C. Elegansサンプルの超音波処理

線虫の一種である線虫は、生物学のモデル生物として広く用いられている。解析前のサンプル調製には、溶解、タンパク質および脂質の抽出、RNAの断片化が必要ですが、これらは超音波処理によって確実に行うことができます。超音波細胞破砕機は、線虫サンプルを迅速に調製するための、信頼性が高く、洗練された使いやすい装置です。

C. Elegansサンプルの超音波処理

線虫は回虫であり、ゲノム学、発生生物学、病気の研究に広く用いられている。線虫のゲノムの中には、ヒトと機能的に対応する遺伝子が多数存在する。従って、線虫はヒトの疾患モデルとして非常に有用である。線虫を広く利用するための他の利点は、バクテリア（例えば大腸菌）を含むプレート上での培養が容易で安価であること、透明で取り扱いが便利であること、さらに線虫を凍結保存して長期保存が可能であることである。
タンパク質や脂質の分析は、研究室では常套手段であり、線虫の各発育段階（胚、幼虫L1-L4、成虫）の溶菌には、超音波を用いたサンプル調製法が確立されている。線虫はまた、標的タンパク質を過剰発現させるタンパク質発現系としても使用されるため、高いタンパク質収量が得られる、信頼性が高く再現性のある溶解およびタンパク質抽出法が必要とされる。超音波細胞破砕・抽出システムは、プローブタイプのホモジナイザーやマルチサンプル超音波発生器として利用できます。Hielscher Ultrasonics社は、便利なサンプル前処理とあらゆるサンプルサイズに対応し、お客様のラボ手順に理想的な超音波細胞破砕機を提供します。

エレガンス菌の破砕と溶解のための超音波プロトコル

線虫の超音波ホモジナイズと溶解、それに続くタンパク質と脂質の抽出は、異なるホモジナイズバッファーや溶解バッファーなどを用いて様々な手順で行うことができる。すべての溶解プロトコールに共通するのは、タンパク質の分解を防ぐためにサンプルを氷上に保ち続けなければならないということである。以下に、高品質なタンパク質や脂質を含む線虫サンプルを調製するための、信頼性が高く迅速な超音波溶解および抽出プロトコルをいくつか紹介する。

超音波による線虫溶菌の利点

• 信頼できる
• 再現可能
• 精密温度制御
• 信頼性の高いプロセス制御
• 穏便法
• 塗りやすい
• セーフ

線虫試料からの超音波タンパク質抽出

線虫の超音波溶解とタンパク質抽出は、様々なプロトコルを用いて行うことができる。以下に、再現性のあるタンパク質抽出のための、信頼性が高く迅速な溶解プロトコルをいくつか紹介する。

超音波処理による線虫細胞質エキスの迅速調製

以下のプロトコールにより、線虫ライセートを30分以内に調製することができる。
C.エレガンスのコレクション
線虫を1.5mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）にピックするか、プレートから1.5mlのPBSで洗浄する。2000rpmで1分間遠心し、ペレット化する。 サンプルは常に氷上で保存する。
その後、虫をPBSで2回洗浄する。
その後、ワムシをddH₂O.
少なくとも500lのホモジナイズバッファー（HB）にワムシを懸濁する。これでワムシサンプルは超音波溶解の準備ができた。
タンパク質抽出物の質を高めるには、PBSと滅菌した超純水（ddH₂O）またはショ糖浮遊を行う。ワムシサンプルは氷上で連続的に保存する。

線虫超音波溶解プロトコル

• 超音波ホモジナイザーが使用可能な状態（プローブの取り付け、超音波処理プログラムの設定済み）になるよう、前もって超音波ホモジナイザーの準備をしておく。

超音波プローブを1.5mlチューブに挿入する。

• UP200StまたはUP200Htで線虫を溶解する場合、マイクロチップ（例：2mmプローブS26d2；左写真参照）を用い、40％の振幅で1秒間、30秒間の休止を挟んで超音波処理を行う。線虫の溶解には、1秒間に30秒の休止を挟む超音波処理を5回繰り返すのが理想的である。初めて溶解を行う場合は、各パルス後にサンプルの小分量で顕微鏡を用いて溶解の進行を確認することができる。
• ワムシが破壊されると、溶解は正常に完了する。 過度の超音波照射は核の破砕を招き、試料が粘稠になったり発泡したりすると目に見えるようになる。サンプルの劣化を防ぐため、必要に応じてパルス数を増やしてください。高品質のタンパク質抽出物を得るために、各超音波パルスサイクルの時間を長くしないでください。
• 超音波溶解したワムシを14,000rpm、10分間、4℃で遠心分離し、細胞溶解液を除去する。
• その後、上清を新しいチューブに移し、免疫沈降やその他のアッセイに備える。

