모유 올리고당의 생합성 생산
발효 또는 효소 반응을 통한 모유 올리고당(HMO)의 생합성은 복잡하고 소모적이며 종종 수율이 낮은 과정입니다. 초음파는 기질과 세포 공장 사이의 질량 전달을 증가시키고 세포 성장과 신진 대사를 자극합니다. 따라서 초음파 처리는 발효 및 생화학 공정을 강화하여 HMO의 생산을 가속화하고보다 효율적으로 만듭니다.
모유 올리고당
모유 글라이칸으로도 알려진 모유 올리고당(HMO)은 올리고당 그룹의 일부인 당 분자입니다. HMO의 두드러진 예로는 2'-fucosyllactose(2′-FL), 락토-N-네오테트라오스(LNnT), 3'-갈락토실락토스(3′-GL) 및 difucosyllactose (DFL).
인간의 모유는 150개 이상의 다양한 HMO 구조로 구성되어 있지만, 현재 2′-fucosyllactose(2′-FL) 및 lacto-N-neotetraose(LNnT)만이 상업적으로 생산되어 유아용 조제분유의 영양 첨가물로 사용됩니다.
모유 올리고당(HMO)은 아기 영양에서 중요한 것으로 알려져 있습니다. 모유 올리고당은 유아의 장 내에서 프리바이오틱스, 항접착 항균제 및 면역 조절제로 작용하여 뇌 발달에 실질적으로 기여하는 독특한 유형의 영양소입니다. HMO는 인간의 모유에서만 발견됩니다. 다른 포유류 우유(예: 소, 염소, 양, 낙타 등)에는 이러한 특정 형태의 올리고당이 없습니다.
모유 올리고당은 모유에서 세 번째로 풍부한 고체 성분으로, 물에 용해되거나 유화되거나 부유 형태로 존재할 수 있습니다. 유당과 지방산은 인간의 모유에서 발견되는 가장 풍부한 고형물입니다. HMO는 0.35–0.88 온스 (9.9–24.9 g)/ L의 농도로 존재하며, 대략 200개의 구조적으로 다른 모유 올리고당이 알려져 있습니다. 모든 여성의 80%에서 우세한 올리고당은 2입니다.′-약 2.5g/L의 농도로 인간의 모유에 존재하는 fucosyllactose.
HMO는 소화되지 않기 때문에 영양에 칼로리적으로 기여하지 않습니다. 소화되지 않는 탄수화물이기 때문에 프리바이오틱스로 기능하며 바람직한 장내 미생물, 특히 비피더스균에 의해 선택적으로 발효됩니다.
- 유아의 발달을 촉진합니다.
- 두뇌 발달에 중요하다
- 항염증 작용이 있고
- 위장관에서의 접착 방지 효과
- 성인의 면역 체계 지원
이 초음파 프로세서 UIP2000hdT 질량 전달을 증가시키고 HMO와 같은 생합성된 생물학적 분자의 수율을 높이기 위해 세포 공장을 활성화합니다.
인간 모유 올리고당의 생합성
세포 공장 및 효소 / 화학 효소 시스템은 HMO 합성에 사용되는 최신 기술입니다. 산업 규모의 HMO 생산을 위해 미생물 세포 공장의 발효, 생화학 합성 및 다양한 효소 반응이 HMO 바이오 생산의 실현 가능한 방법입니다. 경제적 이유로 인해 미생물 세포 공장을 통한 생합성은 현재 HMO의 산업 생산 수준에서 사용되는 유일한 기술입니다.
미생물 세포 공장을 이용한 HMO 발효
E.coli, Saccharomyces cerevisiae 및 Lactococcus lactis는 HMO와 같은 생물학적 분자의 바이오 생산에 사용되는 일반적으로 사용되는 세포 공장입니다. 발효는 미생물을 사용하여 기질을 표적 생물학적 분자로 변환하는 생화학적 과정입니다. 미생물 세포 공장은 단순당을 기질로 사용하여 HMO로 변환합니다. 단당(예: 유당)은 풍부하고 저렴한 기질이기 때문에 생합성 공정을 비용 효율적으로 유지할 수 있습니다.
성장과 생물전환율은 주로 영양분(기질)이 미생물로 대량으로 전달되는 것에 의해 영향을 받습니다. 질량 전달 속도는 발효 중 제품 합성에 영향을 미치는 주요 요인입니다. 초음파는 질량 전달을 촉진하는 것으로 잘 알려져 있습니다.
