초음파는 플라스미드 DNA를 단편화하는 신뢰할 수있는 기술입니다. 정밀하게 제어 가능한 진폭, 맥동 모드 및 온도 제어는 손상되지 않는 플라스미드 단편화를위한 초음파 발생기의 가장 중요한 기능입니다. 추가적으로, 특정 제제의 사용은 플라스미드 분해로부터 보호하는 데 도움이 된다. Hielscher 초음파는 단일 바이알에서 제어 플라스미드 단편화, 동시에 수많은 샘플의 초음파 처리 및 다중 웰 플레이트를위한 다양한 솔루션을 제공합니다. 성공적인 초음파 플라스미드 단편화에 대해 자세히 알아보십시오!

초음파를 이용한 플라스미드 전단

DNA 샘플이 초음파를 받으면 초음파로 생성 된 진동은 기계적 힘을 통해 고분자량 DNA 분자를 전단하거나 깨뜨리는 액체에 음향 캐비테이션을 만듭니다. 초음파 처리는 크로마틴 면역 침전 (ChIP)과 같은 응용 프로그램을 포함한 벌크 DNA 전단 실험에 가장 널리 사용되는 방법으로, 작은 조각 크기가 고해상도를 얻는 데 절대적으로 중요합니다. (Tseng et al., 2012 참조)
플라스미드 DNA (pDNA)는 고리 모양을 특징으로하는 DNA의 특정 형태이며 박테리아 및 일부 진핵 생물에서 발견됩니다.
Supercoiled pDNA는 자동화된 시퀀싱 및 트랜스펙션과 같은 하류 공정에서 최상의 결과를 보여주기 때문에 플라스미드 DNA의 원하는 형태입니다. 초음파는 수퍼 코일 된 pDNA를 포함하여 pDNA를 성공적으로 단편화하는 데 적합합니다.
Thompson et al. (2008)은 수퍼 코일 DNA를 단편화하는 것으로 알려진 플라스미드 초음파 처리가 Beckman Coulter의 제어 주형 또는 효소적으로 선형화 된 플라스미드와 크게 다르지 않을 정도로 서열 phred20 판독 길이를 향상시키는 효과적인 방법임을 입증했습니다.

플라스미드 벡터의 사용

플라스미드는 종종 유전자를 복제, 전달 및 조작하는 도구로 사용됩니다. 플라스미드가 이러한 목적을 위해 실험적으로 사용될 때, 이들은 벡터라고 불린다. DNA 단편 또는 유전자는 플라스미드 벡터에 삽입되어 소위 재조합 플라스미드를 만들 수 있다. 플라스미드 벡터는 재조합 DNA를 숙주 세포로 구동시키는 비히클로 사용되며 분자 클로닝의 핵심 구성 요소입니다.
“비-바이러스 벡터는 다양한 복잡한 질병을 치료하기 위한 유전자 요법에서의 그들의 잠재적인 사용을 위해 광범위하게 연구되고 있다. 비바이러스 벡터는 물리적, 화학적, 효소적 분해로부터 플라스미드 DNA를 보호하고 DNA 분자를 표적 부위로 전달한다. 예를 들어, 양이온성 리포솜, 키토산 및 기타 양전하를 띤 나노입자는 정전기적 상호작용을 통해 플라스미드 DNA와 복합체를 형성한다. 그러나 쉽게 형성된 양이온성 리포솜/플라스미드 DNA 복합체는 상대적으로 크고(즉, 300-400nm) 본질적으로 이질적이어서 제약 용도에 사용하기가 어렵습니다. 크고 이질적인 플라스미드 DNA/리포솜, 플라스미드 DNA/에어로졸 및 플라스미드 DNA/펩티드 복합체는 초음파를 사용하여 더 작고 균질한 입자로 환원될 수 있다.” (Sarker et al., 2019)
플라스미드 벡터의 사용에 대한 두드러진 예는 CRISPR-Cas9이다. CRISPR-Cas9 시스템은 일반적으로 표적 서열, CRISPR 가이드 및 Cas9를 인코딩하는 단일 대형 플라스미드 또는 여러 개의 작은 플라스미드로 세포에 전달됩니다.

