C.エレガンスサンプルの超音波調製

C.エレガンスサンプルの超音波調製

C.エレガンは回虫であり、ゲノム学、発生生物学、疾患を調査するために研究所で広く使用されています。C.エレガンスのゲノムの多くの遺伝子は、ヒトに機能的な対応を持っています。それにより、線虫はヒト疾患にとって極めて有用なモデルである。C.エレガンスの広い使用のための他の利点は、細菌(例えば、大腸菌)を含むプレート上のその簡単で安価な栽培、その透明性、便利な取り扱い、ならびにより長い期間のワームを凍結し、保存する可能性である。
タンパク質および脂質分析は、実験室での規則的な手順であり、超音波サンプル調製は、すべての発達段階(すなわち胚、幼虫L1-L4、成人)においてC.エレガンス線虫をライゼする確立された方法である。C.エレガンスは標的タンパク質を過剰発現させるタンパク質発現系としても使用されているため、高いタンパク質収量を与える信頼性の高い再現性のある糖質およびタンパク質抽出法が必要です。超音波細胞破壊および抽出システムは、プローブ型ホモジナイザーとして、およびマルチサンプル超音波装置として利用可能です。便利なサンプルの準備およびサンプルサイズの番号のすべての種類にケータリング、ヒールシャー超音波はあなたの実験室のプロシージャのための理想的な超音波細胞の破壊器を持っている。

C.エレガンスの破壊とリシスのための超音波プロトコル

C.エレガンスの超音波均質化およびリシスおよびその後のタンパク質および脂質抽出は、異なる均質化およびリシスバッファーなどを使用して様々な手順を使用して行うことができる。すべてのライシスプロトコルは、タンパク質の分解を防ぐためにサンプルを継続的に氷上に保たなければならないという共通点があります。以下では、高品質のタンパク質または脂質含有C.エレガンスサンプルの調製のための信頼性の高い、迅速な超音波ライシスおよび抽出プロトコルを提示します。

超音波C.エレガンス・リシスの利点

• 信頼性のある
• 再現性
• 正確に温度制御
• 信頼性の高いプロセス制御
• 穏やかな方法
• 適用しやすい
• 安全

C.エレガンスサンプルからの超音波タンパク質抽出

C.エレガンスワームの超音波リシスおよびタンパク質抽出は、様々なプロトコルを使用して行うことができる。以下では、再現性のあるタンパク質抽出結果のための信頼性の高い迅速なリシスプロトコルをいくつか紹介します。

超音波処理によるC.エレガンスワームからの細胞種抽出物の迅速な予分化

以下のプロトコルを使用すると、30分以内にC.エレガンスライセートを準備することができます。
エレガンスのコレクション
所望のC.エレガンスワームを1.5mlチューブリン酸緩衝生理食塩分(PBS)に選ぶか、1.5ml PBSのプレートから洗浄します。ペレットに2000rpmで1分間の遠心分離機。 氷の上で常にサンプルを保管してください。
次に、PBSでワームを2回洗浄します。
その後、ddH でワームを 2 回洗います。₂O。
少なくとも500ulの均質化バッファ(HB)でワームを再中断する。ワームサンプルは超音波の分析の準備が整いました。
より高いタンパク質抽出物の品質のために、PBSでそれぞれ5分間ワームを洗浄し、無菌で超純水(ddH)を洗浄することで細菌汚染を減らしたいかもしれません。₂O)、またはショ糖浮遊を行う。ワームサンプルを氷の上に連続的に保管してください。

