ウェスタンブロッティングのための超音波の溶解

• ウェスタンブロット法は、組織ホモジネートまたは細胞抽出物の試料中の特定のタンパク質を検出するための分析方法です。
• ウエスタンブロットを実行するために、または酵素活性を測定するために、多くのアッセイは、細胞に取り込まれた材料（例えば、タンパク質、DNA、細胞内断片）へのアクセスを必要とします。
• 超音波処理は、制御された細胞破壊および溶解のため信頼性が高く、扱いやすい方法です。

超音波細胞破砕

組織及び培養細胞からのタンパク質抽出は、多くの生物学的、生化学的および分析技術（PAGE、ウェスタンブロッティング、ELISA、質量分析など）またはタンパク質精製のための最初のステップです。高いタンパク質収量を得るために、細胞材料および組織を効率的に溶解/破壊されなければなりません。植物細胞または動物組織かどうか、超音波処理は、あなたの細胞溶解物は、簡単かつ迅速な準備をする方法です。

超音波処理のメリット

• 速いです & 効率的
• 簡単操作
• 高タンパク質収量
• 再現性/再現性
• 正確に制御
• スケーラブル

ウェスタンブロッティングのために免疫沈降プロトコル

A.試薬

溶液の調製のための、そのようなミリQとして精製水を使用します。

• 1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）
• 1×細胞溶解緩衝液：20mMトリス（pH7.5）を、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1％トリトンX-100、2.5mMのピロリン酸ナトリウム、1mMのβグリセロリン酸、1mMののNa 3 VO 4、1μgの/ mlのロイペプチン
  重要：使用直前に1 mMのPMSFを追加します。
• 15μlのプロテ​​インA +15μlのプロテ​​インGは、IPのために十分であるが、それはあなたの一次抗体およびサンプル量に依存してもよいです。また、（マウスIgGをプルダウンするために、ウサギIgGに対する例えばプロテインAプルダウンおよびプロテインG）予備混合プロテインA / Gアガロースを使用することができ
• 3×SDS試料緩衝液：187.5 mMのトリス-HCl（25℃におけるpH 6.8）、6％W / V SDS、30％グリセロール、150mMのDTT、0.03％W / Vブロモフェノールブルー

細胞溶解物の調製

• 細胞を採取します。非変性条件下で細胞を回収するために、培地を除去し、氷冷したPBSで細胞を1回リンス。
• PBSを除去し、各プレート（10 cm）の0.5 mlの氷冷1×細胞溶解緩衝液を添加し、氷上で5分間プレートをインキュベートします。
• プレートから細胞をこすりとマイクロ遠心チューブに移します。氷の上に保管してください。
• 超音波処理回氷冷免疫沈降緩衝液中で10秒間（IP緩衝液：50mMトリス-HCl [pH7.4の]、150mMのNaCl、5mMのEDTA、0.1％NP-40およびプロテアーゼインヒビターミックス）。超音波処理のために、 VialTweeter などまたはプローブ超音波発生装置 UP100H または Uf200ःトン 最も適しています。
• 4℃で10分間15,000gで溶解物を遠心分離。
• 上清を新しいチューブに移します。 （必要に応じて、溶解物を-80℃で保存することができます。）
• 上清に一次抗体を追加します。一次抗体と上清は、光攪拌しながら4℃で1時間インキュベートします。一次抗体は、典型的には、ウェスタンブロッティングのために使用されているよりも10倍より濃縮量で添加されます。 （あなたは100μLあたり1μgのを起動することがあります。）
• 次いで、上清をさらに1時間、プロテインAアガロース（Invitrogen）およびプロテインGアガロースの等量の混合物でさらにインキュベートします。
• IPバッファーでアガロースペレットを3回洗浄します。その後、95℃で5分間加熱することにより、SDS-PAGEローディング緩衝液で結合したタンパク質を抽出します。

C.免疫沈降

• 200μlの細胞溶解物を取り、一次抗体を追加します。穏やかに4℃で一晩揺らしながらインキュベートします。
• プロテインAまたはGアガロースビーズ（50％ビーズスラリーの20μL）のいずれかを加えます。穏やか4℃で1-3時間ロッキングでインキュベートします。
• 4°Cで30秒間マイクロ遠心。洗浄は、1×細胞溶解緩衝液500μlで5回をペレット化。洗浄の間、氷の上に保管してください。
• 20μlの3×SDSサンプルバッファーでペレットを再懸濁。ボルテックス、30秒間マイクロ遠心。
• 14,000×gで1分間、2-5分間マイクロため95~100℃に試料を加熱します。
• SDS-PAGEゲル（12から15パーセント）上のサンプル（15-30μl）を読み込みます。
• ウエスタンブロット法によってサンプルを分析します。

超音波装置を用いたウエスタンブロット分析UP50H

以下のプロトコルはKriebischらの研究で使用しました。 （2011）：
総タンパク質は、1,25で処置したMC3T3-E1細胞から単離した（OH）₂D₃ （10^-8 M）またはビヒクル。細胞を、50mMのトリスHCl、pHを8（Sigma-Aldrich社）を含有する緩衝液で溶解しました。 150mMのNaCl（Fisher Scientific社）。 0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（Fisher Scientific社）; 1％IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich社）および0.5％デオキシコール酸ナトリウム（メルク）。で細胞溶解物を、サイクル1および振幅80で2×10秒間超音波処理しました。 UP50H超音波プロセッサ （Hielscher、Ultrasound Technology、Teltow、Germany）。その後、材料を14,000rpmで10分間遠心分離し、上清をウエスタンブロッティングに使用した。 25μgのタンパク質を試料緩衝液および還元剤（Invitrogen）中で沸騰させ、続いて4-12％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen）を用いてSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜（GEヘルスケア）に移した。膜を、1％カゼイン（Sigma-Aldrich）および1％Tris（1M）を含むTBS（10mM Tris-HCl; pH7.6; 150mM NaCl）で1時間ブロックした。ブロッキング後、膜を、一次抗体（米国ミシガン州アナーバーのR. Banerjee教授の研究室で開発されたウサギ抗ヒトCBS 1/500）を用いて4℃で一晩わずかに攪拌しながらインキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HPR） - コンジュゲート二次抗体（Dako）を用いたインキュベーションを室温で1時間行った。全てのブロットは、増強化学発光（Perkin Elmer）によって開発された。

文献 / 参考文献