발효 중에는 세포가 가능한 한 빨리 성장하여 표적 생체 분자(예: HMO와 같은 올리고당, 인슐린, 재조합 단백질)를 생산할 수 있도록 생물반응기의 조건을 지속적으로 모니터링하고 조절해야 합니다. 이론적으로, 세포 배양이 성장하기 시작하자마자 산물 형성이 시작됩니다. 그러나 특히 조작된 미생물과 같은 유전자 변형 세포에서는 일반적으로 기질에 화학 물질을 첨가하여 나중에 유도되며, 이는 표적 생체 분자의 발현을 상향 조절합니다. 초음파 생물 반응기 (sono-bioreactor)는 정밀하게 제어 할 수 있으며 미생물의 특정 자극을 허용합니다. 그 결과 생합성이 가속화되고 수율이 높아집니다.
초음파 용해 및 추출: 복잡한 HMO의 발효는 낮은 발효 역가와 세포 내에 남아 있는 산물에 의해 제한될 수 있습니다. 초음파 용해 및 추출은 정제 및 다운스트림 공정 전에 세포 내 물질을 방출하는 데 사용됩니다.
초음파로 촉진된 발효
Escherichia coli, engineered E.coli, Saccharomyces cerevisiae 및 Lactococcus lactis와 같은 미생물의 성장 속도는 제어 된 저주파 초음파를 적용하여 질량 전달 속도와 세포벽 투과성을 증가시킴으로써 가속화 될 수 있습니다. 온화한 비열 처리 기술로서, 초음파는 발효 국물에 순전히 기계적 힘을 가합니다.
음향 캐비테이션 (Acoustic Cavitation) : 초음파 처리의 작동 원리는 음향 캐비테이션을 기반으로합니다. 초음파 프로브 (sonotrode)는 저주파 초음파를 매체에 결합합니다. 초음파는 액체를 통해 이동하여 교대로 고압(압축) / 저압(희박) 사이클을 생성합니다. 교대로 액체를 압축하고 늘리면 미세한 진공 기포가 발생합니다. 이 작은 진공 기포는 더 이상 에너지를 흡수할 수 없는 크기에 도달할 때까지 여러 주기에 걸쳐 자랍니다. 이 최대 성장 지점에서 진공 기포는 격렬하게 붕괴하고 캐비테이션 현상으로 알려진 국부적으로 극한 조건을 생성합니다. 캐비테이션 "핫스팟"에서는 높은 압력 및 온도 차이와 최대 280m/sec의 액체 제트를 통한 강한 전단력을 관찰할 수 있습니다. 이러한 캐비테이션 효과에 의해, 철저한 질량 전달 및 초음파 형성(세포벽과 세포막의 천공)이 이루어집니다. 기질의 영양소는 살아있는 전체 세포로 그리고 세포 내부로 떠다니기 때문에 세포 공장에 최적으로 영양이 공급되고 성장 및 전환율이 가속화됩니다. 초음파 생물 반응기는 단일 냄비 생합성 공정에서 바이오매스를 처리하는 간단하지만 매우 효과적인 전략입니다.
정확하게 제어되고 온화한 초음파 처리는 발효 과정을 강화하는 것으로 잘 알려져 있습니다.
초음파 처리는 "기질 흡수의 향상, 세포 다공성을 증가시킴으로써 생산 또는 성장을 촉진하고, 세포 구성 요소의 방출을 잠재적으로 향상시킴으로써 살아있는 세포를 포함하는 많은 생물 공정의 생산성"을 향상시킵니다. (Naveena 외. 2015)
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- 수율 증가
- 가속 발효
- 세포 특이적 자극
- 향상된 기판 흡수
- 세포 다공성 증가
- 간편한 작동
- 금고
- 간단한 레트로 피팅
- 리니어 스케일업
- 배치 또는 InIine 처리
- 빠른 ROI
Naveena et al. (2015)은 초음파 강화가 다른 강화 처리 옵션에 비해 낮은 운영 비용, 작동의 단순성 및 적당한 전력 요구 사항을 포함하여 바이오 공정 중에 여러 가지 이점을 제공한다는 것을 발견했습니다.
고성능 초음파 발효 반응기
발효 과정에는 세포 공장 역할을 하는 박테리아나 효모와 같은 살아있는 미생물이 포함됩니다. 초음파 처리는 질량 전달을 촉진하고 미생물의 성장과 전환율을 높이기 위해 적용되지만, 세포 공장의 파괴를 피하기 위해 초음파 강도를 정확하게 제어하는 것이 중요합니다.
Hielscher 초음파는 고성능 초음파를 설계, 제조 및 유통하는 전문가로, 우수한 발효 수율을 보장하기 위해 정밀하게 제어하고 모니터링 할 수 있습니다.
