Ultrasonic Lysis of Bioengineered Cells in Industrial Production

E. coli와 같은 생체 공학 박테리아 종과 유전자 변형 포유류 및 식물 세포 유형은 분자를 발현하기 위해 생명 공학에서 널리 사용됩니다. 이러한 합성된 생체 분자를 방출하기 위해서는 신뢰할 수 있는 세포 파괴 기술이 필요합니다. 고성능 초음파는 효율적이고 신뢰할 수있는 세포 용해를위한 입증 된 방법입니다 – 큰 처리량으로 쉽게 확장할 수 있습니다. Hielscher 초음파는 고품질의 생체 분자를 대량으로 생산하기 위해 효과적인 세포 용해를위한 고성능 초음파 장비를 제공합니다.

세포 공장에서 분자 추출

광범위한 생체 분자 생산을 위해 대장균, 바실러스 서브틸리스, 슈도모나스 푸티다, 스트렙토미세스, 코리네박테리움 글루타미쿰, 락토코커스 락티, 시아노박테리아, 맥주효모균 세레비시아에, 피키아 파스토리스, 야로키아 리폴리티카, 니코티아나 벤타미아나 및 조류를 포함한 다양한 조작된 미생물 및 식물 세포를 미생물 세포 공장으로 사용할 수 있습니다. 이러한 세포 공장은 단백질, 지질, 생화학, 폴리머, 바이오 연료 및 올레오케미컬을 생산할 수 있으며, 이들은 식품 또는 산업 응용 분야의 원료로 사용됩니다. 세포 공장으로 사용되는 세포는 폐쇄형 생물반응기에서 배양되어 높은 효율성, 특이성 및 낮은 에너지 요구 사항을 달성할 수 있습니다.
생체 공학적 세포 배양에서 표적 분자를 분리하려면 세포 내 물질이 방출되도록 세포를 파괴해야 합니다. 초음파 세포 파괴기는 세포 붕괴 및 화합물 방출을 위한 매우 신뢰할 수 있고 효율적인 기술로 잘 확립되어 있습니다.

미생물 세포 공장은 다양한 가치 있는 화합물의 합성에 사용되는 대사 공학 세포입니다. 초음파 세포 파괴는 세포 내부에서 귀중한 화합물을 방출하는 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법입니다.
연구 및 그래픽: ©Villaverde, 2010.

Ultrasonic Cell Disruptors의 장점

비열적이지만 온화하지만 매우 효율적인 기술인 초음파 교란기는 실험실 및 산업에서 세포를 용해하고 고품질 추출물을 생산하는 데 사용됩니다(예: 세포 공장에서 분자를 분리하는 데 사용).

미생물 세포 공장의 효율적인 파괴를 위한 Power-Ultrasound

Ultrasonic Cell Disruptors의 메커니즘과 효과:
초음파 세포 파괴는 초음파의 힘을 이용했습니다. 초음파 균질화 기 / 세포 교란 장치에는 약 20kHz의 고주파에서 진동하는 티타늄 합금으로 만든 프로브 (일명 sonotrode)가 장착되어 있습니다. 이것은 초음파 프로브가 초당 20,000 번의 진동을 초음파 처리 된 액체에 결합한다는 것을 의미합니다. 액체에 결합 된 초음파는 고압 / 저압 사이클이 교대로 반복되는 것이 특징입니다. 저압 사이클 동안 액체가 팽창하고 미세한 진공 기포가 발생합니다. 이 매우 작은 기포는 더 이상 에너지를 흡수할 수 없을 때까지 여러 번의 교대 압력 주기에 걸쳐 자랍니다. 이 시점에서 캐비테이션 버블은 격렬하게 붕괴되어 국부적으로 특별한 에너지 밀도가 높은 환경을 만듭니다. 이 현상은 음향 캐비테이션으로 알려져 있으며 국부적으로 매우 높은 온도, 매우 높은 압력 및 전단력을 특징으로 합니다. 이러한 전단 응력은 세포벽을 효율적으로 파괴하고 세포 내부와 주변 용매 사이의 물질 전달을 증가시킵니다. 순전히 기계적인 기술로서, 초음파로 생성된 전단력이 널리 사용되며, 이는 박테리아 세포 파괴 및 단백질 분리에 권장되는 절차입니다. 간단하고 신속한 세포 파괴 방법 인 초음파 처리는 소형, 중형 및 대형 볼륨의 분리에 이상적입니다. Hielscher의 디지털 초음파는 정확한 초음파 제어를위한 명확한 설정 메뉴를 갖추고 있습니다. 모든 초음파 처리 데이터는 내장 SD 카드에 자동으로 저장되며 간단히 액세스 할 수 있습니다. 초음파 붕괴 공정 중 외부 냉각, 펄스 모드에서의 초음파 처리 등과 같은 정교한 방열 옵션은 이상적인 공정 온도의 유지를 보장하여 추출 된 열에 민감한 화합물의 온전성을 보장합니다.