超音波C.エレガンス・ライシスプロトコル

• 超音波ホモジナイザーが使用できる状態になるように、超音波装置を事前に準備してください(プローブマウント、超音波処理プログラム事前設定)。

超音波処理器がスタンドマウントされている場合は、サンプルチューブを超音波プローブの下に入れ、超音波プローブを1.5mlチューブに挿入します。

• UP200StまたはUP200Htを用いたC.エレガンスリシスの場合、超音波処理は、マイクロチップ(例えば、2mmプローブS26d2;左図)を使用して、30秒の休止で1秒間に40%の振幅で行われるべきである。30秒の休止を伴う1秒ごとに5回の超音波処理サイクルは、C.エレガンスの起合に最適です。初めてリシスを行う場合は、顕微鏡を用いて各パルス後のサンプルの小さなアリコートでの分解の進行を確認することができます。
• リシスは、ワームが中断されると正常に完了します。 過剰超音波処理は、核の破損をもたらし、サンプルが粘性または泡になると目に見えるようになります。サンプルの劣化を防ぐには、必要に応じてパルスを多く使用します。高品質のタンパク質抽出物を得るために、各超音波パルスサイクルの時間を増やしないでください。
• 透明な細胞は、超音波でリジングされたワームを4ºCで10分間14,000rpmで遠心分離することによってリセートする。
• 次いで、上清を新しいチューブに移し、免疫沈降または他のアッセイの準備をします。

ホモジナイゼーションバッファの場合:上記の超音波ライシスプロトコル用のホモジナイゼーションバッファを次のように準備します。

定量的アフィニティー精製アッセイのためのC.エレガンスの超音波リシス

C.エレガンス胚(反復1回あたり200万個)は、若いグラビッド雌雄同体を漂白して生物学的三重化で新たに収穫され、氷上で超音波処理された(サイクル:0.5秒、振幅:40〜45%、5ストローク/セッション、5セッション、セッション間の間隔:30秒; UP200S超音波プロセッサ マイクロチップS26d2(ヒールシャー超音波GmbH)))を使用))、リシスバッファー(総体積:600 μl;50 mm Tris-HCl、pH 7.4、100 mm KCl、1 mm MgCl2、1 mm EGTA、1 mm DTT、10%グリセロール、プロテアーゼ阻害剤、0.1%非Pt.40)。超音波処理後、ノニデトP-40代用を1%まで添加し、ライセートを4°Cで頭上の尾回転で30分間インキュベートし、続いて20,000×gで4°Cで20分間遠心分離した。 その後、クリアしたリセートを上部脂質層を乱さずに吸引し、抗GFPアガロースビーズまたはブロックされたコントロールビーズ(40〜50 μl)のいずれかに半分に分割した。4°Cで60~90分間のヘッドオーバーテール回転後、 ビーズを0.1%ノニデトP-40代替を含むリシスバッファーで1回洗浄し、続いて2回洗浄したバッファーI(25 mmトリス-HCl、pH 7.4、300 mm NaCl、1 mm MgCl2)またはバッファII(1 mm Tris-HCl、pH 7.4、150 mm NaCl、1 mmMg2)のいずれかで洗浄を行います。GFP:MBK-2プルダウンでは、異なる洗浄条件を用いて2つの別々の実験を行った。タンパク質は、室温で6m尿素/2Mチオ尿素の50μlの軌道揺れによって溶出した。MBK-1::GFPプルダウン実験では、タンパク質を90°Cで8mの塩化グアニジニウムの50μlで振盪し、エタノール沈殿を2回行った。溶出したタンパク質サンプルを溶液中で消化した。
(陳ら、2016年)

超音波ワーム均質化とリシス

C.elegans lysisとタンパク質抽出手順では、関連する段階の30,000本のネモトデスをサンプルごとに採取し、氷冷S基底で洗浄し、1500rpmで2分間遠心分離して濃縮し、氷冷S基底で6回洗浄して残留細菌を除去し、使用準備が整うまで氷の上に貯蔵した。タンパク質抽出のために、グラビッド成虫は、最後のS基底洗浄後にコンパクトペレットを形成させた。次いで、1mlの氷冷抽出バッファーに1mlの懸濁液を再懸濁した[20mMリン酸カリウム、pH 7.4、2mM EDTA、1%トリトンX-100、プロテアーゼ阻害剤(Sigma P2714)を直ちに処理した。
〜30,000グレイド-アダルトワーム(100mgの湿式重量に対応)は、プローブタイプの超音波処理器(例えばマイクロチップMS2のUP50H)を使用して氷上で超音波処理し、10サイクルの3秒間、30秒オフ、1mlの氷冷抽出バッファーで超音波処理を行った。(2012年バスカランら)

