超音波処理による腫瘍組織からのタンパク質抽出 – プロトコル
このプロトコールでは、組織破砕中に制御されたプローブソニケーションステップを追加することで、標準的なCPTAC尿素溶解ワークフローを前進させた、腫瘍組織の超音波アシストタンパク質抽出法について説明する。確立されたディープスケールCPTACプロテオームおよびリン酸化プロテオーム調製ストラテジーに基づき、この改良は細胞および細胞内構造の破壊を改善し、サンプルの粘度を下げ、尿素溶解のみでは通常回収が困難なタンパク質、特に膜結合タンパク質、DNA結合タンパク質、核関連タンパク質の放出を促進する。基礎研究において、超音波処理支援ワークフローは、下流のCPTACスタイルの消化、TMT標識、分画、リン酸化ペプチド濃縮、LC-MS/MS分析パイプラインとの互換性を維持しながら、タンパク質とリン酸化ペプチドの両方の検出を増加させた。
ディーププロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクス解析のための超音波処理による腫瘍組織からのタンパク質抽出
The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.
超音波プローブ UP200St プロテオミクスにおけるタンパク質抽出
プロトコルの適用領域
この手順は以下の場合に使用する：
- 新鮮凍結、凍結粉砕した腫瘍組織
- 尿素ベースの抽出がすでに確立されている細胞ペレットまたはその他の生物学的標本
- トリプシン消化とオプションのTMT標識を用いたグローバルプロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクスワークフロー
Liら（2025年）の研究では、このワークフローは細胞株、血液、尿など他の検体タイプにも適用可能であるが、検体タイプによって最適化が必要かもしれないとしている。
超音波処理ステップを導入した最適化されたサンプル調製ワークフロー。最適化されたワークフローと実験デザインは、グローバルプロテオームおよびリン酸化プロテオーム解析のためのCPTACサンプル調製プロトコルに基づく。
研究とスキーム：©Li et al, 2025
動作原理
オリジナルの研究では、標準的なCPTAC尿素溶解ワークフローに超音波処理を追加し、膜や核に関連するタンパク質の検出が改善されたことを明らかにした。著者らは、超音波処理のパラメータはサンプルサイズ／濃度に関して微調整する必要があるとしている。 – ソノトロードのサイズ、エネルギー入力、パルスのタイミングを選択する。
例えば、Hielscher UP200HtとUP200Stの場合、これは以下を意味する：
- 振幅とパルス・モードを主な制御変数とする。
- サンプルを冷やし続ける（氷の上など）
- 保守的な設定から始める
- サンプルの透明度、温度、タンパク質収量、下流のペプチド品質に対して最適化する。
Hielscher社製200ワットソニケーターUP200HtとUP200Stは、振幅とパルスの設定が調整可能で、小・中容量サンプル用に設計されています。両超音波ホモジナイザーは、正確なパラメーター調整のためのデジタルタッチスクリーンコントロール、自動データ記録、プラグイン式温度センサー、リモートコントロール、サンプル照明を備えています。
ソニケーション支援タンパク質抽出用試薬
尿素溶解バッファー
使用直前に新鮮なものを用意する：
- 8 M 尿素
- 75 mM NaCl
- 50 mM Tris, pH 8.0
- 1 mM EDTA
- 2 µg/mL アプロチニン
- 10 µg/mL ロイペプチン
- 1 mM PMSF
- 10 mM NaF
- 20 µM PUGNAc
- ホスファターゼ阻害剤カクテル2, 1:100 (v/v)
- ホスファターゼ阻害剤カクテル3, 1:100 (v/v)
尿素は、添加剤を加える前に完全に溶解していなければならない。阻害剤は使用直前に加えるべきである。緩衝液は氷上に保管すべきである。添加剤を加えた後は、激しくボルテックスするよりも、スワリングすることを推奨する。
追加の試薬：