나노 침전에 의한 DNA 로딩 PLGA 나노 입자의 초음파 제조

Jo et al. (2020)은 모델 CRISPR-Cas9 플라스미드를 일차 골수 유래 대식 세포로 전달하기위한 나노 입자 담체를 형성하기 위해 폴리 (락틱 - 코-글리콜산) (PLGA)를 사용했습니다. PLGA 나노입자의 나노침전을 위해, 양전하를 띤 아민 말단 캡이 DNA의 음전하를 띤 백본과 그것 사이의 전하 상호작용으로 인해 캡슐화 효율 및 로딩을 증가시킨다는 목적으로 두 개의 상이한 말단기(에스테르 및 아민 그룹)를 갖는 PLGA를 사용하였다. 50 mL 폴리프로필렌 원뿔형 원심분리 튜브에서, 100 mg 플루로닉 F127을 20 mL 오토클레이브 DI 물에 용해시키고 와류 혼합한 다음, 초음파 배쓰를 사용하여 30분간 온화한 초음파 처리(컵혼 참조). 오토클레이브 마그네틱 교반 바를 첨가하고, 용액을 600RPM에서 30분 동안 혼합하면서 다른 용액이 만들어졌다. 플라스틱 랩웨어는 DNA의 비특이적 흡착을 최소화하기 위해 유리 제품 대신 사용되었습니다. DMF (44.48 mg / ml)에 용해 된 PLGA의 용액과 THF (0.667 mg / ml)에 용해 된 TIPS 펜타센을 별도로 만들었습니다. PLGA는 30 분 동안 초음파 처리되기 전에 30 분 동안 DMF에서 습윤되도록 정지 상태로 방치되었다 (전체 프로토콜은 Jo et al., 2020 참조)

초음파 처리 중 플라스미드 DNA 보호

플라스미드 및 슈퍼코일된 플라스미드를 포함하는 DNA는 매우 민감한 분해이다. 이용가능한 모든 단편화 방법은 특정 단점에 대해 공지되어 있다. 초음파 DNA 단편화는 보호 조치와 함께 제어 된 초음파 처리가 DNA 가닥의 전단 및 열로 인한 손상을 줄일 수 있기 때문에 선호되는 방법 중 하나입니다.
초음파 DNA 전단 중 낮은 진폭 설정, 맥동 모드 및 온도 제어 외에도 특정 약제의 사용은 DNA 분해에 대해 상당한 보호 효과를 나타냈다. 예를 들어, 다양한 중합체, 펩티드 및 지질은 초음파 처리 동안 플라스미드 DNA를 보호한다.

초음파 전단 응력에 대한 플라스미드 DNA 및 플라스미드 DNA/IL 나노복합체의 안정성은 아가로스 겔 전기영동 분석을 사용하여 조사되었다. 플라스미드 DNA와 플라스미드 DNA/IL 나노복합체 둘 다 상이한 시점들에 대해 초음파 전단 응력을 받았다. 플라스미드 DNA를 0, 10, 20, 30, 및 40분 동안 초음파 전단 응력에 노출시켰다. 그러나, 플라스미드 DNA/IL 나노복합체는 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 및 120분 동안 초음파 전단 응력에 노출되었다.
(연구 및 사진: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019)는 플라스미드 DNA / 이온성 액체 (pDNA/IL) 나노 구조체가 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 및 120 분 동안 초음파 전단 스트레스를 받고 시판되는 양이온성 유전자 전달제 인 리포펙타민과 복합체화되었을 때 형광 양성 세포의 비율이 80 %, 98 %, 97 %, 85 %, 78 %, 65 %, 각각 65% 및 50%입니다(아래 차트 참조). 형광 양성 세포의 백분율은 나노구조체가 10분 및 20분 동안 초음파 전단 응력을 가했을 때 증가하였고, 그 후 천천히 감소하였다.

