초음파를 이용한 플라스미드 준비

초음파는 플라스미드 DNA를 단편화하는 신뢰할 수 있는 기술입니다. 정밀하게 제어 가능한 진폭, 맥동 모드 및 온도 제어는 비 손상 플라스미드 단편화를위한 초음파의 가장 중요한 기능입니다. 또한 특정 제제를 사용하면 플라스미드 분해를 방지하는 데 도움이 됩니다. Hielscher 초음파는 단일 바이알에서 제어 된 플라스미드 단편화를위한 다양한 솔루션을 제공하며, 동시에 수많은 샘플의 초음파 처리 및 다중 웰 플레이트를 제공합니다. 성공적인 초음파 플라스미드 단편화에 대해 자세히 알아보십시오!

초음파를 이용한 플라스미드 전단

DNA 샘플에 초음파가 가해지면 초음파로 생성된 진동은 액체에 음향 캐비테이션을 생성하여 기계적 힘을 통해 고분자량 DNA 분자를 절단하거나 파괴합니다. 초음파 처리는 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)과 같은 응용 분야를 포함하여 대량 DNA 전단 실험에 가장 널리 사용되는 방법으로, 작은 단편 크기가 고해상도를 얻는 데 절대적으로 중요합니다. (Tseng et al., 2012 참조)
플라스미드 DNA(pDNA)는 고리 모양이 특징인 DNA의 특정 형태이며 박테리아와 일부 진핵생물에서 발견됩니다.
Supercoiled pDNA는 자동 염기서열분석 및 transfection과 같은 다운스트림 공정에서 최상의 결과를 보여주기 때문에 원하는 형태의 플라스미드 DNA입니다. 초음파는 supercoiled pDNA를 포함한 pDNA를 성공적으로 단편화하는 데 적합합니다.
Thompson et al. (2008) demonstrated that plasmid sonication, which is known to fragment supercoiled DNA, is an effective way to improve sequence phred20 read lengths to the point that they are not significantly different from Beckman Coulter’s control template or enzymatically linearized plasmids.

Plasmid Vectors 사용

플라스미드는 종종 유전자를 복제, 전달 및 조작하는 도구로 사용됩니다. 이러한 목적으로 플라스미드가 실험적으로 사용되는 경우, 이를 벡터(vector)라고 합니다. DNA 단편 또는 유전자를 플라스미드 벡터에 삽입하여 소위 재조합 플라스미드를 생성할 수 있습니다. 플라스미드 벡터는 재조합 DNA를 숙주 세포로 유도하는 매개체로 사용되며 분자 클로닝의 핵심 구성 요소입니다.
“비바이러스 벡터는 다양한 복잡한 질병을 치료하기 위한 유전자 치료에 사용할 수 있는 가능성에 대해 광범위하게 연구되고 있습니다. 비바이러스 벡터는 물리적, 화학적, 효소적 분해로부터 플라스미드 DNA를 보호하고 DNA 분자를 표적 부위에 전달합니다. 예를 들어, 양이온성 리포좀, 키토산 및 기타 양전하를 띤 나노입자는 정전기 상호작용을 통해 플라스미드 DNA와 복합체를 형성합니다. 그러나 쉽게 형성되는 양이온성 리포좀/플라스미드 DNA 복합체는 상대적으로 크고(즉, 300–400nm) 본질적으로 이질적이어서 제약 응용 분야에서 사용하기 어렵습니다. 크고 이질적인 플라스미드 DNA/리포좀, 플라스미드 DNA/에어로졸 및 플라스미드 DNA/펩타이드 복합체는 초음파를 사용하여 더 작고 균질한 입자로 줄일 수 있습니다.” (Sarker et al., 2019)
플라스미드 벡터의 사용을 위한 대표적인 예는 CRISPR-Cas9입니다. CRISPR-Cas9 시스템은 일반적으로 표적 염기서열, CRISPR 가이드 및 Cas9을 인코딩하는 단일 대형 플라스미드 또는 여러 개의 작은 플라스미드로 세포에 전달됩니다.

