C. Elegansサンプルの超音波調製

線虫の一種であるC. elegansは、生物学で広く用いられているモデル生物です。分析前のサンプル調製には、溶解、タンパク質および脂質の抽出、RNAの断片化が必要であり、これらは超音波処理によって確実に行うことができます。超音波細胞破砕装置は、C. elegansサンプルを迅速に調製できる、信頼性が高く、高度で使いやすい装置です。

C. elegansサンプルの超音波調製

Caenorhabditis elegansは線虫であり、ゲノミクス、発生生物学、疾患を調べるために研究室で広く用いられています。C. elegansのゲノム内の多くの遺伝子には、ヒトにおいて機能的に対応する遺伝子があります。そのため、この線虫はヒトの疾患にとって極めて有用なモデルです。C. elegansが広く用いられるその他の利点には、細菌（例：E. coli）を含むプレート上で簡単かつ安価に培養できること、透明であること、取り扱いやすいこと、さらに線虫を凍結して長期間保存できることが挙げられます。
タンパク質および脂質の分析は研究室で日常的に行われる手順であり、超音波によるサンプル調製は、あらゆる発生段階（すなわち胚、L1–L4幼虫、成虫）のC. elegans線虫を溶解するための確立された方法です。C. elegansは、標的タンパク質を過剰発現させるタンパク質発現系としても用いられるため、タンパク質を高収量で得られる、信頼性と再現性の高い溶解およびタンパク質抽出法が必要です。超音波細胞破砕・抽出システムには、プローブ型ホモジナイザーと複数サンプル用超音波処理装置があります。Hielscher Ultrasonicsは、簡便なサンプル調製とあらゆるサンプル量・数に対応し、お客様の実験手順に最適な超音波細胞破砕装置を提供しています。

C. Elegansの破砕と溶解のための超音波プロトコル

C. elegansの超音波による均質化と溶解、およびその後のタンパク質・脂質抽出は、異なる均質化バッファーや溶解バッファーなどを用いたさまざまな手順で行うことができます。すべての溶解プロトコルに共通するのは、タンパク質の分解を防ぐために、サンプルを常に氷上に保持しなければならないことです。以下では、高品質なタンパク質または脂質を含むC. elegansサンプルを調製するための、信頼性が高く迅速な超音波溶解・抽出プロトコルをいくつか紹介します。

C. elegansの超音波溶解の利点

• 高い信頼性
• 高い再現性
• 精密な温度制御
• 信頼性の高いプロセス制御
• 穏やかな方法
• 適用が容易
• 安全

C. elegansサンプルからの超音波タンパク質抽出

C. elegans線虫の超音波溶解とタンパク質抽出は、さまざまなプロトコルで行うことができます。以下では、再現性の高いタンパク質抽出結果を得るための、信頼性が高く迅速な溶解プロトコルをいくつか紹介します。

超音波処理によるC. elegans線虫からの細胞質ゾル抽出物の迅速な調製

以下のプロトコルを用いると、30分未満でC. elegansの溶解物を調製できます。
C. elegansの回収
必要なC. elegans線虫を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む1.5mlチューブに拾い入れるか、1.5mlのPBSでプレートから洗い流して回収します。2000rpmで1min遠心分離し、ペレット化します。サンプルは常に氷上に保持します。
次に、線虫をPBSで二回洗浄します。
その後、線虫を二回洗浄するために用いるのはddH₂Oです。
少なくとも500ulの均質化バッファー（HB）に線虫を再懸濁します。これで線虫サンプルの超音波溶解の準備が整います。
タンパク質抽出物の品質をさらに高めるには、細菌汚染を低減するために線虫をそれぞれ5minずつ洗浄する方法として、PBSと滅菌超純水（ddH₂O）を使用するか、スクロース浮上法を行うことを検討してください。線虫サンプルは常に氷上に保持します。