- BCAタンパク質アッセイ試薬
- 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
- 回線業者
- ヨードアセトアミド
- LysC
- トリプシン
- ギ酸
- TMT試薬（多重定量プロテオミクスを使用する場合
- リン酸化ペプチド濃縮を行う場合はIMAC試薬
超音波によるタンパク質抽出装置
必須
推奨プローブ選択
200～1000 µL程度のサンプルには、小容量の直接高強度処理に適した小口径ソノトロードを使用します。Hielscher社では複数のソノトロード径を提供しており、先端径が小さいほど先端での強度が高くなります。
実用上の注意：過度の泡立ちや容器壁面との接触がなく、効率的な混合ができる最小のプローブを使用する。
複数のサンプルを同時に扱う場合、次のような方法がある。 マルチチューブ・ソニケーター・バイアル・トゥイーター または マイクロプレートソニケーターUIP400MTP！
ステップバイステップの手順ソニケーション支援タンパク質抽出の手順
A.予冷と準備
- 遠心分離機を4℃に冷やす。
- 新鮮な尿素溶解バッファーを調製し、氷上に置いておく。
- UP200HtまたはUP200Stを、サウンド・エンクロージャー内のスタンドに設置します。
- サンプルチューブを立てて安定させるのに十分な大きさのアイスバスを用意する。
新鮮なバッファー調製と低温での取り扱いが重要である。
B.最初の尿素抽出
- 凍結粉砕した組織は氷上に保存する。
- 湿潤組織 50 mg あたり 200 µL の冷やした尿素溶解バッファー を加える。
- 高速で渦を巻く5-10秒。
- 4℃で15分間インキュベートする。
- ボルテックス＋インキュベーションのステップをもう一度繰り返す。
- 20,000g、10分間、4℃で遠心する。
- 溶解液／上清を清潔なローバインドチューブに移す。
C.UP200HtまたはUP200Stを使用した超音波処理
ソニケーションの開始条件
- 振幅：20～30%からスタート
- パルス長：5秒 ON
- 冷却：パルスの間に氷上で2分間
- サイクル数4サイクル
- 超音波処理時間：20秒
- 冷却を含む全工程時間：約8～10分
ソニケーションのステップ
- ライセートを超音波処理に適したチューブに移す。熱交換が良好で、プローブが安全に浸漬できる細長い薄肉チューブを使用する。
- チューブを氷浴に入れる。この論文では、超音波処理中の冷却は、熱による損傷を防ぐために重要であるとしている。
- プローブ先端をサンプルに浸漬する。安定したキャビテーションを得るために先端を十分に浸漬させますが、チューブの壁や底に接触させないでください。
- 開始振幅で5秒パルスを1回実行する。
- すぐにサンプルを完全に氷に戻し、2分間静置する。
- これを4サイクル繰り返す。
- サイクル後のライセートを検査する。
- 必要な場合のみ続け、一度に5秒ずつパルスを追加し、その後必ず完全に冷却する。
- 溶解液がより均一になり、筋状／粘性状でなくなったら止める。
終点は、連続した粘性のある流れではなく、液滴を形成する半透明の溶解液である。 - 約16,000g、4℃で15分間遠心する。
- 清澄化した上清を新しいチューブに移し、タンパク質濃度を測定する。
超音波処理したサンプルとそうでないサンプルのグローバルプロテオミクスとリン酸化プロテオミクスの比較。
a.超音波処理の有無にかかわらず、全PDX腫瘍組織において同定されたタンパク質の数（global proteomics） b. 超音波処理の有無にかかわらず、全PDX腫瘍組織において同定されたリン酸化ペプチドの数（IMAC濃縮）。存在比が25パーセンタイル以上のタンパク質とリン酸化ペプチドのみをカウントした。存在比は同じ種類のサンプル間で計算した。
研究とグラフ：©Li et al, 2025
下流の消化と分析
超音波処理と清澄化の後、オリジナルのCPTACスタイルのワークフローに記載されているとおりに進める：
- 溶解液を50 mM Tris-HCl pH 8.0で1:3 (v/v) に希釈し、尿素を0.1%まで減少させる。 <2 M.