ホモジナイズバッファーの注意上記の超音波溶解プロトコール用のホモジナイズバッファーを以下のように調製する：

UIP400MTPプレートソニケーターによる96ウェルプレートでの線虫のハイスループット溶解

線虫溶菌（成虫）
UIP400MTP 80％振幅、20サイクル（各音波照射サイクル：30秒ON、30秒OFF）
溶解バッファー：

• オプション 1) 4% SDS、0.1 M Tris/HCl pH 8.0、1 mM EDTA
• オプション2）共免疫沈降（co-IP）用：10 mM Tris HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、0.5 mM EDTA、0.5 % NP-40 (Complete proteinase inhibitor cocktail)

ハイスループットDNAフラグメンテーション
線虫成虫DNA 200-300bp：UIP400MTPプレートソニケーター – 振幅80％、パルス数30 – 各30秒オン、30秒オフ

UIP400MTP プレートソニケーターは、マルチウェル、マイクロタイタープレート、96ウェルプレートのサンプルを均一に超音波処理します。

定量的アフィニティー精製アッセイのための線虫の超音波溶解

C.elegansの胚（1レプリケートあたり約200万個）は、若い雌雄同体の胚を漂白して生物学的に3連で新鮮に採取し、氷上で超音波処理した（サイクル：0.5秒、振幅：0.5秒）：0.5秒、振幅周期：0.5秒、振幅：40-45％、5ストローク／セッション、5セッション、セッション間隔：30秒：30 s; UP200S 超音波プロセッサー マイクロチップS26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)を使用）を溶解バッファー（全量：約600μl；50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10%グリセロール、プロテアーゼ阻害剤混合物、0.1% Nonidet P-40 Substitute）に溶解した。超音波処理後、Nonidet P-40 Substituteを1%まで添加し、ライセートを4℃で30分間head over tail rotationでインキュベートした後、4℃で20,000×g、20分間遠心分離した。その後、上部の脂質層を乱すことなく溶解液を吸引し、抗GFPアガロースビーズまたはブロッキングコントロールビーズに半分ずつ分けた（40～50μl）。4℃で60-90分間ヘッドオーバーテイル回転させた後、ビーズを0.1% Nonidet P-40 Substituteを含む溶解バッファーで1回洗浄し、続いてバッファーI（25 mm Tris-HCl、pH 7.4、300 mm NaCl、1 mm MgCl2）またはバッファーII（1 mm Tris-HCl、pH 7.4、150 mm NaCl、1 mm MgCl2）またはその両方で2回洗浄した。GFP:MBK-2のプルダウンについては、異なる洗浄条件を用いて2つの別々の実験を行った。タンパク質は、室温で50μlの6m尿素/2Mチオ尿素中でオービタルシェイクして溶出した。MBK-1::GFPのプルダウン実験では、90℃の8m塩化グアニジニウム50μl中で2回振とうしてタンパク質を溶出し、その後エタノール沈殿を行った。溶出したタンパク質サンプルを溶液中で消化した。
(参照：Chen et al.）

超音波によるミミズのホモジナイズと溶解

C.elegansの溶解とタンパク質抽出の手順は、1サンプルあたり該当するステージの30,000匹の線虫を集め、氷冷S-basalで洗浄し、1500 rpmで2分間遠心分離して濃縮し、氷冷S-basalで6回洗浄して残留細菌を除去した後、使用準備が整うまで氷上で保存した。タンパク質抽出のため、最後のS-basal洗浄後、妊娠成虫をコンパクトなペレットにした。ワムシのペレットを氷冷したExtraction Buffer [20 mMリン酸カリウム、pH 7.4、2mM EDTA、1% Triton-X-100、プロテアーゼ阻害剤（Sigma P2714）]1mlに懸濁し、直ちに処理した。
∼約30,000匹の胎仔成虫（湿重量約100 mgに相当）を、氷冷抽出バッファー1 ml中で、プローブ型超音波発生装置（例：UP50H、マイクロチップMS2付き）を用いて、振幅40％、オン3秒、オフ30秒を10サイクル、氷上で超音波処理した（cf. Baskharan et al.(cf. Baskharan et al. 2012)

