ウェスタンブロッティングのための超音波溶解

• ウェスタンブロットは、組織ホモジネートまたは細胞抽出液のサンプル中に含まれる特定のタンパク質を検出する分析手法です。
• ウェスタンブロットの実施や酵素活性の測定では、多くのアッセイで、細胞内に閉じ込められた物質（タンパク質、DNA、細胞内の断片など）を取り出す必要があります。
• 超音波処理は、細胞破砕と溶解を制御しながら行うための、信頼性が高く扱いやすい方法です。

超音波による細胞破砕

組織や培養細胞からのタンパク質抽出は、多くの生物学的、生化学的、分析的手法（PAGE、ウェスタンブロッティング、ELISA、質量分析など）やタンパク質精製の最初の工程です。高いタンパク質収量を得るには、細胞材料や組織を効率よく破砕・溶解する必要があります。植物細胞でも動物組織でも、超音波処理を用いれば、細胞溶解液を簡単かつ迅速に調製できます。

超音波処理の利点

• 迅速かつ効率的
• 簡単な操作
• 高いタンパク質収量
• 再現性・反復性
• 精密な制御
• スケール変更が可能

ウェスタンイムノブロッティングのための免疫沈降プロトコル

A. 試薬

溶液の調製には、Milli-Qなどの精製水を使用してください。

• 1X リン酸緩衝生理食塩水（PBS）
• 1X 細胞溶解バッファー：20 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、2.5 mM ピロリン酸ナトリウム、1 mM β-グリセロリン酸、1 mM Na3VO4、1 μg/ml ロイペプチン
  重要：使用直前に1 mM PMSFを添加してください。
• 15 μlのプロテインA＋15 μlのプロテインGでIPには十分ですが、一次抗体やサンプル量によって異なる場合があります。あらかじめ混合したプロテインA/Gアガロースも使用できます（例：ウサギIgGのプルダウンにはプロテインA、マウスIgGのプルダウンにはプロテインG）。
• 3X SDSサンプルバッファー：187.5 mM Tris-HCl（25°CでpH 6.8）、6% w/v SDS、30% グリセロール、150 mM DTT、0.03% w/v ブロモフェノールブルー

B. 細胞溶解液の調製

• 細胞を回収します。非変性条件下で細胞を回収するには、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を一回洗浄します。
• PBSを除去し、各プレート（10 cm）に氷冷した1X細胞溶解バッファーを0.5 ml添加して、プレートを氷上で5分間インキュベートします。
• プレートから細胞を掻き取り、マイクロ遠心チューブに移します。氷上に保持します。
• 10秒間の超音波処理を二回行います。氷冷した免疫沈降バッファー（IPバッファー：50 mM Tris-HCl [pH 7.4]、150 mM NaCl、5 mM EDTA、0.1% NP-40およびプロテアーゼ阻害剤混合物）中で処理します。超音波処理には、 VialTweeter、 またはプローブ型超音波処理装置である UP100H や UP200Ht などが最も適しています。
• 細胞溶解液を4°C、15,000 gで10分間遠心分離します。
• 上清を新しいチューブに移します。（必要に応じて、細胞溶解液は –80°Cで保存できます。）
• 上清に一次抗体を添加します。一次抗体を添加した上清を、軽く撹拌しながら4°Cで1 hインキュベートします。一次抗体は通常、ウェスタンブロッティングで使用する濃度の10xとなる量を添加します。（100μLあたり1μgから開始してもかまいません。）
• 続いて、等量のプロテインAアガロース（Invitrogen）とプロテインGアガロースの混合物を加え、上清をさらに1 hインキュベートします。
• アガロースのペレットをIPバッファーで三回洗浄します。その後、SDS-PAGEローディングバッファーを用い、95°Cで5分間加熱して、結合したタンパク質を抽出します。

C. 免疫沈降

• 細胞溶解液を200 μl取り、一次抗体を添加します。穏やかに揺動させながら、4°Cで一晩インキュベートします。
• プロテインAまたはGのアガロースビーズ（50%ビーズスラリーを20 μl）を添加します。穏やかに揺動させながら、4°Cで1–3時間インキュベートします。
• 4°Cで30秒間マイクロ遠心分離します。ペレットを500 µlの1X細胞溶解バッファーで五回洗浄します。洗浄中は氷上に保持します。
• ペレットを20 μlの3X SDSサンプルバッファーに再懸濁します。ボルテックスで撹拌した後、30秒間マイクロ遠心分離します。
• サンプルを95–100°Cで2–5分間加熱し、14,000 X gで1分間マイクロ遠心分離します。
• サンプル（15–30 μl）をSDS-PAGEゲル（12–15%）に添加します。
• ウェスタンブロッティングでサンプルを分析します。

超音波処理装置UP50Hを用いたウェスタンブロット分析

プローブ型超音波処理装置UP50Hを用いた以下のプロトコルが、Kriebischら（2011）の研究で使用されました。
MC3T3-E1細胞から総タンパク質を単離しました。細胞の処理には1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M)または溶媒対照を用いました。細胞は、50 mM Tris HCl、pH 8（Sigma-Aldrich）、150 mM NaCl（Fisher Scientific）、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（Fisher Scientific）、1% IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich）、および0.5% デオキシコール酸ナトリウム（Merck）を含むバッファーで溶解しました。細胞溶解液をサイクル1、振幅80で2 × 10 s超音波処理する際には、 UP50H 超音波プロセッサー （Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Germany）を使用しました。その後、試料を14,000 rpmで10 min遠心分離し、上清をウェスタンブロッティングに使用しました。二十五 μgのタンパク質をサンプルバッファーと還元剤（Invitrogen）中で煮沸した後、4–12%ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen）を用いたSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜（GE health care）に転写しました。膜は、1%カゼイン（Sigma-Aldrich）および1% Tris（1 M）を含むTBS（10 mM Tris-HCl、pH 7.6、150 mM NaCl）で1 hブロッキングしました。ブロッキング後、膜を一次抗体（ウサギ抗ヒトCBS、1/500、米国ミシガン州Ann ArborのR. Banerjee教授の研究室で作製）とともに、軽く撹拌しながら4°Cで一晩インキュベートしました。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HPR）を結合させた二次抗体（Dako）とのインキュベーションは、室温で1 h行いました。すべてのブロットは、増強化学発光法（Perkin Elmer）で検出しました。
 

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以下の表は、当社の実験室用超音波処理装置のおおよその処理能力を示しています。

文献／参考文献

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.