ウェスタンブロッティングのための超音波溶解
- ウェスタンブロットは、組織ホモジネートや細胞エキスのサンプル中の特定のタンパク質を検出するための分析手順である。
- ウエスタンブロットや酵素活性測定を行うには、多くのアッセイで細胞内に取り込まれた物質（タンパク質、DNA、細胞内断片など）にアクセスする必要がある。
- ソニケーションは、コントロールされた細胞破砕と溶解のための、信頼性が高く扱いやすい方法である。
超音波による細胞破壊
組織や培養細胞からのタンパク質抽出は、多くの生物学的、生化学的、分析的技術（PAGE、ウェスタンブロッティング、ELISA、質量分析など）やタンパク質精製の最初のステップである。高いタンパク質収量を得るためには、細胞材料や組織を効率的に破砕/溶解する必要があります。植物細胞であれ、動物組織であれ、超音波処理は細胞溶解液を簡単かつ迅速に調製する方法です。
ソニケーションの利点
- 速い & 効率的
- 簡単操作
- 高タンパク収量
- 再現性／繰り返し可能
- 精密制御
- スケーラブル
ヴァイアルトゥイーター 細胞破砕やタンパク質分離などの超音波サンプル前処理用
ウェスタン免疫ブロッティングのための免疫沈降プロトコール
A.試薬
溶液の調製には、Milli-Qなどの精製水を使用する。
- 1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）
- 1X 細胞溶解バッファー：20 mM Tris（pH7.5）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM ピロリン酸ナトリウム、1 mM β-グリセロリン酸、1 mM Na3VO4、1 μg/ml ロイペプチン
重要：使用直前に1 mM PMSFを加える。 - IP には 15 μl Protein A+15 μl Protein G で十分ですが、一次抗体やサンプル量にもよります。あらかじめプロテインA/Gを混合したアガロースを使用することもできます（例：ウサギIgGプルダウンにはプロテインA、マウスIgGプルダウンにはプロテインG）。
- 3X SDSサンプルバッファー：187.5 mM Tris-HCl（pH6.8、25℃）、6% w/v SDS、30% グリセロール、150 mM DTT、0.03% w/v ブロモフェノールブルー
B.細胞溶解物の調製
- 細胞を回収する。非変性条件下で細胞を採取するには、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を一度すすぐ。
- PBSを除去し、氷冷した1X細胞溶解バッファー0.5mlを各プレート（10cm）に加え、氷上で5分間インキュベートする。
- プレートから細胞をこすり落とし、微量遠心チューブに移す。氷上で保存する。
- 氷冷した免疫沈降バッファー（IPバッファー）中で10秒間超音波処理を2回行う：50 mM Tris-HCl [pH 7.4]、150 mM NaCl、5 mM EDTA、0.1% NP-40、プロテアーゼ阻害剤ミックス）。超音波処理には バイアルツイーター のようなプローブ超音波発生器も使用できる。 UP100H または UP200Ht が最も適している。
- ライセートを15,000 gで10分間、4℃で遠心する。
- 上清を新しいチューブに移す。(必要に応じて、溶解液は-80℃で保存できる）。
- 上清に一次抗体を加える。一次抗体を加えた上清を、軽く攪拌しながら4℃で1時間インキュベートする。一次抗体は通常、ウェスタンブロッティングで使用する量の10倍濃度で添加する。(100μLあたり1μgから始めてもよい）。
- その上清を、プロテインAアガロース（Invitrogen）とプロテインGアガロースの等量混合物とさらに1時間インキュベートする。
- アガロースペレットをIPバッファーで3回洗浄する。その後、結合したタンパク質をSDS-PAGEローディングバッファーで95℃、5分間加熱して抽出する。
C.免疫沈降
- 200μlの細胞溶解液をとり、一次抗体を加える。4℃で一晩、穏やかに揺り動かしながらインキュベートする。
- プロテインAまたはGアガロースビーズ（50％ビーズスラリー20μl）を加える。穏やかに揺り動かしながら、4℃で1～3時間インキュベートする。
- 4℃で30秒間微量遠心する。500μlの1X細胞溶解バッファーでペレットを5回洗浄する。洗浄中は氷上に置く。
- ペレットを20μlの3X SDSサンプルバッファーで再懸濁する。ボルテックス後、30秒間微量遠心する。
- サンプルを95～100℃で2～5分間加熱し、14,000 X gで1分間微量遠心する。
- サンプル（15～30μl）をSDS-PAGEゲル（12～15％）にロードする。
- ウェスタンブロッティングでサンプルを分析する。
ソニケーターUP50Hによるウェスタンブロット分析
Kriebischら（2011）の研究では、プローブ型ソニケーターUP50Hを用いた以下のプロトコルが用いられた：
