작 및 사용자 편의성을 위한 모든 요구 사항을 충족합니다. Hielscher 초음파 장비의 고객과 사용자들은 Hielscher 초음파 세포 파쇄기 및 추출기가 디지털 터치 디스플레이와 브라우저 원격 제어를 통해 정밀한 공정 모니터링과 제어를 가능하게 한다는 이점을 높이 평가합니다. 모든 주요 초음파 처리 데이터(예: 순에너지, 총에너지, 진폭, 처리 시간, 온도, 압력)는 내장 SD 카드에 CSV 파일로 자동 저장됩니다. 이는 재현성과 반복성을 갖춘 결과를 얻는 데 도움이 되며, 공정 표준화와 우수 제조 관리 기준(cGMP) 충족을 용이하게 합니다.
물론 Hielscher 초음파 프로세서는 최대 부하에서 24/7 가동하도록 제작되어 산업 생산 환경에서 안정적으로 운전할 수 있습니다. 높은 견고성과 적은 유지보수 요구로 초음파 장비의 가동 중단 시간은 매우 짧습니다. CIP(제자리 세정) 및 SIP(제자리 멸균) 기능은 수고로운 세척 작업을 최소화하며, 특히 모든 접액부가 매끄러운 금속 표면으로 되어 있어 숨겨진 구멍이나 노즐이 없습니다.

아래 표는 당사 초음파 장비의 대략적인 처리 용량을 보여줍니다: