超音波処理による腫瘍組織からのタンパク質抽出 – プロトコル

本プロトコルでは、組織破砕時に制御されたプローブ式超音波処理工程を追加し、標準的なCPTAC尿素溶解ワークフローを発展させた、腫瘍組織からのタンパク質抽出法を説明します。確立されたCPTACの大規模かつ深い網羅性を持つプロテオームおよびリン酸化プロテオームの試料調製戦略を基盤とするこの改良により、細胞および細胞内構造の破砕が改善され、サンプルの粘度が低下し、通常は尿素溶解だけでは回収しにくいタンパク質、特に膜結合タンパク質やDNA結合タンパク質、核関連タンパク質の放出が促進されます。基となった研究では、超音波処理を追加したワークフローにより、後段のCPTAC方式の消化、TMT標識、分画、リン酸化ペプチド濃縮、LC-MS/MS分析パイプラインとの適合性を維持しながら、タンパク質とリン酸化ペプチドの両方の検出が増加しました。

深い網羅性を持つプロテオームおよびリン酸化プロテオーム解析のための、超音波処理による腫瘍組織からのタンパク質抽出

以下のプロトコルは、凍結粉砕した腫瘍組織から8 M尿素溶解バッファー中でタンパク質を抽出するために最適化されています。消化および後段のLC-MS/MS分析の前にプローブ式超音波処理工程を追加することで、回収が難しいタンパク質群、特に膜関連タンパク質やDNA／核関連タンパク質の回収が改善されます。基となったLi et al. (2025)の研究では、超音波処理の追加により膜関連および核関連タンパク質の検出が増加し、そのワークフローにおいて>12,000のタンパク質と>25,000のリン酸化ペプチドを対象とする、大規模かつ深い網羅性が得られました。

本プロトコルの適用範囲

本手順は以下に使用します：

• 新鮮凍結し、凍結粉砕した腫瘍組織
• 尿素を用いた抽出法がすでに確立されている細胞ペレットまたはその他の生体試料
• トリプシン消化と、必要に応じてTMT標識を用いるグローバルプロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクスのワークフロー

Li et al. (2025)の研究では、このワークフローは細胞株、血液、尿などの他の試料タイプにも適用できるとされていますが、サンプルの種類に応じて最適化が必要になる場合があります。

超音波処理工程を組み込んだ、最適化されたサンプル調製ワークフロー。最適化されたワークフローと実験デザインは、グローバルプロテオームおよびリン酸化プロテオーム解析のためのCPTACサンプル調製プロトコルに基づいています。
研究および模式図：©Li et al., 2025

動作原理

元の研究では、標準的なCPTAC尿素溶解ワークフローに超音波処理を追加し、膜および核に関連するタンパク質の検出が改善されることを確認しました。著者らは、ソノトロードのサイズ、エネルギー投入量、パルスのタイミングを選択することで、サンプルの量／濃度に応じて超音波処理パラメーターを微調整する必要があると述べています。

例えば、Hielscher UP200HtおよびUP200Stでは、以下を意味します：

• 振幅とパルスモードを主な制御変数として使用する
• 全工程を通してサンプルを低温に保つ（すなわち氷上に置く）
• 控えめな設定から開始する
• サンプルの透明度、温度、タンパク質収量、後段のペプチドの品質を指標として最適化する

 
Hielscherの200ワット超音波処理装置UP200HtおよびUP200Stは、いずれも少量および中量のサンプル向けに設計され、振幅とパルス設定を調整できます。両超音波ホモジナイザーには、精密なパラメーター調整のためのデジタルタッチスクリーン制御、自動データ記録、接続式温度センサー、遠隔操作、サンプル照明が備わっています。
 

超音波処理によるタンパク質抽出用試薬

尿素溶解バッファー

使用直前に新しく調製します：

• 8 M 尿素
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8.0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL アプロチニン
• 10 µg/mL ロイペプチン
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• ホスファターゼ阻害剤カクテル2、1:100 (v/v)
• ホスファターゼ阻害剤カクテル3、1:100 (v/v)

添加剤を加える前に、尿素を完全に溶解させる必要があります。阻害剤は使用直前に添加し、バッファーは氷上に保ってください。添加剤を加えた後は、強いボルテックス撹拌ではなく、旋回させて混合することを推奨します。
 

追加の試薬：

• BCAタンパク質定量用試薬
• 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
• DTT
• ヨードアセトアミド
• LysC
• トリプシン
• ギ酸
• 多重化定量プロテオミクスを行う場合はTMT試薬
• リン酸化ペプチド濃縮を行う場合はIMAC試薬

超音波処理によるタンパク質抽出用機器

必要な機器

推奨するプローブの選択

約200–1000 µLのサンプルには、少量サンプルを直接、高強度で処理するのに適した小径ソノトロードを使用してください。Hielscherは複数の直径のソノトロードを提供しており、先端径が小さいほど先端での強度が高くなります。

実用上の注意：過度の発泡や容器壁との接触を生じさせずに効率的に混合できる、最小のプローブを使用してください。

複数のサンプルを同時に処理する場合は、 マルチチューブ超音波処理装置VialTweeter または マイクロプレート超音波処理装置UIP400MTPの使用をご検討ください！