연구는 초음파 세포 파괴 및 추출의 강점을 강조합니다.

Chemat et al. (2017) 교수는 "초음파 보조 추출은 식품 및 천연 제품에 대한 기존 기술에 대한 친환경적이고 경제적으로 실행 가능한 대안"이라는 연구를 재개합니다. 주요 이점은 추출 및 처리 시간, 사용되는 에너지 및 용매의 양, 단위 작업 및 CO의 감소입니다₂ 배기가스"라고 말했다.
Gabig-Ciminska et al. (2014)은 DNA를 방출하기 위해 포자 용해를 위한 연구에서 고압 균질화기와 초음파 세포 dsintegrator를 사용했습니다. 연구팀은 두 가지 세포 파괴 방법을 비교하면서 포자 DNA에 대한 세포 용해와 관련하여 "고압 균질화의 세포 용해물을 사용하여 분석이 수행되었습니다. 그 후, 우리는 초음파 세포 파괴가 이러한 목적에 탁월한 이점이 있다는 것을 깨달았습니다. 상당히 빠르며 소량의 시료를 처리할 수 있습니다." (Gabig-Ciminska 외, 2014)

식품 생산을 위한 세포 공장의 생체 분자

미생물 세포 공장은 박테리아, 효모, 곰팡이 등과 같은 미생물 미생물의 대사 생명 공학을 통해 토착 및 비토착 대사 산물의 높은 수율을 생산하기 위해 미생물 유기체를 사용하는 실행 가능하고 효율적인 생산 방법론입니다. 예를 들어, 벌크 효소는 Aspergillus oryzae, 곰팡이 및 박테리아와 같은 미생물을 사용하여 생산됩니다. 이러한 벌크 효소는 식품 및 음료 생산뿐만 아니라 농업, 바이오 에너지 및 가정 용품에도 사용됩니다.
아세토박터 자일리눔(Acetobacter xylinum) 및 글루코나세토박터 자일리누스(Gluconacetobacter xylinus)와 같은 특정 박테리아는 발효 과정에서 셀룰로오스를 생성하며, 발효 과정에서 나노섬유는 상향식 공정으로 합성됩니다. 박테리아 셀룰로오스(미생물 셀룰로오스라고도 함)는 화학적으로 식물 셀룰로오스와 동일하지만 높은 결정성 및 고순도(리그닌, 헤미셀룰로오스, 펙틴 및 기타 생체 성분 없음)와 셀룰로오스 나노섬유 직조 3차원(3D) 망상 네트워크의 고유한 구조를 가지고 있습니다. (Zhong, 2020 참조) 식물 유래 셀룰로오스와 비교할 때 박테리아 셀룰로오스는 지속 가능성이 더 높으며 생산된 셀룰로오스는 복잡한 정제 단계가 필요하지 않은 순수합니다. NaOH 또는 SDS (소듐 도데 실 설페이트)를 사용한 초음파 및 용매 추출은 세균 세포에서 세균 셀룰로오스를 분리하는 데 매우 효과적입니다.

제약 및 백신 생산을 위한 세포 공장의 생체 분자

세포 공장에서 파생된 가장 두드러진 의약품 중 하나는 인간 인슐린입니다. 생체공학적 인슐린 생산을 위해 주로 E. coli와 Saccharomyces cerevisiae가 사용됩니다. 생합성된 나노 크기의 분자는 높은 생체 적합성을 제공하기 때문에 페리틴과 같은 생물학적 나노 입자는 수많은 바이오 제조 응용 분야에 유리합니다. 또한, 대사 공학적 미생물에서의 생산은 종종 얻어진 수율에서 훨씬 더 효과적입니다. 예를 들어, 아르테미신산, 레스베라트롤 및 리코펜의 생산은 10배에서 수백 배로 증가했으며, 이미 확립되었거나 산업 규모 생산으로 개발 중입니다. (참조: Liu et al.; 미생물. 세포 사실. 2017)
예를 들어, 페리틴 및 바이러스 유사 입자와 같은 자가 조립 특성을 가진 단백질 기반 나노 크기의 생체 분자는 병원체의 크기와 구조를 모방하고 항원의 표면 접합을 통해 면역 세포와의 상호 작용을 촉진할 수 있기 때문에 백신 개발에 특히 흥미롭습니다. 이러한 분자는 소위 세포 공장(예: 조작된 E. coli 균주)에서 발현되며, 이들은 특정 표적 분자를 생성합니다.