C. elegansの超音波溶解プロトコル

• 超音波ホモジナイザーをすぐに使用できるように、あらかじめ超音波処理装置を準備してください（プローブを取り付け、超音波処理プログラムを事前設定します）。 

超音波処理装置がスタンドに取り付けられている場合は、サンプルチューブを入れた氷浴を超音波プローブの下に置き、超音波プローブを1.5mlチューブに挿入します。

• UP200StまたはUP200HtによるC. elegansの溶解では、マイクロチップ（例：2mmプローブS26d2、左の写真を参照）を使用し、振幅40%で1secの超音波処理を行い、処理の間に30secの休止を設けてください。各1秒の超音波処理と30secの休止からなる5サイクルが、C. elegansの溶解に最適です。初めて溶解を行う場合は、各パルスの後にサンプルの少量の分取液を顕微鏡で観察し、溶解の進行を確認できます。
• 線虫が破砕されると、溶解は正常に完了しています。過度な超音波処理は核の破壊を引き起こし、サンプルに粘性が生じたり泡立ったりすることで確認できます。サンプルの劣化を防ぐため、必要に応じてパルス数を増やしてください。高品質のタンパク質抽出物を得るために、各超音波パルスサイクルの時間は延長しないでください。
• 超音波で溶解した線虫を4ºC、14,000rpmで10min遠心分離して、細胞溶解物を清澄化します。
• 次に、上清を新しいチューブに移し、免疫沈降またはその他のアッセイの準備をします。

均質化バッファーに関する注記：上記の超音波溶解プロトコル用の均質化バッファーは、以下のように調製します。

UIP400MTPプレート超音波処理装置を用いた96ウェルプレート内のC. elegansのハイスループット溶解

C. elegansの溶解（成虫の線虫）
UIP400MTP、振幅80%、20サイクル（各超音波処理サイクル：30 sec作動、30 sec停止）
溶解バッファー：

• 選択肢1）4% SDS、0.1 M Tris/HCl pH 8.0、1 mM EDTA
• 選択肢2）共免疫沈降（co-IP）用：10 mM Tris HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.5 mM EDTA、0.5 % NP-40（Completeプロテイナーゼ阻害剤カクテル）

ハイスループットDNA断片化
C. elegans（成虫の線虫）のDNA 200–300bp：UIP400MTPプレート超音波処理装置 – 振幅80%、30パルスに設定 – 各パルスは30sec作動、30sec停止

ハイスループットサンプル調製用のUIP400MTPプレート超音波処理装置は、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、96ウェルプレート内のサンプルを均一に超音波処理します

定量的アフィニティ精製アッセイのためのC. elegansの超音波溶解

若い抱卵した雌雄同体を漂白処理することで、C. elegans胚（反復試料あたり∼2百万個）を生物学的三反復で新たに回収しました。氷上での超音波処理条件は、サイクル：0.5 s、振幅：40–45%、各セッションあたり5パルス、5セッション、セッション間の間隔：30 sであり、使用装置は 超音波プロセッサーUP200S にマイクロチップS26d2（Hielscher Ultrasonics GmbH）を取り付けたものです。溶解バッファー（総量：∼600 μl、50 mm Tris-HCl、pH 7.4、100 mm KCl、1 mm MgCl2、1 mm EGTA、1 mm DTT、10%グリセロール、プロテアーゼ阻害剤混合物、0.1% Nonidet P-40 Substitute）中で処理しました。超音波処理後、Nonidet P-40 Substituteを1%になるまで添加し、溶解物を4°Cで30 min、上下反転回転させながらインキュベートした後、4°C、20,000 × gで20 min遠心分離しました。続いて、上層の脂質層を乱さないように清澄化した溶解物を吸引し、半量ずつに分けて、抗GFPアガロースビーズとブロッキング済み対照ビーズ（40–50 μl）にそれぞれ加えました。4°Cで60–90 min上下反転回転させた後、0.1% Nonidet P-40 Substituteを含む溶解バッファーでビーズを一回洗浄し、続いてバッファーI（25 mm Tris-HCl、pH 7.4、300 mm NaCl、1 mm MgCl2）またはバッファーII（1 mm Tris-HCl、pH 7.4、150 mm NaCl、1 mm MgCl2）、あるいはその両方を用いて二回洗浄しました。GFP:MBK-2プルダウンでは、異なる洗浄条件で二つの独立した実験を行いました。タンパク質は、室温で50 μlの6 m尿素/2 Mチオ尿素中で旋回振とうすることにより溶出しました。MBK-1::GFPプルダウン実験では、90°Cで50μlの8 m塩化グアニジニウム中で振とうしてタンパク質を二回溶出した後、エタノール沈殿を行いました。その後、溶出したタンパク質サンプルを溶液中で消化しました。
（参照：Chen et al., 2016）

線虫の超音波均質化と溶解

C.elegansの溶解とタンパク質抽出のために、該当する発生段階の線虫をサンプルあたり30,000匹回収し、氷冷したS-basalで洗浄しました。1500 rpmで2 min遠心分離して濃縮し、残存する細菌を除去するために氷冷したS-basalで六回洗浄した後、使用するまで氷上に保存しました。タンパク質抽出では、最後のS-basal洗浄後に、抱卵した成虫を密なペレットとして形成させました。続いて、線虫ペレットを1 mlの氷冷した抽出バッファー［20 mMリン酸カリウム、pH 7.4、2mM EDTA、1% Triton-X-100、プロテアーゼ阻害剤（Sigma P2714）］に再懸濁し、直ちに処理しました。
∼30,000匹の抱卵した成虫（湿重量∼100 mgに相当）を、1 mlの氷冷した抽出バッファー中で、プローブ型超音波処理装置（例：マイクロチップMS2を装着したUP50H）を用い、氷上で振幅40%、3 sec作動、30 sec停止の10サイクルで超音波処理しました。（参照：Baskharan et al. 2012）