COS7 세포로의 플라스미드 DNA의 전달에 대한 이온성 액체 [Bmim][PF6]의 영향. 플라스미드 DNA/IL(이온성 액체) 나노복합체를 최대 120분 동안 초음파 전단 응력을 가하고 COS7 세포 내로 전달하기 전에 LA와 복합체화하였다. 데이터는 10개의 상이한 현미경 필드에서 계수된 GFP 양성 HeLa 세포의 평균 수(%)를 보여주고, 실험은 세 개의 상이한 날에 여러 번 수행되었다. (연구 및 차트 : ©Sarker et al., 2019)

초음파 용해물 준비

초음파 세포 용해 프로토콜
세포 분리 방법 (예를 들어, 면역자기 세포 분리, 형광-활성화 세포 분류 (FACS), 밀도 구배 원심분리, 면역밀도 세포 분리)를 통해 제조되었던 세포의 농축된 샘플로 시작하였다.
세포 샘플은 실험 목표 및 프로브 형 초음파 발생기에 적합한 용해 완충액의 부피를 표시해야합니다.
hypotonic 버퍼는 초음파 세포 용해를 향상시키기 때문에 선호됩니다. 첨가제와 염 농도가 적절한 방식으로 사용되는 것이 중요합니다.
초음파 용해 장치 선택: 바이알의 간접 초음파 처리를 위해서는 VialTweeter 또는 CupHorn을 사용하는 것이 좋습니다. 멀티 웰 플레이트의 경우 UIP400MTP가 이상적인 초음파 발생기입니다. 그리고 고전적인 프로브 형 초음파 처리, 마이크로 팁이있는 UP100H 또는 UP200Ht로서의 초음파 균질 기가 가장 적합합니다.
프로브 유형 초음파 처리를위한 프로토콜 : 초음파 발생기 프로브를 마이크로 원심분리 튜브에 샘플 부피에 넣고 약 10 초 동안 초음파 처리합니다. DNA 샘플에 따라, 초음파 처리는 하나 또는 두 번 더 반복 될 수 있습니다. 필요한 초음파 에너지 입력 (Ws / mL)은 샘플 점도 및 DNA 유형에 따라 다릅니다. 초음파의 얼음 욕조와 맥동 모드를 통해 냉각하면 샘플이 열적으로 분해되는 것을 방지하는 데 도움이됩니다.
초음파 용해 후, 샘플을 원심분리하여 펠릿 파편 (용해되지 않은 세포, 핵 및 용해되지 않은 소기관 포함)을 분리합니다.
샘플이 즉시 추가로 처리되지 않으면, 그의 생존력을 보존하기 위해 적절한 온도에서 저장될 수 있다.

DNA 단편화를위한 초음파 장치

Hielscher 초음파는 DNA, RNA 및 크로마틴 단편화를 위한 다양한 초음파 기반 플랫폼을 제공합니다. 이러한 다양한 플랫폼에는 초음파 프로브(sonotrodes), 여러 튜브 또는 다중 웰 플레이트(예: 96웰 플레이트, 마이크로티터 플레이트), 초음파 반응기 및 초음파 컵혼의 동시 시료 준비를 위한 간접 초음파 처리 솔루션이 포함됩니다. DNA 전단을 위한 모든 플랫폼은 주파수 조정된 고성능 초음파 프로세서로 구동되며, 이는 정밀하게 제어가능하며 재현 가능한 결과를 제공합니다.

모든 샘플 수 및 크기에 대한 초음파 프로세서

Hielscher의 다중 샘플 초음파 장치 VialTweeter (최대 10 개의 시험관 용) 및 UIP400MTP (마이크로 플레이트 / 멀티 웰 플레이트 용)를 사용하면 원하는 DNA 조각 크기 분포 및 수율을 얻는 동시에 강렬하고 정밀하게 제어 가능한 초음파로 인한 샘플 처리 시간을 쉽게 줄일 수 있습니다. 초음파 DNA 단편화는 플라스미드 준비 단계를 효율적이고 신뢰할 수 있으며 확장 가능하게 만듭니다. 프로토콜은 일정한 초음파 매개 변수를 적용하여 하나에서 수많은 샘플로 선형적으로 확장 될 수 있습니다.
한 개에서 다섯 개의 손가락이있는 프로브 초음파 장치는 더 작은 샘플 번호를 준비하는 데 이상적입니다. Hielscher의 실험실 초음파 발생기는 다양한 전력 레벨로 제공되므로 DNA 관련 응용 분야에 이상적인 초음파 파괴자를 선택할 수 있습니다.