線虫からの超音波脂質抽出

メタボロミクスの一分野であるリピドミクスでは、生体系の脂質相補体の特性評価と解析が行われる。線虫はリピドミクスにおいて、代謝脂質の相互作用と健康や寿命への影響を調べるために広く用いられている。
線虫の胚、幼虫、成虫からスフィンゴ脂質のような脂質を遊離させるために、超音波による溶解と抽出を行う。超音波処理は、線虫のホモジネートを調製し、その後、サンプルから脂質を抽出するために使用される。
線虫からの超音波脂質抽出プロトコール
線虫ペレットを氷上で解凍し、0.5mlの超純水で懸濁する。線虫サンプルを1.5mL試験管に入れ、氷上に保ちながら超音波処理する。
のような超音波プローブを用いてソニケーションを行うことができる。 UP200Ht超音波サンプル前処理装置 バイアルツイーター (10サンプル同時超音波処理）または UIP400MTP (96ウェルプレートなどのマルチウェルプレートの超音波溶解用）。UP200Ht での超音波溶解には、マイクロチップ S26d2 を使用します。デジタルメニューで超音波サイクルモードを事前に設定する。振幅を10％に設定し、超音波サイクルモードを2秒パルス、20サイクルとし、各超音波パルスバースト間に30秒の休止を入れる。
上清をスクリューキャップ付きガラス管に移す。各ガラス管に1mlの超純水を加え、次に6mlのクロロホルム／メタノール（比＝2：1）混合液を加えてフォルチ抽出を行う。
各ガラス管を30秒間、4回ボルテックスする。1,258 x gで15分間遠心し（Eppendorf, 5810 R）、相分離をさらに促進する。ガラス製パスツールピペットを用いて、下部疎水性画分を清潔なガラス管に移す。下部疎水性画分を窒素気流下で窒素エバポレーターで乾燥させる。乾燥したペレットは、使用するまで-80℃の冷凍庫で保存する。

超音波によるミミズ溶解液の調製

ワムシ溶解液：L4期のワムシを回収し、M9緩衝液（42.26 mM Na₂HPO₄22.04 mM KH₂プライベートオファーリング₄85.56mMのNaCl、0.87mMのMgSO₄)ですべてのバクテリアを除去した。M9バッファーをできるだけ除去した後、ワムシを溶解バッファーに再懸濁した：50mM HEPES、50mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、5mM リン酸β-グリセロール、0.1% (v/v) Triton X-100、50mM フッ化ナトリウム、1mM オルトバナジン酸ナトリウム、5mM ピロリン酸ナトリウム、0.2mM フェニルメタンスルホニルフルオリド、プロテアーゼ阻害剤。ワムシを液体窒素で凍結し、37℃で3回解凍した後、ドライアイス上で超音波VialTweeterユニットを用いてワムシを超音波処理し、10本のサンプルチューブを同時に調製した。超音波処理は、50％の振幅で2秒間のサイクルを10回行った。その後、サンプルを12000rpm、4℃で15分間遠心分離した。上清を回収し、-70℃で保存した。アリコートをBradford assayによるタンパク質定量に使用した。
総グルタチオン、GSH、GSSGの定量：グルタチオンの定量は、溶解と定量を同日に行った。グルコースを与えた幼虫とコントロールのL4幼虫を採取し、M9緩衝液で3回洗浄した。M9緩衝液を可能な限り除去した後、氷冷したメタリン酸（5% w/v）に懸濁し、氷中で、超音波VialTweeterを用い、50%の振幅で、2秒間の超音波照射を10サイクル、各サイクルの間に30秒の休止を入れた。その後、12000rpm、4 ̊Cで15分間遠心した。
(参照：Alcántar-Fernández et al.）

