초음파 처리를 이용한 플라스미드 준비

초음파 처리는 플라스미드 DNA를 단편화하는 신뢰할 수 있는 기법입니다. 손상 없는 플라스미드 단편화를 위한 초음파 처리기의 가장 중요한 기능은 정밀하게 제어할 수 있는 진폭, 펄스 모드 및 온도 제어입니다. 또한 특정 물질을 사용하면 플라스미드 분해를 방지하는 데 도움이 됩니다. Hielscher Ultrasonics는 단일 바이알 처리부터 다수 시료의 동시 초음파 처리 및 멀티웰 플레이트 처리까지, 제어된 플라스미드 단편화를 위한 다양한 솔루션을 제공합니다. 성공적인 초음파 플라스미드 단편화에 대해 자세히 알아보세요!

초음파 처리를 이용한 플라스미드 전단

DNA 시료에 초음파를 가하면 초음파로 발생한 진동이 액체 내에 음향 캐비테이션을 생성하며, 이는 기계적 힘을 통해 고분자량 DNA 분자를 전단하거나 절단합니다. 초음파 처리는 대량 DNA 전단 실험에서 가장 널리 사용되는 방법으로, 높은 해상도를 얻기 위해 작은 단편 크기가 절대적으로 중요한 염색질 면역침강(ChIP) 등의 응용 분야에도 사용됩니다. (참조: Tseng et al., 2012)
플라스미드 DNA(pDNA)는 고리 모양이 특징인 특정 형태의 DNA로, 세균과 일부 진핵생물에서 발견됩니다.
초나선형 pDNA는 자동 염기서열 분석 및 형질주입과 같은 후속 공정에서 최상의 결과를 보이므로 선호되는 플라스미드 DNA 형태입니다. 초음파 처리는 초나선형 pDNA를 포함한 pDNA를 성공적으로 단편화하는 데 적합합니다.
Thompson et al. (2008)은 초나선형 DNA를 단편화하는 것으로 알려진 플라스미드 초음파 처리가 phred20 염기서열 판독 길이를 개선하여 Beckman Coulter의 대조 주형 또는 효소적으로 선형화한 플라스미드와 유의한 차이가 없는 수준에 이르게 하는 효과적인 방법임을 입증했습니다.

플라스미드 벡터의 사용

플라스미드는 유전자를 복제, 전달 및 조작하는 도구로 자주 사용됩니다. 이러한 목적으로 실험에 사용되는 플라스미드를 벡터라고 합니다. DNA 단편이나 유전자를 플라스미드 벡터에 삽입하여 이른바 재조합 플라스미드를 만들 수 있습니다. 플라스미드 벡터는 재조합 DNA를 숙주 세포로 전달하는 운반체로 사용되며 분자 클로닝의 핵심 구성 요소입니다.
“다양한 복잡한 질병을 치료하기 위한 유전자 치료에서 비바이러스성 벡터의 잠재적 활용 가능성이 폭넓게 연구되고 있습니다. 비바이러스성 벡터는 플라스미드 DNA를 물리적, 화학적 및 효소적 분해로부터 보호하고 DNA 분자를 표적 부위로 전달합니다. 예를 들어 양이온성 리포솜, 키토산 및 기타 양전하를 띤 나노입자는 정전기적 상호작용을 통해 플라스미드 DNA와 복합체를 형성합니다. 그러나 쉽게 형성되는 양이온성 리포솜/플라스미드 DNA 복합체는 비교적 크고(즉, 300–400 nm) 본질적으로 불균일하여 의약 분야에 사용하기 어렵습니다. 크고 불균일한 플라스미드 DNA/리포솜, 플라스미드 DNA/에어로졸 및 플라스미드 DNA/펩타이드 복합체는 초음파 처리를 통해 더 작고 균일한 입자로 만들 수 있습니다.” (Sarker et al., 2019)
플라스미드 벡터 사용의 대표적인 예는 CRISPR–Cas9입니다. CRISPR–Cas9 시스템은 일반적으로 표적 서열, CRISPR 가이드 및 Cas9을 암호화하는 하나의 큰 플라스미드 또는 여러 개의 작은 플라스미드 형태로 세포에 전달됩니다.

