고상 펩타이드 합성 – 초음파 처리로 효율 향상
고상 펩타이드 합성(SPPS)은 펩타이드 합성에 일반적으로 사용되는 방법입니다. 초음파 처리는 고상 펩타이드 합성을 강화하는 신뢰할 수 있는 도구로, 라세미화 없이 더 높은 수율과 향상된 순도를 제공하고 반응 속도를 크게 높입니다. Hielscher Ultrasonics는 펩타이드 합성, 절단 및 용해를 위한 다양한 초음파 솔루션을 제공합니다.
초음파 고상 펩타이드 합성
초음파 처리는 이미 유기 합성에서 반응 강화 방법으로 널리 사용되고 있으며, 반응 시간의 대폭 단축, 더 높은 수율, 부산물 감소, 다른 방법으로는 구현할 수 없는 반응 경로의 개시 및/또는 더 나은 선택성과 같은 장점으로 잘 알려져 있습니다. 펩타이드 합성 반응에 초음파를 전달할 때도 큰 이점을 얻을 수 있습니다. 연구 결과에 따르면 초음파 보조 펩타이드 합성은 짧은 반응 시간 내에 라세미화 없이 고순도 펩타이드를 최적화된 수율로 얻을 수 있게 합니다.
- 높은 펩타이드 수율
- 현저히 빠른 합성
- 더 높은 펩타이드 순도
- 라세미화 없음
- 다양한 펩타이드의 병렬 합성
- 어떤 부피로든 규모 확장 가능
펩타이드 합성을 개선하기 위해 여러 반응 용기를 균일하게 초음파 처리하는 초음파 cuphorn.
Merrifield 고상 펩타이드 합성을 보여 주는 도식. 초음파 처리는 합성 반응을 촉진하고 강화하는 데 사용되며, 합성된 펩타이드를 수지에서 절단하는 데도 사용됩니다.
도식: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| 연구 | 연구 대상 펩타이드 | 반응 시간(기존 방식 대비 US-SPPS) | 조생성물 순도(기존 방식 대비 US-SPPS) | 라세미화 및 부반응 | 주요 결과 |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-엔케팔린, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-엔도르핀 | 600–1920 min → 48–284 min | 24.2–71.3% → 60.6–89.9% | 70°C에서도 Cys/His의 라세미화가 관찰되지 않음 | 약 7–12배 빠른 합성; 특히 TAT와 같이 응집되기 쉬운 서열에서 순도가 크게 향상됨. |
| Silva et al. (2021) | Pep1(12량체), Pep2(9량체), Pep3(25량체) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (초음파만 사용) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | 시험하지 않음; Pep2에서 약간의 순도 저하가 확인됨 | Pep1의 소요 시간이 14배 단축됨; 조생성물 수율이 크게 증가함. |
| Merlino et al. (2019) | 모델 펜타펩타이드, 최대 44량체 펩타이드, “합성이 어려운 서열”(Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (모델) | 84% → 93% (모델); 열 가열(~45°C) 시보다 현저히 높은 순도 | Cys/His 거울상 이성질체의 유의한 증가 없음 | 합성이 어렵거나 응집되기 쉬운 서열에 매우 효과적임; 높은 순도를 유지하면서 시약의 과량 사용을 줄일 수 있음. |
초음파로 개선된 고상 펩타이드 합성
고상 펩타이드 합성(SPPS)은 불용성 다공성 지지체 위에서 아미노산 유도체의 연속적인 반응을 통해 펩타이드 사슬을 조립하는 화학 반응입니다. 그러나 기존의 고상 펩타이드 합성은 비교적 비효율적이고 느린 공정입니다. 따라서 초음파를 통한 펩타이드 합성 강화는 펩타이드를 더욱 효과적이고 신속하게 합성하기 위한 수단으로 높이 평가받고 있습니다.
Silva et al. (2021)은 세 가지 펩타이드, 즉 섬유아세포 성장인자 수용체 3(FGFR3) 특이적 펩타이드인 Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2)과 새로운 펩타이드인 Pep2 (RQMATADEA-NH2) 및 Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2)의 제조를 바탕으로 “고전적” 플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc) 고상 펩타이드 합성(SPPS)과 초음파(US) 보조 SPPS를 비교했습니다.