免疫沈降およびウェスタンブロッティング前の線虫サンプル前処理

簡単に説明すると、胚抽出のために、線虫L1幼虫を大規模液体S培地培養で成虫まで成長させた。胚は標準的なブリーチ法で回収し、溶解バッファー（50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8.7% グリセロール, 0.05% NP-40, 1􏰅 Protease Inhibitor Cocktail, and 1􏰅 Phosphatase Inhibitor Cocktail I and II）に懸濁し、液体窒素で急速凍結した。 UP200Ht S26d2を使用し、30％の振幅で10秒間にわたり10パルス。より多くの試料を調製する必要がある場合は、S26d2 を用いて超音波 バイアルツイーター またはMultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP（ウェルプレート用）を推奨する。超音波処理後、抽出液を30,000g、20分間、4℃で遠心分離してプレクリアーした。プレクリアーした抽出液（総タンパク質300µg）を、プロテインA-アガロースに架橋した抗CDC-25.1アフィニティー精製抗体（本研究）40µ􏰂gとインキュベートした。コントロールとして、プロテインA-アガロースに架橋した同量のウサギ免疫グロブリン（Ig）Gを、マトリックスへのタンパク質の非特異的結合を減少させる1% NP-40を含む溶解バッファー全量200µl中で使用した。サンプルを4℃で1時間回転させ、ビーズを溶解バッファーで3回洗浄し、30µlのグリシン/HClと200 mM NaCl、pH 2.2で溶出した。免疫沈降後、溶出液を30μ􏰂lのSDSサンプルバッファーで希釈し、95℃で4分間加熱した。通常、インプットは全体の3%、溶出液は30%をSDS-PAGEにアプライし、抗CDC-25.1抗体（1:400）、抗LIN-23抗体（1:750）、抗ユビキチン抗体（1:1000）、抗GSK3􏰁抗体（1:500）、または抗􏰁β-アクチン抗体（1:2000）を用いてウェスタンブロッティングを行った。抽出物が免疫沈降に供されなかった場合、それらの抽出物に由来する同量の全タンパク質をSDSサンプルバッファーに再懸濁し、95℃に加熱した後、SDS-PAGEに直接アプライし、ウェスタンブロッティングで分析した。(参照：Segrefら、2020年）

正確な温度制御下での超音波溶解

正確で信頼できる温度制御は、生物学的サンプルを取り扱う際に極めて重要である。高温はサンプルの熱によるタンパク質分解を引き起こします。
すべての機械的サンプル前処理技術と同様に、超音波処理でも熱が発生します。しかし、VialTweeterを使用すると、サンプルの温度を適切に制御できます。VialTweeterとVialPressを使用して分析用の試料を調製する際に、試料の温度をモニターおよび制御するためのさまざまなオプションをご紹介します。

1. サンプル温度のモニタリングVialTweeterを駆動する超音波プロセッサUP200Stには、インテリジェントなソフトウェアとプラグ式温度センサが搭載されています。温度センサーをUP200Stに差し込み、温度センサーの先端をサンプルチューブに挿入します。デジタルカラータッチディスプレイにより、UP200Stのメニューでサンプルの超音波処理に必要な特定の温度範囲を設定できます。最大温度に達すると超音波処理装置が自動的に停止し、試料温度が設定温度∆の下限値まで下がるまで一時停止します。その後、超音波処理を自動的に再開します。このスマートな機能により、熱による劣化を防ぐことができます。
2. VialTweeterブロックは予冷できます。VialTweeterブロック（トランスデューサなしのソノトロードのみ！）を冷蔵庫または冷凍庫に入れ、チタンブロックを予冷することで、サンプルの温度上昇を遅らせることができます。可能であれば、サンプル自体も予冷することができます。
3. 超音波処理中の冷却にはドライアイスを使用します。ドライアイスを満たした浅いトレイを使用し、VialTweeterをドライアイスの上に置いて、熱が急速に放散するようにします。

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Hielscher Ultrasonics社は、実験室用、ベンチトップ用、工業用スケールシステム用の高性能超音波細胞破砕機およびホモジナイザーの長年の経験を持つメーカーです。お客様の細菌細胞培養サイズ、研究または生産目標、1時間または1日に処理する細胞量は、お客様のアプリケーションに適した超音波細胞破砕機を見つけるための重要な要素です。
Hielscher Ultrasonics社は、マイクロタイタープレート/96ウェルプレートなどの大量サンプルだけでなく、マルチサンプル（最大10バイアル）の同時超音波処理、50～400ワットまでの様々な出力レベルを持つ古典的なプローブタイプのラボ用超音波処理装置から、大量生産における商業的な細胞破砕やタンパク質抽出のための1台あたり最大16,000ワットの完全工業用超音波処理装置まで、様々なソリューションを提供しています。Hielscher社の超音波処理装置はすべて、24時間365日のフル負荷運転に対応しています。堅牢性と信頼性は、当社の超音波装置の中核をなす特徴です。
すべてのデジタル超音波ホモジナイザーは、スマートソフトウェア、カラータッチディスプレイと自動データプロトコールが装備されており、超音波デバイスは、研究室や生産施設での便利な作業ツールになります。
どのような種類の細胞を、どのような体積で、どのような周波数で、どのようなターゲットで、生物試料を処理する必要があるかお知らせください。最適な超音波細胞破砕機をご提案いたします。

下の表は、コンパクトなハンドヘルド・ホモジナイザーやマルチサンプル超音波処理装置から、業務用の工業用超音波処理装置まで、当社の超音波処理システムのおおよその処理能力を示しています：