나노 침전에 의한 DNA 로딩 PLGA 나노 입자의 초음파 준비

Jo et al. (2020)은 모델 CRISPR-Cas9 플라스미드를 원발성 골수 유래 대식세포에 전달하기 위한 나노입자 담체를 형성하기 위해 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA)를 사용했습니다. PLGA 나노 입자의 나노 침전을 위해 양전하를 띤 아민 말단 캡과 DNA의 음전하를 띤 골격 사이의 전하 상호 작용으로 인해 캡슐화 효율과 로딩을 증가시키기 위해 두 개의 다른 말단기(에스테르기 및 아민기)를 가진 PLGA를 사용했습니다. 50mL 폴리프로필렌 원추형 원심분리기 튜브에서 100mg Pluronic F127을 와류 혼합에 의해 20mL 오토클레이브 DI 물에 용해시킨 후 초음파 수조(CupHorn 참조). 오토클레이브 마그네틱 교반 바를 추가하고 용액을 600RPM에서 30분 동안 혼합하는 동안 다른 용액을 만들었습니다. DNA의 비특이적 흡착을 최소화하기 위해 유리 제품 대신 플라스틱 실험기구를 사용했습니다. DMF(44.48 mg/ml)에 용해된 PLGA와 THF(0.667 mg/ml)에 용해된 TIPS 펜타센 용액을 별도로 제조하였다. PLGA는 DMF에서 30분 동안 정지된 상태로 젖도록 두었다가 30분 동안 초음파 처리했습니다(전체 프로토콜은 Jo et al., 2020 참조)

초음파 처리 중 플라스미드 DNA 보호

플라스미드 및 supercoiled 플라스미드를 포함한 DNA는 매우 민감한 분해입니다. 사용 가능한 모든 단편화 방법은 특정 단점이 있는 것으로 알려져 있습니다. 초음파 DNA 단편화는 보호 조치와 함께 제어 된 초음파 처리를 통해 DNA 가닥의 전단 및 열로 인한 손상을 줄일 수 있기 때문에 선호되는 방법 중 하나입니다.
초음파 DNA 전단 중 낮은 진폭 설정, 맥동 모드 및 온도 제어 외에도 특정 제제의 사용은 DNA 분해에 대한 상당한 보호 효과를 보여주었습니다. 예를 들어, 다양한 폴리머, 펩타이드 및 지질은 초음파 처리 중에 플라스미드 DNA를 보호합니다.

초음파 전단 응력에 대한 플라스미드 DNA 및 플라스미드 DNA/IL 나노 복합체의 안정성은 아가로스 겔 전기영동 분석을 사용하여 조사되었습니다. 플라스미드 DNA와 플라스미드 DNA/IL 나노복합체는 모두 서로 다른 시점에 대해 초음파 전단 응력을 받았습니다. 플라스미드 DNA를 0, 10, 20, 30, 40분 동안 초음파 전단 스트레스에 노출시켰다. 그러나 플라스미드 DNA/IL 나노복합체는 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 및 120분 동안 초음파 전단 응력에 노출되었습니다.(연구 및 사진: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019)는 플라스미드 DNA/이온 액체(pDNA/IL) 나노 구조를 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 및 120분 동안 초음파 전단 응력을 가하고 상업적으로 이용 가능한 양이온 유전자 전달제인 리포펙타민과 복합체를 형성했을 때 형광 양성 세포의 비율이 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 각각 65% 및 50%입니다(아래 차트 참조). 형광 양성 세포의 비율은 나노 구조가 10 분 및 20 분 동안 초음파 전단 응력을 받았을 때 증가했으며 그 후에는 천천히 감소했습니다.