나노침전을 통한 DNA 담지 PLGA 나노입자의 초음파 제조

Jo et al. (2020)은 모델 CRISPR–Cas9 플라스미드를 골수 유래 일차 대식세포에 전달하기 위한 나노입자 운반체를 형성하는 데 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA)을 사용했습니다. PLGA 나노입자의 나노침전을 위해 서로 다른 두 가지 말단기(에스터기 및 아민기)를 가진 PLGA를 사용했으며, 이는 양전하를 띠는 아민 말단기와 음전하를 띠는 DNA 골격 사이의 전하 상호작용을 통해 캡슐화 효율과 담지량을 높이기 위한 것이었습니다. 50 mL 폴리프로필렌 원뿔형 원심분리 튜브에서 100 mg의 Pluronic F127을 고압증기멸균한 탈이온수 20 mL에 와류 혼합으로 용해한 다음, 초음파 수조를 사용하여 30 min 동안 약하게 초음파 처리했습니다(CupHorn 참조). 고압증기멸균한 자석 교반자를 넣고 다른 용액을 준비하는 동안 이 용액을 600 RPM으로 30 min 동안 혼합했습니다. DNA의 비특이적 흡착을 최소화하기 위해 전 과정에서 유리 실험기구 대신 플라스틱 실험기구를 사용했습니다. PLGA를 DMF에 용해한 용액(44.48 mg/ ml)과 TIPS 펜타센을 THF에 용해한 용액(0.667 mg/ml)을 각각 따로 준비했습니다. PLGA를 DMF에 30 min 동안 가만히 두어 젖게 한 후 30 min 동안 초음파 처리했습니다. (전체 프로토콜은 Jo et al., 2020 참조)

초음파 처리 중 플라스미드 DNA 보호

플라스미드 및 초나선형 플라스미드를 포함한 DNA는 분해에 매우 민감합니다. 현재 사용 가능한 모든 단편화 방법에는 특정한 단점이 있는 것으로 알려져 있습니다. 제어된 초음파 처리와 보호 조치를 함께 적용하면 전단 및 열로 인한 DNA 가닥의 손상을 줄일 수 있으므로, 초음파 DNA 단편화는 선호되는 방법 중 하나입니다.
초음파 DNA 전단 중 낮은 진폭 설정, 펄스 모드 및 온도 제어 외에도 특정 물질의 사용은 DNA 분해에 대해 상당한 보호 효과를 보였습니다. 예를 들어, 다양한 고분자, 펩타이드 및 지질은 초음파 처리 중 플라스미드 DNA를 보호합니다.

초음파 전단 응력에 대한 플라스미드 DNA 및 플라스미드 DNA/IL 나노복합체의 안정성을 아가로스 겔 전기영동 분석으로 조사했습니다. 플라스미드 DNA와 플라스미드 DNA/IL 나노복합체 모두에 서로 다른 시간 동안 초음파 전단 응력을 가했습니다. 플라스미드 DNA는 0, 10, 20, 30, 40분 동안 초음파 전단 응력에 노출했습니다. 반면 플라스미드 DNA/IL 나노복합체는 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, 120분 동안 초음파 전단 응력에 노출했습니다.
(연구 및 사진: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019)은 플라스미드 DNA / 이온성 액체(pDNA/IL) 나노구조체에 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, 120 min 동안 초음파 전단 응력을 가하고 시판 양이온성 유전자 전달제인 리포펙타민과 복합체를 형성했을 때, 형광 양성 세포의 비율이 각각 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, 50%임을 입증했습니다(아래 차트 참조). 나노구조체에 10, 20 min 동안 초음파 전단 응력을 가했을 때 형광 양성 세포의 비율이 증가했으며, 이후에는 서서히 감소했습니다.