US 보조 SPPS는 “고전적” 방법에 비해 펩타이드 조립에서 14배(Pep1) 및 4배(Pep2)의 시간 단축 효과를 보였습니다. 흥미롭게도 초음파 보조 SPPS는 “고전적” SPPS(73%)보다 더 높은 순도(82%)의 Pep1을 생성했습니다. 연구팀은 상당한 시간 단축과 함께 높은 조펩타이드 순도를 달성한 데 힘입어, 소수성 아미노산과 동일 잔기의 올리고 서열이 다수 포함된 대형 펩타이드 Pep3에 US 보조 SPPS를 적용했습니다. 주목할 만하게도, 이 25량체 펩타이드는 6시간 미만(347 min)에 중간 수준의 순도(약 49%)로 합성되었습니다.
초음파 교반을 이용한 고상 펩타이드 합성으로 더욱 빠른 펩타이드 합성.
(연구 및 분석: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019)도 Fmoc 기반 고상 펩타이드 합성에 대한 초음파의 영향을 포괄적으로 연구했으며, 이를 통해 재료와 반응 시간을 크게 절감하면서 다양한 생리활성 펩타이드(최대 44량체)를 합성할 수 있었습니다. 연구진은 초음파 처리가 주요 부반응을 악화시키지 않고 “합성이 어려운 서열”을 가진 펩타이드의 합성을 개선함을 입증하여, 초음파로 촉진하는 고상 펩타이드 합성(US-SPPS)을 현재의 고효율 펩타이드 합성 전략 중 하나로 자리매김하게 했습니다.
펩타이드의 초음파 합성을 위한 고성능 시스템을 이용하면 합성 속도를 크게 높이고 미정제 생성물의 순도를 향상시킬 수 있습니다. (참조: Wołczański et al., 2019)
라세미화 조사. 실온에서 고전적 방법을 사용하여 수동으로 합성한 모델 펩타이드와 고온에서 초음파 방법으로 합성한 모델 펩타이드의 주요 1H NMR 스펙트럼 비교. His 및 Cys의 α-양성자와 Acm의 메틸렌기(왼쪽 패널), Val의 ɣ-메틸 양성자(오른쪽 패널)의 화학적 이동은 70°C에서의 초음파 처리가 라세미화를 일으키지 않음을 보여줍니다.
(연구 및 분석: Wołczański et al., 2019)
초음파를 이용한 펩타이드 절단
고상 펩타이드 합성(SPPS) 후에는 합성된 펩타이드를 고분자 수지에서 절단하여 분리해야 합니다. 이 단계는 탈보호라고도 합니다. 수지에서 펩타이드를 절단하는 데 일반적인 진탕과 초음파 처리를 비교하면, 진탕법에는 약 1시간이 필요한 반면 초음파 절단은 15–20 min 내에 완료할 수 있습니다. 초음파 펩타이드 절단은 벤질 에스터 결합을 통해 폴리스티렌 수지에 연결된 보호된 아미노산과 펩타이드의 절단에 적용할 수 있습니다.
폴리스티렌 수지에서 초음파로 펩타이드를 절단하면 신속한 절차로 라세미화 없이 고순도 펩타이드를 높은 수율로 얻을 수 있습니다.
(연구 및 도식: ©Anuradha and Ravindranath, 1995)
펩타이드 합성을 개선하고 가속하기 위한 초음파 교반 반응기. 사진에 표시된 장치는 초음파 처리기 UP200St이며, 교반식 유리 반응기에 설치되어 있습니다.
펩타이드 합성을 위한 고성능 초음파 처리기
Hielscher Ultrasonics는 직접 및 간접 초음파 처리를 위한 다양한 초음파 솔루션을 제공합니다. 강력하고 정밀하게 제어할 수 있는 초음파 프로세서는 반응 용기에 정확히 알맞은 양의 초음파 에너지를 공급합니다. 합성 용기로 주사기, 튜브, 멀티웰 플레이트 또는 유리 반응기 중 무엇을 사용하든, Hielscher Ultrasonics는 해당 펩타이드 응용 분야에 가장 적합한 초음파 장치를 제공합니다.
- 맞춤형 펩타이드
- 대규모 펩타이드 생산
- 펩타이드 라이브러리
많은 펩타이드 합성은 주사기(예: 프릿이 장착된 주사기 반응기)에서 수행됩니다. Hielscher의 초음파 주사기 교반기는 주사기 벽을 통해 액체 내부로 초음파를 전달하여 펩타이드 용액을 초음파 처리합니다. 초음파 주사기 교반기는 초음파 보조 펩타이드 합성에 사용되는 가장 인기 있는 초음파 솔루션 중 하나입니다.
초음파 cuphorn은 최대 5개의 반응 용기를 초음파 처리하는 데 적합한 도구이며, VialTweeter는 최대 열 개의 반응 튜브를 수용할 수 있고 클램프온 액세서리를 통해 더 큰 용기 다섯 개를 추가로 장착할 수 있습니다.