이온성 액체 [Bmim][PF6]가 COS7 세포로의 플라스미드 DNA 전달에 미치는 영향. 플라스미드 DNA/IL(이온 액체) 나노복합체를 최대 120분 동안 초음파 전단 응력을 가하고 LA와 복합체를 만들어 COS7 세포로 전달했습니다. 이 데이터는 10개의 서로 다른 현미경 필드에서 계수된 GFP 양성 HeLa 세포의 평균 수(%)를 보여주며 실험은 3일에 걸쳐 여러 번 수행되었습니다. (연구 및 차트: ©Sarker et al., 2019)

초음파 용해물 준비

초음파 세포 용해 프로토콜
세포 분리 방법(예: 면역자기 세포 분리, 형광 활성화 세포 분류(FACS), 밀도 구배 원심분리, 면역밀도 세포 분리)를 통해 준비된 강화된 세포 샘플로 시작합니다.
세포 샘플은 실험 목표 및 프로브 형 초음파기에 적합한 용해 완충액의 부피를 보여 주어야합니다.
Hypotonic buffers는 초음파 세포 용해를 향상시키기 때문에 선호됩니다. 첨가제와 염 농도를 적절하게 사용하는 것이 중요합니다.
초음파 용해 장치 선택 : 바이알의 간접 초음파 처리를 위해 VialTweeter 또는 CupHorn을 권장합니다. multiwell 플레이트의 경우 UIP400MTP는 이상적인 초음파기입니다. 그리고 고전적인 프로브 형 초음파 처리, 마이크로 팁이있는 UP100H 또는 UP200Ht와 같은 초음파 균질화가 가장 적합합니다.
프로브 유형 초음파 처리를위한 프로토콜 : 초음파기 프로브를 마이크로 원심 분리기 튜브의 샘플 볼륨에 넣고 약 10 초 동안 초음파 처리합니다. DNA 샘플에 따라 초음파 처리는 한 번 또는 두 번 더 반복 될 수 있습니다. 필요한 초음파 에너지 입력(Ws/mL)은 시료 점도 및 DNA 유형에 따라 다릅니다. 초음파기의 얼음 목욕 및 맥동 모드를 통한 냉각은 샘플이 열적으로 저하되는 것을 방지하는 데 도움이됩니다.
초음파 용해 후 샘플을 원심 분리하여 펠릿 파편 (용해되지 않은 세포, 핵 및 용해되지 않은 세포 소기관 포함)을 분리합니다
샘플이 즉시 더 이상 처리되지 않는 경우, 생존력을 보존하기 위해 적절한 온도에서 보관할 수 있습니다.

DNA 단편화를 위한 초음파발생기

Hielscher 초음파는 DNA, RNA 및 염색질 단편화를위한 다양한 초음파 기반 플랫폼을 제공합니다. 이러한 다양한 플랫폼에는 초음파 프로브 (sonotrodes), 여러 튜브 또는 다중 웰 플레이트 (예 : 96 웰 플레이트, 마이크로 타이터 플레이트)의 동시 샘플 준비를위한 간접 초음파 처리 솔루션, 초음파 증폭기 및 초음파 컵혼이 포함됩니다. DNA 전단을 위한 모든 플랫폼은 주파수 조정된 고성능 초음파 프로세서로 구동되며, 이 프로세서는 정밀하게 제어할 수 있고 재현 가능한 결과를 제공합니다.

모든 시료 수와 크기에 맞는 초음파 프로세서

With Hielscher’s multi-sample ultrasonicators VialTweeter (for up to 10 test tubes) and UIP400MTP (for microplates/ multiwell plates) it becomes easily possible to reduce sample processing time due to intense and precisely controllable ultrasonication whilst obtaining the desired DNA fragment size distribution and yield. Ultrasonic DNA fragmentation makes plasmid preparation steps efficient, reliable and scalable. Protocols can be linearly scaled from one to numerous samples by applying constant ultrasound parameters.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.