C.エレガンスからの超音波脂質抽出

メタボロミクスの分岐であるリピドミクスでは、生物学的系の脂質補体が特徴付かれ、分析される。C. エレガンスは、代謝脂質の相互作用と健康と寿命への影響を調べるリピドミクスで広く使用されています。
超音波リシスおよび抽出は、C.エレガンス胚、幼虫、および成虫からスフィンゴ脂質などの脂質を放出するために使用されます。超音波処理は、ワームホモジエートを調製し、その後、サンプルから脂質を抽出するために使用されます。
C.エレガンスからの超音波脂質抽出プロトコル
氷の上にC.エレガンペレットを解凍し、0.5 mlの超水で再中断します。
C.エレガンスサンプルを1,5mLの試験管で超音波処理し、サンプルを氷の上に連続的に保ちます。
超音波処理は、プローブ超音波スタなどを使用して行うことができます。 Uf200ःトン、超音波サンプル準備ユニット VialTweeter (10サンプルの同時超音波処理)または UIP400MTP (96ウェルプレートなどのマルチウェルプレートの超音波処理のために)UP200Htとの超音波リシスのためにマイクロチップS26d2を使用して、デジタルメニューに超音波サイクルモードを事前に設定します。振幅を10%に設定し、超音波パルスバーストの間に30秒のポーズで20サイクルの2秒パルスの超音波サイクルモードを設定します。
上清をねじキャップ付きガラス管に移します。
各ガラス管に1mlの超水を加えて、各ガラス管に6mlのクロロホルム/メタノール(比=2:1)混合物を加えて、フォルチ抽出を行う。
各ガラス管を30秒間4回渦を起たします。
15分間1,258 x gでチューブを遠心分離し、相分離をさらに強化します。
低温殺菌ピペットで、低疎水性分率をクリーンガラスチューブに移します。
窒素蒸発器で窒素流下の低疎水性分率を乾燥させます。
乾燥したペレットを使用するまで-80°Cの冷凍庫に保管してください。

ワームライセートの超音波調製

ワームリセート:L4ステージワームを収穫し、M9バッファ(42.26 mM Na)で3回洗浄しました₂HPO₄、22.04 mM KH₂Po₄、85.56 mM NaCl、および0.87 mM MgSO₄)を使用して、すべての細菌を除去します。M9バッファを可能な限り除去した後、リシスバッファに再懸濁したワーム:50 mM HEPES、 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM リン酸 β-グリセロール, 0.1% (v/v) トリトン X-100, 50 mM フッ化ナトリウム, 1 mM オルトバナジン酸ナトリウム, 5 mM ピトロリン酸ナトリウム, 0.2 mM フェニルメタンスルホニルフルオールイドおよびプロテアーゼ阻害物質.ワームは液体窒素で凍結し、37°Cで3回解凍し、その後、ワームは10サンプルチューブの同時調製のために超音波VialTweeterユニットでドライアイス上で超音波処理された。超音波処理は、超音波バースト間の30秒の休止で2秒の10サイクルで50%振幅で行った。その後、サンプルを4°Cで12000rpmで15分間遠心分離した。上清を集め、-70°Cで保存した。 アリコートは、ブラッドフォードアッセイによるタンパク質定量に使用された。
グルタチオン、GSH、およびGSSGの定量:グルタチオン定量のために、同じ日に糖および決定を行った。グルコース供給および制御L4幼虫を収穫し、M9緩衝液で3回洗浄した。M9緩衝液を可能な限り除去した後、ワームは氷冷メタリン酸(5%w/v)で再懸濁し、その後、ワームは超音波Vialツイーターで氷中で超音波処理され、2秒間の10回の超音波サイクルで超音波処理され、各サイクル間の休止時間が30秒であった。その後、4̊Cで12000rpmで15分間遠心した。
(cf. アルカンタル=フェルナンデスら, 2018)