Merrifield 또는 Kamysz 고상 반응기와 같은 다른 유형의 반응기 및 기타 폴리프로필렌 또는 붕규산 유리 용기와 반응기를 위해, Hielscher는 맞춤형 클램프온 장착부 또는 플랜지를 갖춘 간접 및 직접 초음파 처리용 장치를 제공합니다.
물론 용액상 합성 등에 사용되는 더 큰 교반식 유리 반응기에도 크기에 관계없이 초음파 프로브(소노트로드 또는 초음파 혼이라고도 함)를 손쉽게 장착할 수 있습니다.
- 다양한 초음파 장치 유형
- 직접 및 간접 초음파 처리
- 정밀한 강도 제어
- 정밀한 온도 제어
- 연속 또는 펄스 초음파
- 스마트 기능, 프로그래밍 가능한 장치
- 모든 용량에 사용 가능
- 선형 확장성
멀티웰/마이크로타이터 플레이트에서 수행하는 고상 펩타이드 합성에는 UIP400MTP가 이상적인 장치입니다. 초음파 캐비테이션이 수많은 시료 웰에 간접적으로 균일하게 전달되어 우수한 물질 전달과 합성 반응을 가능하게 합니다. 아래 동영상에서 마이크로플레이트 초음파 처리 장치 UIP400MTP가 작동하는 모습을 확인하세요!
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Hielscher Ultrasonics는 실험실, 파일럿 및 산업 규모의 혼합 응용, 분산, 유화 및 추출을 위한 고성능 초음파 균질기를 제조합니다.
초음파 펩타이드 합성에 관해 알아두면 좋은 사실
펩타이드란 무엇인가요?
펩타이드는 여러 아미노산이 펩타이드 결합이라고 하는 아미드 결합으로 연결된 화합물입니다. 복잡한 구조로 결합하면 – 일반적으로 50개 이상의 아미노산으로 구성됨 – 이러한 큰 펩타이드 구조를 단백질이라고 합니다. 펩타이드는 생명체의 필수 구성 요소이며 체내에서 수많은 기능을 수행합니다.
펩타이드 합성은 어떻게 이루어지나요?
유기화학, 분자생물학 및 생명과학에서 펩타이드 합성은 펩타이드를 생산하는 과정입니다. 펩타이드는 한 아미노산의 카르복실기와 다른 아미노산의 아미노기 사이의 축합 반응을 통해 화학적으로 합성됩니다. 다양한 아미노산 곁사슬에서 원치 않는 부반응이 일어나는 것을 방지하기 위해 일반적으로 보호기를 사용하는 전략을 적용합니다.
화학적(시험관 내) 펩타이드 합성은 대부분 새로 도입되는 아미노산의 카르복실기(C-말단)를 성장 중인 펩타이드 사슬의 N-말단에 결합시키는 것으로 시작합니다. 이러한 C-to-N 합성과는 달리, 생물체 내에서 긴 펩타이드의 자연적인 단백질 생합성은 반대 방향으로 진행됩니다. 이는 생합성에서 새로 도입되는 아미노산의 N-말단이 단백질 사슬의 C-말단에 연결된다는 뜻입니다(N-to-C).
펩타이드 합성을 위한 대부분의 연구 개발 프로토콜은 고상법을 기반으로 하는 반면, 용액상 합성법은 대규모 산업적 펩타이드 생산에 사용됩니다.
현재 펩타이드 합성의 최첨단 기술은 무엇인가요?
SUS-SPPS(지속 가능한 초음파 보조 SPPS)는 공정을 주기당 단 두 단계(결합/캡핑/탈보호 통합 단계 + 한 차례의 세척)로 줄여 용매 소비량과 소요 시간을 크게 줄이는 것으로 입증되었습니다. (참조: Mottola et al., 2025)
초음파 보조 TAPS는 전합성(예: lipobactin)에서 성공이 입증된 새로운 조합이며, 위탁개발생산기관(CDMO)에서 원료의약품(API) 제조에 활용하기 위해 연구하고 있습니다.
초음파 보조 TAGGING 펩타이드 합성의 장점을 알아보세요!
연속 공정은 추가적인 개선 방안으로 연구되고 있으며, 실릴화 태그를 이용한 연속 원팟 합성 플랫폼이 보고되었습니다.
이 분야는 친환경 화학 원칙을 지향하고 있으며, 초음파와 TAPS 모두 용매 사용량 감소, 시약 투입량 감소 및 지속가능성 향상에 기여하고 있습니다.
문헌 / 참고문헌
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics는 실험실 규모부터 산업 규모까지 고성능 초음파 균질기를 제조합니다.