- LysCを50μgのタンパク質あたり1mAU添加し、25℃で2時間インキュベートする。
- 酵素：基質＝1：49（w/w）のトリプシンを加え、25℃で一晩消化する。
- ギ酸で最終1％までクエンチする。
- 必要に応じて、脱塩、TMT標識、分画、リン酸化ペプチド濃縮、LC-MS/MSを続ける。
TMT標識MSからのリン酸化ペプチドの差次的発現。
a.b.内腔サブタイプ。超音波処理したサンプルにおいて、非音波処理サンプルと比較して発現が増加したヒトのリン酸化ペプチド（タンパク質配列の開始と終了）を強調表示。c. 音波処理した腫瘍の基底サブタイプで発現が上昇したリン酸化ペプチドのタンパク質に基づく濃縮KEGGパスウェイ d. 音波処理した腫瘍の内腔サブタイプで発現が上昇したリン酸化ペプチドのタンパク質に基づく濃縮KEGGパスウェイ。
研究とグラフ：©Li et al, 2025
デザイン、製造、コンサルティング – 品質 ドイツ製
Hielscher社の超音波装置は、その最高の品質と設計基準でよく知られています。頑丈で操作が簡単なため、産業設備にスムーズに組み込むことができます。過酷な条件や厳しい環境でも、Hielscherの超音波装置は容易に対応できます。
Hielscher Ultrasonics社は、ISO認証取得企業であり、最先端の技術と使いやすさを特徴とする高性能超音波振動子に特に重点を置いています。もちろん、Hielscherの超音波装置はCEに準拠しており、UL、CSA、RoHsの要件を満たしています。
マルチウェルプレートソニケーター UIP400MTP サンプルからのハイスループットタンパク質抽出
文献・参考文献
- Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
- Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
- Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.
よくある質問
植物組織からのタンパク質抽出と哺乳類組織からのタンパク質抽出の違いは？
植物組織からのタンパク質抽出は、通常、哺乳類組織からの抽出よりも困難である。なぜなら、植物細胞には、タンパク質の可溶化を妨げたり、抽出物を汚染したり、タンパク質の分解を促進したりする可能性のある、剛直なセルロースリッチ細胞壁、豊富な多糖類、フェノール化合物、色素、活性内因性酵素が存在するからである。対照的に、哺乳類組織には細胞壁がなく、一般的に化学的に破壊することが容易であるが、脂質、細胞外マトリックス、プロテアーゼが多く含まれ、抽出を複雑にすることがある。その結果、植物のプロトコールでは通常、より強力な機械的破砕、低温での粉砕、PVPP、還元剤、フェノール系洗浄剤などの添加剤が必要となるが、哺乳類組織ではRIPAや尿素系溶解システムのような洗剤系緩衝液でうまく処理できることが多い。植物組織も哺乳動物組織も、超音波処理によって効率的に溶解できる！
RIPAバッファーによる組織からのタンパク質抽出を改善するには？
RIPAバッファーによる組織からのタンパク質抽出は、サンプルの破砕と保護の両方を最適化することで改善できる。最も重要な対策は、組織とバッファーを低温に保つこと、新しく調製したプロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を使用すること、溶解前に組織を十分にミンチまたは粉砕すること、適切なバッファー対組織比を維持すること、ホモジナイズや短時間のプローブ超音波処理などの機械的破砕ステップを追加して、緻密な組織を破砕し粘度を下げることである。溶解液を氷上でインキュベートし、断続的に攪拌した後、高速冷蔵遠心して不溶性の残渣を除去すると、抽出効率も向上する。繊維状、脂質に富む、または高度に構造化された組織の場合、抽出を1回繰り返すか、または洗浄剤の暴露時間を長くすると、回収率が向上することがあるが、過度の超音波処理または長時間の室温での取り扱いは、タンパク質を変性させたり、タンパク質分解を増加させたりする可能性があるため、避けるべきである。
超音波によるタンパク質抽出の際に維持すべき安全要件とは？
プローブの超音波処理は、防音ボックス内または適切な聴覚保護具を着用して行ってください。ソースプロトコルは、超音波処理中に発生する有害な可聴ノイズについて特に警告している。
保護メガネ、白衣、手袋を着用すること。
プローブを皮膚に触れさせないでください。また、水しぶきを防ぐことなく開放容器を超音波処理しないでください。
PMSFおよびその他の阻害剤は、現地の化学物質安全規則に従って取り扱う。
熱によるタンパク質の損傷を減らすため、サンプルは氷の上に置いておく。この論文では、温度管理が重要であると繰り返し述べている。