段階別の手順：超音波処理によるタンパク質抽出の実施方法

A. 予冷と準備

1. 遠心機を4°Cに冷却します。
2. 尿素溶解バッファーを新しく調製し、氷上に保ちます。
3. 防音エンクロージャー内のスタンドにUP200HtまたはUP200Stを設置します。
4. サンプルチューブを直立させ、安定して保持できる十分な大きさの氷浴を準備します。

バッファーを新しく調製することと、低温で取り扱うことが極めて重要です。

B. 最初の尿素抽出

1. 凍結粉砕した組織を氷上に保ちます。
2. 湿潤組織50 mgあたり、冷却した尿素溶解バッファー200 µLを加えます。
3. 高速で5–10 sボルテックス撹拌します。
4. 4°Cで15 minインキュベートします。
5. ボルテックス撹拌とインキュベーションの工程をもう一度繰り返します。
6. 4°C、20,000gで10 min遠心分離します。
7. 溶解液／上清を清潔な低吸着性チューブに移します。

C. UP200HtまたはUP200Stを用いた超音波処理

超音波処理の開始条件

• 振幅：20–30%から開始
• パルス長：5 s ON
• 冷却：パルス間に氷上で2 min
• サイクル数：4サイクル
• 超音波照射時間の合計：20 s
• 冷却を含む総処理時間：約8–10 min

超音波処理の手順

1. 溶解液を超音波処理に適したチューブに移します。良好な熱交換と安全なプローブの浸漬が可能な、細く薄壁のチューブを使用してください。
2. チューブを氷浴に入れます。論文では、熱損傷を防ぐために超音波処理中の冷却が極めて重要であるとしています。
3. プローブ先端をサンプルに浸します。安定したキャビテーションが得られるように先端を十分に浸漬しますが、チューブの壁や底に触れさせないでください。
4. 開始時の振幅で5 sのパルスを一度照射します。
5. 直ちにサンプル全体を氷上に戻し、2 min冷却します。
6. 4サイクルが完了するまで繰り返します。
7. サイクル後に溶解液を確認します。
8. 必要な場合にのみ続行し、5 sのパルスを一回ずつ追加して、その後は毎回必ず十分に冷却します。
9. 溶解液がより均一になり、糸を引く性質／粘性が低下した時点で停止します。
   終点は、溶解液の透明度が増し、連続した粘性のある流れではなく、液滴を形成する状態です。
10. 4°C、約16,000gで15 min遠心分離します。
11. 清澄化した上清を新しいチューブに移し、タンパク質濃度を測定します。

超音波処理したサンプルと未処理サンプルのグローバルプロテオミクスおよびリン酸化プロテオミクスの比較。
a. 超音波処理の有無による、すべてのPDX腫瘍組織で同定されたタンパク質数（グローバルプロテオミクス）。b. 超音波処理の有無による、すべてのPDX腫瘍組織で同定されたリン酸化ペプチド数（IMAC濃縮）。存在量比が第25パーセンタイル以上のタンパク質およびリン酸化ペプチドのみを集計しました。存在量比は同じ種類のサンプル間で算出しました。
研究およびグラフ：©Li et al., 2025

後段の消化と分析

超音波処理と清澄化の後、元のCPTAC方式のワークフローに従って進めます：

1. 50 mM Tris-HCl pH 8.0で溶解液を1:3 (v/v)に希釈し、尿素濃度を<2 Mに低下させます。
2. タンパク質50 µgあたり1 mAUのLysCを添加し、25°Cで2 hインキュベートします。
3. 酵素：基質比1:49 (w/w)でトリプシンを添加し、25°Cで一晩消化します。
4. 最終濃度が1%になるようにギ酸を加え、反応を停止します。
5. 必要に応じて、脱塩、TMT標識、分画、リン酸化ペプチド濃縮、LC-MS/MSへ進みます。

TMT標識MSによるリン酸化ペプチドの差次的発現。
a. 基底型サブタイプ。未処理サンプルと比較して超音波処理サンプルで発現が上昇したヒトリン酸化ペプチドの一部（タンパク質配列の開始位置と終了位置）を強調表示しています。b. ルミナル型サブタイプ。未処理サンプルと比較して超音波処理サンプルで発現が上昇したヒトリン酸化ペプチドの一部（タンパク質配列の開始位置と終了位置）を強調表示しています。c. 超音波処理した基底型サブタイプの腫瘍において、発現が上昇したリン酸化ペプチドに対応するタンパク質に基づき、濃縮が認められたKEGG経路。d. 超音波処理したルミナル型サブタイプの腫瘍において、発現が上昇したリン酸化ペプチドに対応するタンパク質に基づき、濃縮が認められたKEGG経路。
研究およびグラフ：©Li et al., 2025

設計、製造、コンサルティング – ドイツ製の品質

Hielscherの超音波処理装置は、最高水準の品質と設計基準で広く知られています。堅牢性と操作の容易さにより、当社の超音波処理装置を産業施設に円滑に導入できます。Hielscherの超音波処理装置は、過酷な条件や厳しい環境にも容易に対応します。

Hielscher UltrasonicsはISO認証企業であり、最先端の技術と使いやすさを備えた高性能超音波処理装置に特に重点を置いています。もちろん、Hielscherの超音波処理装置はCEに適合し、UL、CSA、RoHsの要件を満たしています。

文献／参考文献

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.