免疫沈降およびウェスタンブロッティング前のC.エレガンスサンプル調製

簡単に言えば、胚性抽出物については、C.エレガンスL1幼虫が成人期までの大規模な液体S培地培養で増殖した。胚を標準的な漂白剤法を用いて採取し、リシスバッファー(50 mM Tris、 pH 7.5,100 mM KCl,1 mM EDTA,1 mM MgCl2,8.7%グリセロール,0.05%NP-40,0.05%NP-40,1􏰅プロテアーゼ阻害剤カクテル,1􏰅ホスファターゼ阻害剤カクテルI.とII))を液体窒素中で素早く凍結し、超音波細胞破壊による超音波細胞破壊による分解 Uf200ःトン S26d2で10以上の10パルスの30%振幅で。より多くのサンプルを超音波を準備する必要がある場合 VialTweeter または、よくプレート用のマルチサンプル超音波測定器UIP400MTPをお勧めします。超音波処理の後、抽出物は4°Cで20分間30,000gの遠心分離によって予めクリアされた。 クリア済抽出物(全タンパク質の300μg)を40μ􏰂gの抗CDC-25.1アフィニティー精製抗体(本研究)と共にインキュベートし、タンパク質A-アガロースに架橋し、 または対照として、タンパク質A-アガロースに架橋した同様の量のウサギ免疫グロブリン(Ig)Gを、1%NP-40を含むリシス緩衝液の総体積200μlに使用し、その含有を含むタンパク質の非特異的結合をマトリックスに含めた。サンプルを4°Cで1時間回転させ、ビーズをリシスバッファーで3回洗浄し、グリシン/HClと200 mM NaCl、pH 2.2で30μl溶出した。免疫沈降後、溶出液を30μ􏰂lのSDSサンプルバッファーで希釈し、95°Cに加熱して4分間加熱し、 典型的には、入力の合計の3%および溶出物の30%がSDS-PAGEに適用され、続いて抗CDC-25.1(1:400)、抗LIN-23(1:750)、抗ユビキチン(1:1000)、抗GSK3􏰁(1:500)、または抗􏰁β 10(抗行動)を用いたウェスタンブロッティングが続いた。抽出物が免疫沈降を受けなかった場合、それらの抽出物に由来する同量の全タンパク質をSDSサンプルバッファーに再懸濁し、95°Cに加熱し、SDS-PAGEに直接塗布し、ウェスタンブロッティングによって分析した。(cf. セグレフら 2020)

プレシス温度制御下の超音波リシス

生物学的サンプルを扱う際には、正確で信頼性の高い温度制御が重要です。高温は、サンプル中に熱誘発タンパク質分解を開始します。
すべての機械的サンプル調製技術として、超音波処理は熱を作成します。ただし、VialTweeterを使用する場合、サンプルの温度を十分に制御できます。分析のためにVialTweeterとVialPressでそれらを準備しながら、あなたのサンプルの温度を監視し、制御するための様々なオプションを提示します。

1. サンプル温度を監視する:VialTweeterを駆動する超音波プロセッサUP200Stは、インテリジェントなソフトウェアとプラグ可能な温度センサーが装備されています。温度センサーをUP200Stに差し込み、温度センサーの先端をサンプルチューブの1つに差し込みます。デジタルカラーのタッチディスプレイを介して、UP200Stのメニューでサンプル超音波処理のための特定の温度範囲を設定することができます。超音波処理器は、最大温度に達すると自動的に停止し、サンプル温度が設定温度の低い値まで∆されるまで一時停止します。その後、超音波処理が再び自動的に開始します。このスマートな特徴は熱誘起の低下を防ぐ。
2. VialTweeterブロックは事前に冷却することができます。VialTweeterブロック(トランスデューサーなしのソトロードのみ!)を冷蔵庫または冷凍庫に入れて、チタンブロックを事前に冷却すると、サンプルの温度上昇を延期するのに役立ちます。可能であれば、サンプル自体も事前に冷却することができます。
3. 超音波処理中に冷却するためにドライアイスを使用してください。ドライアイスで満たされた浅いトレイを使用し、熱が急速に消散できるようにドライアイスの上にVialTweeterを置きます。

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どのような細胞、どのような体積、周波数、どのようなターゲットを使用して生物学的サンプルを処理する必要がありますのかお知らせください。私たちはあなたのプロセスの要件に最適な超音波セルの破壊を推奨します。

以下の表は、コンパクトなハンドヘルドホモジナイザーやマルチサンプル超音波装置から商用アプリケーション用の産業用超音波プロセッサまでの超音波システムのおおよその処理能力を示しています。