이온성 액체 [Bmim][PF6] 가 COS7 세포로의 플라스미드 DNA 전달에 미치는 영향. 플라스미드 DNA/IL(이온성 액체) 나노복합체에 최대 120분 동안 초음파 전단 응력을 가하고, COS7 세포에 전달하기 전에 LA와 복합체를 형성했습니다. 데이터는 서로 다른 10개 현미경 시야에서 계수한 GFP 양성 HeLa 세포의 평균 수(%)를 보여주며, 실험은 서로 다른 사흘에 걸쳐 여러 차례 수행했습니다. (연구 및 차트: ©Sarker et al., 2019)

초음파를 이용한 세포 용해물 준비

초음파 세포 용해 프로토콜
세포 분리 방법(예: 면역자기 세포 분리, 형광 활성화 세포 분류(FACS), 밀도 구배 원심분리, 면역밀도 세포 분리)으로 준비한 농축 세포 시료로 시작합니다.
세포 시료에는 실험 목적과 프로브형 초음파 처리기에 적합한 부피의 세포 용해 완충액이 포함되어 있어야 합니다.
저장성 완충액은 초음파 세포 용해를 촉진하므로 선호됩니다. 첨가제와 염 농도를 적절하게 적용하는 것이 중요합니다.
초음파 세포 용해 장치를 선택합니다. 바이알의 간접 초음파 처리에는 VialTweeter 또는 CupHorn을 권장합니다. 다중 웰 플레이트에는 UIP400MTP가 이상적인 초음파 처리기입니다. 일반적인 프로브형 초음파 처리에는 마이크로팁이 장착된 UP100H 또는 UP200Ht와 같은 초음파 균질기가 가장 적합합니다.
프로브형 초음파 처리 프로토콜: 초음파 처리기 프로브를 미세원심분리 튜브 내 시료에 넣고 약 10초 동안 초음파 처리합니다. DNA 시료에 따라 초음파 처리를 한 번 또는 두 번 더 반복할 수 있습니다. 필요한 초음파 에너지 투입량(Ws/mL)은 시료의 점도와 DNA 유형에 따라 달라집니다. 얼음 수조를 통한 냉각과 초음파 처리기의 펄스 모드는 시료의 열적 분해를 방지하는 데 도움이 됩니다.
초음파 세포 용해 후 시료를 원심분리하여 침전된 잔해(용해되지 않은 세포, 핵 및 용해되지 않은 세포 소기관 포함)를 분리합니다.
시료를 즉시 추가 처리하지 않는 경우, 생존성을 유지하기 위해 적절한 온도에서 보관할 수 있습니다.

DNA 단편화용 초음파 처리기

Hielscher Ultrasonics는 DNA, RNA 및 염색질 단편화를 위한 다양한 초음파 기반 플랫폼을 제공합니다. 이러한 다양한 플랫폼에는 초음파 프로브(소노트로드), 여러 튜브 또는 다중 웰 플레이트(예: 96웰 플레이트, 마이크로타이터 플레이트)의 동시 시료 준비를 위한 간접 초음파 처리 솔루션, 초음파 반응기 및 초음파 CupHorn이 포함됩니다. DNA 전단을 위한 모든 플랫폼은 주파수가 조정된 고성능 초음파 프로세서로 구동되며, 이 프로세서는 정밀하게 제어할 수 있고 재현성 있는 결과를 제공합니다.

모든 시료 수와 크기에 적합한 초음파 프로세서

Hielscher의 다중 시료 초음파 처리기 VialTweeter(최대 10개의 시험관용)와 UIP400MTP(마이크로플레이트/다중 웰 플레이트용)를 사용하면 강력하고 정밀하게 제어 가능한 초음파 처리를 통해 원하는 DNA 단편 크기 분포와 수율을 얻으면서 시료 처리 시간을 쉽게 줄일 수 있습니다. 초음파 DNA 단편화는 플라스미드 준비 단계를 효율적이고 신뢰할 수 있게 하며 규모 확장을 가능하게 합니다. 일정한 초음파 매개변수를 적용하면 시료 한 개에서 다수의 시료로 프로토콜의 규모를 선형적으로 확장할 수 있습니다.
핑거가 한 개에서 다섯 개까지 장착된 프로브형 초음파 처리기는 적은 수의 시료를 준비하는 데 이상적입니다. Hielscher의 실험실용 초음파 처리기는 다양한 출력 수준으로 제공되므로 DNA 관련 응용 분야에 이상적인 초음파 파쇄기를 선택할 수 있습니다.