공정 제어는 높은 수율과 우수한 품질에 필수적일 뿐만 아니라 결과를 반복하고 재현할 수 있도록 합니다. 특히 세포 공장의 자극에 관해서는 높은 수율을 달성하고 세포 분해를 방지하기 위해 초음파 처리 매개 변수의 세포 별 적응이 필수적입니다. 따라서 Hielscher 초음파의 모든 디지털 모델에는 지능형 소프트웨어가 장착되어있어 초음파 매개 변수를 조정, 모니터링 및 수정할 수 있습니다. 진폭, 온도, 압력, 초음파 처리 기간, 듀티 사이클 및 에너지 입력과 같은 초음파 공정 매개 변수는 발효를 통해 HMO 생산을 촉진하는 데 필수적입니다.
Hielscher 초음파의 스마트 소프트웨어는 통합 SD 카드에 모든 중요한 프로세스 매개 변수를 자동으로 기록합니다. 초음파 처리 공정의 자동 데이터 기록은 GMP (Good Manufacturing Practices)에 필요한 공정 표준화 및 재현성 / 반복성의 기초입니다.
발효를 위한 초음파 Rectors
Hielscher는 다양한 크기, 길이 및 형상의 초음파 프로브를 제공하며, 이는 배치 및 연속 플로우 스루 처리에 사용할 수 있습니다. 소노 생물 반응기라고도하는 초음파 반응기는 작은 실험실 샘플에서 파일럿 및 완전 상업 생산 수준에 이르기까지 초음파 생물 공정을 포괄하는 모든 용량에 사용할 수 있습니다.
반응 용기에서 초음파 sonotrode의 위치가 매체 내의 캐비테이션 및 마이크로 스트리밍의 분포에 영향을 미친다는 것은 잘 알려져 있습니다. Sonotrode 및 초음파 반응기는 세포 육수의 처리량에 따라 선택해야합니다. 초음파 처리는 배치 및 연속 모드로 수행 할 수 있지만 대량 생산의 경우 연속 흐름 설치를 사용하는 것이 좋습니다. 초음파 플로우 셀을 통과하면 모든 세포 매체가 초음파 처리에 정확히 동일하게 노출되어 가장 효과적인 치료를 보장합니다. Hielscher 초음파의 광범위한 초음파 프로브 및 플로우 셀 반응기는 이상적인 초음파 생물 처리 설정을 조립 할 수 있습니다.
Hielscher Ultrasonics – 실험실에서 파일럿, 생산에 이르기까지
Hielscher 초음파는 샘플 준비를위한 소형 휴대용 초음파 균질화기, 벤치 탑 및 파일럿 시스템뿐만 아니라 시간당 트럭 적재량을 쉽게 처리 할 수있는 강력한 산업용 초음파 장치를 제공하는 초음파 장비의 전체 스펙트럼을 다룹니다. 설치 및 장착 옵션이 다양하고 유연하기 때문에 Hielscher 초음파기는 모든 종류의 배치 반응기, 유가 배치 또는 연속 플로우 스루 설정에 쉽게 통합 될 수 있습니다.
다양한 액세서리와 맞춤형 부품을 통해 초음파 설정을 공정 요구 사항에 이상적으로 적용할 수 있습니다.
까다로운 조건에서 최대 부하와 중부하 상태에서 24/7 작동을 위해 제작 된 Hielscher 초음파 프로세서는 신뢰할 수 있으며 유지 보수가 거의 필요하지 않습니다.
아래 표는 초음파기의 대략적인 처리 용량을 나타냅니다.
| 배치 볼륨(Batch Volume) | 유량 | 권장 장치 |
|---|---|---|
| 1 내지 500mL | 10 내지 200mL/분 | 업100H |
| 10 내지 2000mL | 20 내지 400mL/분 | UP200HT, UP400ST |
| 0.1 내지 20L | 0.2 내지 4L/min | UIP2000hdT 님 |
| 10에서 100L | 2 내지 10L/min | UIP4000hdt 님 |
| N.A. 개시 | 10 내지 100L/min | UIP16000 |
| N.A. 개시 | 큰 | 의 클러스터 UIP16000 |
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문헌 / 참고문헌
- Muschiol, Jan; Meyer, Anne S. (2019): A chemo-enzymatic approach for the synthesis of human milk oligosaccharide backbone structures. Zeitschrift für Naturforschung C, Volume 74: Issue 3-4, 2019. 85-89.