で処理したMC3T3-E1細胞から全タンパク質を単離した。2D3 (10-8 M）またはビヒクルで溶解した。50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) および 0.5% デオキシコール酸ナトリウム (Merck) を含むバッファーで細胞を溶解した。細胞溶解液をサイクル1、振幅80で2×10秒間超音波処理した。 UP50H 超音波プロセッサー (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germany）。その後、14,000rpmで10分間遠心し、上清をウェスタンブロッティングに用いた。25μgのタンパク質をサンプルバッファーと還元剤（Invitrogen）で煮沸し、その後4-12％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen）を用いてSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースメンブレン（GE health care）に転写した。膜は、1％カゼイン（Sigma-Aldrich）と1％Tris（1M）を含むTBS（10mM Tris-HCl; pH7.6; 150mM NaCl）で1時間ブロッキングした。ブロッキング後、一次抗体（ウサギ抗ヒトCBS 1/500、Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USAの研究室で開発）と共に4℃で一晩、わずかに攪拌しながらメンブレンをインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HPR）標識二次抗体（Dako）と室温で1時間インキュベートした。すべてのブロットをenhanced chemiluminescence（Perkin Elmer）で現像した。
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下の表は、ラボ用超音波処理装置の処理能力の目安です：
| 推奨デバイス | バッチ量 | 流量 |
|---|---|---|
| UIP400MTP 96ウェルプレートソニケーター | マルチウェル／マイクロタイタープレート | n.a. |
| 超音波カップホーン | バイアルまたはビーカー用カップホーン | n.a. |
| GDmini2 | 超音波マイクロフローリアクター | n.a. |
| バイアルツイーター | 00.5〜1.5mL | n.a. |
| UP100H | 1〜500mL | 10～200mL/分 |
| UP200Ht, UP200St | 10〜1000mL | 20～200mL/分 |
| UP400ST | 10〜2000mL | 20～400mL/分 |
| 超音波ふるい振とう機 | n.a. | n.a. |
お問い合わせ/ お問い合わせ
UIP400MTP プレートソニケーター 96ウェルプレートのハイスループット超音波処理用
ウェスタンブロッティングについて
ブロットは、DNA、RNA、タンパク質が分離できるように担体上に転写される分析手順である。
DNAの検出にはサザンブロット、RNAの検出にはノーザンブロット、タンパク質の検出にはウェスタンブロットが用いられる。
ウェスタンブロッティングは、抗体を用いて抗原を特異的に検出することから、タンパク質免疫ブロッティングとも呼ばれる。ウェスタンブロッティングは、試料中の特定のタンパク質を検出するための最も重要な分析法の一つである。ウエスタンブロットでは、タンパク質を膜上に固定化し、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて検出する。
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により、ネイティブタンパク質は3次元構造で、変性タンパク質はポリペプチドの長さで分離される。その後、タンパク質はメンブレン（通常はニトロセルロースまたはPVDF）に移され、標的タンパク質に特異的な抗体で染色される。ゲル電気泳動のステップは、抗体の交差反応性の問題を解決するためにウェスタンブロット分析に含まれる。
その後、分離されたタンパク質はマトリックス（主にニトロセルロースまたはPVDF膜）にブロットされ、そこで抗体で染色される。抗体はプローブとして機能し、標的タンパク質に特異的に選択される。特異的反応の位置と強度を分析することで、与えられたサンプル中の標的タンパク質の発現の詳細が明らかになる。ウェスタンブロット法は、ゲル電気泳動の高分解能とイムノアッセイの強い特異性と高感度により、わずか1ngの標的タンパク質を検出することができる。ウェスタンブロット法は、分子生物学、生化学、免疫遺伝学、その他の分子研究分野で使用されている。
その他の関連技術としては、ドットブロット分析、免疫組織化学、免疫細胞化学（抗体を用いて組織や細胞中のタンパク質を免疫染色で検出する）、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）などがある。
文献・参考文献
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.