C. elegansからの超音波脂質抽出

メタボロミクスの一分野であるリピドミクスでは、生物系の脂質全体を特徴づけ、分析します。C. elegansは、代謝に関わる脂質の相互作用と、それらが健康や寿命に及ぼす影響を調べるために、リピドミクスで広く用いられています。
超音波溶解と抽出は、C. elegansの胚、幼虫、成虫からスフィンゴ脂質などの脂質を放出させるために用いられます。超音波処理は、線虫ホモジネートの調製と、その後のサンプルからの脂質抽出に用いられます。
C. elegansからの超音波脂質抽出プロトコル
C. elegansペレットを氷上で解凍し、0.5 mlのultrawaterで再懸濁します。サンプルを常に氷上に保持しながら、1.5mL試験管内でC. elegansサンプルを超音波処理します。
超音波処理に使用できるのは、例えばプローブ型超音波処理装置の UP200Ht、超音波サンプル調製ユニットの VialTweeter （10サンプルの同時超音波処理）、または UIP400MTP （96ウェルプレートなどのマルチウェルプレートの超音波処理用）です。UP200Htによる超音波溶解には、マイクロチップS26d2を使用します。デジタルメニューで超音波サイクルモードを事前設定します。振幅を10%に設定し、超音波サイクルモードは2 secのパルスを20サイクル、各超音波パルスバーストの間に30 secの休止を設けるように設定します。
上清をスクリューキャップ付きガラス管に移します。各ガラス管に1 mlのultrawaterを加え、続いて各ガラス管に6 mlのクロロホルム/メタノール混合液（比率 = 2:1）を加えて、Folch抽出を行います。
各ガラス管を30 secずつ4回ボルテックス混合します。相分離をさらに促進するため、管を1,258 x gで15 min遠心分離します（Eppendorf, 5810 R）。ガラス製パスツールピペットを用いて、下層の疎水性画分を清潔なガラス管に移します。窒素エバポレーターで窒素気流下にて下層の疎水性画分を乾燥させます。乾燥したペレットは、使用するまで-80 °Cの冷凍庫に保存します。 


線虫溶解物の超音波調製

線虫溶解物：L4段階の線虫を回収しました。すべての細菌を除去するための三回の洗浄には、M9バッファー（42.26 mM Na₂HPO₄、22.04 mM KH₂PO₄、85.56 mM NaCl、および0.87 mM MgSO₄）を使用しました。M9バッファーをできる限り除去した後、線虫を溶解バッファーに再懸濁しました。その組成は、50 mM HEPES、50 mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、5 mM β-グリセロリン酸、0.1%（v/v）Triton X-100、50 mMフッ化ナトリウム、1 mMオルトバナジン酸ナトリウム、5 mMピロリン酸ナトリウム、0.2 mMフッ化フェニルメタンスルホニル、およびプロテアーゼ阻害剤です。線虫を液体窒素中で凍結し、37°Cで解凍する操作を三回行った後、10本のサンプルチューブを同時に調製できる超音波VialTweeterユニットを用いて、ドライアイス上で線虫を超音波処理しました。超音波処理は、振幅50%で2 secの10サイクルとし、超音波バーストの間に30 secの休止を設けました。その後、サンプルを4°C、12,000 rpmで15 min遠心分離しました。上清を回収し、-70°Cで保存しました。分取液をBradfordアッセイによるタンパク質定量に使用しました。
総グルタチオン、GSH、およびGSSGの測定：グルタチオンの定量では、溶解物の調製と測定を同じ日に行いました。グルコースを与えた群と対照群のL4幼虫を回収し、M9バッファーで三回洗浄しました。M9バッファーをできる限り除去した後、線虫を氷冷したメタリン酸（5% w/v）に再懸濁し、超音波VialTweeterを用いて氷中で超音波処理しました。振幅50%、2 secの超音波処理を十サイクルとし、各サイクルの間に30 secの休止を設けました。その後、4 ̊C、12,000 rpmで15 min遠心分離しました。
（参照：Alcántar-Fernández et al., 2018）