- Birgitte Zeuner, David Teze, Jan Muschiol, Anne S. Meyer (2019): Synthesis of Human Milk Oligosaccharides: Protein Engineering Strategies for Improved Enzymatic Transglycosylation. Molecules 24, 2019.
- Yun Hee Choi, Bum Seok Park, Joo‐Hyun Seo, Byung‐Gee Ki (2019): Biosynthesis of the human milk oligosaccharide 3‐fucosyllactose in metabolically engineered Escherichia coli via the salvage pathway through increasing GTP synthesis and β‐galactosidase modification. Biotechnology and Bioengineering Volume 116, Issue 12. December 2019.
- Balakrishnan Naveena, Patricia Armshaw, J. Tony Pembroke (2015): Ultrasonic intensification as a tool for enhanced microbial biofuel yields. Biotechnology of Biofuels 8:140, 2015.
- Shweta Pawar, Virendra K. Rathod (2020): Role of ultrasound in assisted fermentation technologies for process enhancements. Preparative Biochemistry & Biotechnology 50(6), 2020. 1-8.
알아 둘 만한 가치가 있는 사실
세포 공장을 이용한 생합성
미생물 세포 공장은 미생물 세포를 생산 시설로 활용하는 생명 공학의 한 방법입니다. 미생물을 유전적으로 조작하여 박테리아, 효모, 곰팡이, 포유류 세포 또는 조류와 같은 미생물의 DNA를 변형시켜 미생물을 세포 공장으로 만듭니다. 세포 공장은 기질을 가치 있는 생물학적 분자로 변환하는 데 사용되며, 이는 예를 들어 식품, 제약, 화학 및 연료 생산에 사용됩니다. 세포 공장 기반 생합성의 다양한 전략은 천연 대사 산물의 생산, 이종 생합성 경로의 발현 또는 단백질 발현을 목표로 합니다.
세포 공장은 천연 대사 산물을 합성하거나, 이종 생합성 경로를 발현하거나, 단백질을 발현하는 데 사용할 수 있습니다.
천연 대사 산물의 생합성
천연 대사 산물은 세포 공장으로 사용되는 세포가 자연적으로 생산하는 생물학적 분자로 정의됩니다. 세포 공장은 이러한 생물학적 분자를 세포 내에서 또는 분비된 물질로 생산합니다. 후자는 표적 화합물의 분리 및 정제를 용이하게 하기 때문에 선호됩니다. 천연 대사 산물의 예로는 아미노산 및 핵산, 항생제, 비타민, 효소, 생체 활성 화합물 및 세포의 동화 경로에서 생성된 단백질이 있습니다.
Heterologus 생합성 경로
흥미로운 화합물을 생산하려고 할 때 가장 중요한 결정 중 하나는 기본 호스트에서 생산을 선택하고 이 호스트를 최적화하거나 다른 잘 알려진 호스트로 경로를 전송하는 것입니다. 원래 숙주를 산업 발효 공정에 적응시킬 수 있고 그렇게 하는 데 건강 관련 위험(예: 독성 부산물 생산)이 없는 경우, 이는 선호되는 전략이 될 수 있습니다(예: 페니실린의 경우). 그러나 현대의 많은 사례에서 산업적으로 선호되는 셀 공장 및 관련 플랫폼 프로세스를 사용할 수 있는 잠재력이 경로 전달의 어려움보다 더 큽니다.
단백질 발현
단백질의 발현은 상동 및 이종 방법을 통해 달성 될 수 있습니다. 상동 발현에서는 유기체에 자연적으로 존재하는 유전자가 과도하게 발현됩니다. 이러한 과발현을 통해 특정 생물학적 분자의 더 높은 수율을 생성할 수 있습니다. 이종 발현의 경우, 특정 유전자가 숙주 세포로 전달되는데, 그 이유는 해당 유전자가 자연적으로 존재하지 않기 때문입니다. 세포 공학과 재조합 DNA 기술을 사용하여 유전자를 숙주의 DNA에 삽입하여 숙주 세포가 자연적으로 생산하지 않는 단백질을 (대량) 생산합니다. 단백질 발현은 박테리아(예: E. coli 및 Bacillis subtilis), 효모(예: Klyuveromyces lactis), Pichia pastoris, S. cerevisiae, 사상균(예: A. niger) 및 포유류 및 곤충과 같은 다세포 유기체에서 유래한 세포의 다양한 숙주에서 이루어집니다. Innumermerous 단백질은 벌크 효소, 복합 바이오 의약품, 진단 및 연구 시약을 포함하여 상업적으로 큰 관심을 받고 있습니다. (A.M. Davy et al. 2017 참조)