초음파 용해 프로토콜 및 페리틴 방출을 위한 대장균 BL21 프로토콜

페리틴(Ferritin)은 단백질이며, 주요 기능은 철분의 저장입니다. 페리틴은 백신에서 자가 조립 나노 입자로서 유망한 능력을 보여주며, 백신 전달 수단(예: SARS-Cov-2 스파이크 단백질)으로 사용됩니다. Sun et의 과학적 연구. al. (2016)은 재조합 페리틴이 낮은 NaCl 농도(≤50mmol/L)에서 대장균에서 용해성 형태로 방출될 수 있음을 보여줍니다. E. coli BL21에서 페리틴을 발현하고 페르틴을 방출하기 위해 다음과 같은 프로토콜을 성공적으로 적용하였다. 재조합 pET-28a/페리틴 플라스미드를 E coli BL21 (DE3) 균주로 형질전환시켰다. 페리틴 대장균 BL21(DE3) 세포를 37°C에서 0.5% 카나마이신으로 LB 성장 배지에서 배양하고 0.4% 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드를 0.6의 OD600으로 37°C에서 3시간 동안 유도하였다. 그런 다음 최종 배양물을 8000g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 수확하고 펠릿을 수집했습니다. 그런 다음, 펠릿을 LB 배지(1% NaCl, 1% Typone, 0.5% 효모 추출물)/용해 완충액(20mmol/L Tris, 50mmol/L NaCl, 1mmol/L EDTA, pH 7.6) 및 서로 다른 농도의 NaCl 용액(0, 50, 100, 170 및 300mmol/L)에 각각 재현탁시켰다. 박테리아 세포 용해의 경우, 초음파 처리는 펄스 모드에서 적용되었습니다 : 예를 들어, 초음파기 UP400St 100% 진폭에서 5초 ON, 10초 OFF, 40주기 동안)의 듀티 사이클로 원심분리한 다음 10,000g에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 상층액 및 침전물은 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석하였다. 모든 소듐 도데실 설페이트 염색 겔은 고해상도 스캐너로 스캔되었습니다. 겔 이미지는 Magic Chemi 1D 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. 최적의 명확성을 위해 매개변수를 조정하여 단백질 밴드를 검출했습니다. 밴드에 대한 데이터는 기술적 삼중주를 통해 생성되었습니다. (Sun et al., 2016 참조)

세포 공장의 산업적 용해를 위한 초음파 세포 교란기

초음파 용해 및 추출은 세포 공장에서 대사 산물을 방출하여 표적 분자의 효과적인 생산을 돕는 신뢰할 수 있고 편안한 방법입니다. 초음파 세포 파괴자는 실험실에서 산업 규모에 이르기까지 사용할 수 있으며 공정은 완전히 선형으로 확장할 수 있습니다.
Hielscher 초음파는 고성능 초음파 파괴자를위한 유능한 파트너이며 벤치 탑 및 산업 환경에서 초음파 시스템을 이식하는 분야에서 오랜 경험을 가지고 있습니다.
정교한 하드웨어 및 소프트웨어와 관련하여 Hielscher 초음파 세포 파괴 시스템은 최적의 공정 제어, 쉬운 작동 및 사용자 친화성에 대한 모든 요구 사항을 충족합니다. Hielscher 초음파의 고객과 사용자는 Hielscher 초음파 세포 교란 장치 및 추출기가 정확한 공정 모니터링 및 제어를 가능하게하는 이점을 높이 평가합니다 – 디지털 터치 디스플레이 및 브라우저 원격 제어를 통해. 모든 중요한 초음파 처리 데이터 (예 : 순 에너지, 총 에너지, 진폭, 지속 시간, 온도, 압력)는 통합 SD 카드에 CSV 파일로 자동 저장됩니다. 이는 재현 가능하고 반복 가능한 결과를 얻는 데 도움이 되며 공정 표준화를 촉진하고 우수제조관리기준(cGMP)을 이행하는 데 도움이 됩니다.
물론, Hielscher 초음파 프로세서는 최대 부하에서 24/7 작동하도록 제작되었으므로 산업 생산 환경에서 안정적으로 작동 할 수 있습니다. 높은 견고성과 낮은 유지 보수로 인해 초음파 장비의 가동 중지 시간이 매우 짧습니다. CIP(clean-in-place) 및 SIP(sterilize-in-place) 기능은 특히 모든 습식 부품이 매끄러운 금속 표면(숨겨진 오리피스나 노즐 없음)이기 때문에 번거로운 청소를 최소화합니다.

아래 표는 초음파기의 대략적인 처리 용량을 나타냅니다.