免疫沈降とウエスタンブロッティング前のC. elegansサンプル調製

概要として、胚抽出物の調製では、C. elegansのL1幼虫を大規模な液体S培地で成虫まで培養しました。標準的な漂白法で胚を回収し、溶解バッファー（50 mM Tris、pH 7.5、100 mM KCl、1 mM EDTA、1 mM MgCl2、8.7%グリセロール、0.05% NP-40、1􏰅プロテアーゼ阻害剤カクテル、および1􏰅ホスファターゼ阻害剤カクテルIとII）に懸濁した後、液体窒素中で急速凍結しました。溶解には、マイクロチップ付き超音波処理装置による超音波細胞破砕を用いました。装置の例としては、 UP200Ht にS26d2を取り付けたものを用い、振幅30%で10 sにわたり10パルスの処理を行いました。より多くのサンプルを調製する必要がある場合は、超音波処理装置 VialTweeter またはウェルプレート用の複数サンプル超音波処理装置UIP400MTPを推奨します。超音波処理後、抽出物を4°C、30,000gで20 min遠心分離して、予備清澄化しました。予備清澄化した抽出物（総タンパク質300µg）を、プロテインA-アガロースに架橋結合させた40µ􏰂gのアフィニティ精製抗CDC-25.1抗体（本研究）とインキュベートしました。対照としては、プロテインA-アガロースに架橋結合させた同程度の量のウサギ免疫グロブリン（Ig）Gを使用しました。いずれも1% NP-40を含む総量200µlの溶解バッファー中で行い、この添加によってマトリックスへのタンパク質の非特異的結合が低減されました。サンプルを4°Cで1 h回転させ、ビーズを溶解バッファーで三回洗浄した後、30µlのグリシン/HClおよび200 mM NaCl、pH 2.2で溶出しました。免疫沈降後、溶出液を30µ􏰂lのSDSサンプルバッファーで希釈し、95°Cで4 min加熱しました。通常、インプットには全量の3%、溶出液には30%をSDS-PAGEに供し、その後、抗CDC-25.1（1:400）、抗LIN-23（1:750）、抗ユビキチン（1:1000）、anti-GSK3􏰁（1:500）、またはanti-􏰁β-actin（1:2000）抗体を用いたウエスタンブロッティングを行いました。免疫沈降を行わない抽出物については、それらの抽出物由来の総タンパク質を同量ずつSDSサンプルバッファーに再懸濁し、95°Cに加熱した後、直接SDS-PAGEに供してウエスタンブロッティングで分析しました。（参照：Segref et al. 2020）

精密な温度制御下での超音波溶解

生物学的サンプルを取り扱う際には、精密で信頼性の高い温度制御が極めて重要です。高温は、サンプル内のタンパク質の熱による分解を引き起こします。
すべての機械的サンプル調製法と同様に、超音波処理も熱を発生させます。しかし、VialTweeterを使用すれば、サンプルの温度を良好に制御できます。VialTweeterとVialPressを用いて分析用サンプルを調製する際に、サンプル温度を監視・制御するためのさまざまな方法を紹介します。

1. サンプル温度の監視：VialTweeterを駆動する超音波プロセッサーUP200Stには、インテリジェントソフトウェアと接続式温度センサーが搭載されています。温度センサーをUP200Stに接続し、その先端をサンプルチューブの一本に挿入します。デジタルカラータッチディスプレイを通じて、UP200Stのメニューでサンプルの超音波処理に用いる特定の温度範囲を設定できます。超音波処理装置は、最高温度に達すると自動的に停止し、サンプル温度が設定した温度∆の下限値まで下がるまで休止します。その後、超音波処理が自動的に再開します。このスマート機能は、熱による劣化を防ぎます。
2. VialTweeterブロックは予冷できます。VialTweeterブロック（トランスデューサーを除いたソノトロードのみ！）を冷蔵庫または冷凍庫に入れてチタン製ブロックを予冷すると、サンプルの温度上昇を遅らせるのに役立ちます。可能であれば、サンプル自体も予冷できます。
3. 超音波処理中の冷却にはドライアイスを使用します。浅いトレーにドライアイスを入れ、その上にVialTweeterを置くことで、熱を速やかに放散させることができます。

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どの種類の細胞を、どれくらいの量、頻度、目的で処理する必要があるか、生物学的サンプルについてお知らせください。お客様のプロセス要件に最も適した超音波細胞破砕装置を推奨いたします。

下表は、小型のハンドヘルドホモジナイザーや複数サンプル超音波処理装置から、商業用途の産業用超音波プロセッサーまで、当社の超音波システムのおおよその処理能力を示しています。