組織および細胞培養からの超音波タンパク質抽出

• タンパク質抽出は、プロテオミクスにおける不可欠なサンプル前処理工程です。
• タンパク質は、植物および動物の組織、酵母、微生物から抽出できます。
• 超音波処理は、短い抽出時間で高いタンパク質収量が得られる、信頼性が高く効率的なタンパク質抽出法です。

組織および細胞からのタンパク質抽出

組織および培養細胞からのタンパク質抽出は、ELISA、PAGE、ウェスタンブロッティング、質量分析、タンパク質精製など、多くの生化学的手法や分析手法で実施される不可欠なサンプル前処理工程です。超音波による細胞破砕、溶解、抽出は、精密に制御できる非熱的な技術であり、高いタンパク質収量を確保します。

超音波による溶解とタンパク質抽出の一般的な手順

• 温度制御： 熱変性を起こさずに高いタンパク質収量を確保するには、抽出中の温度を制御する必要があります。Hielscherの最先端の超音波ホモジナイザー – 超音波破砕装置または超音波処理装置とも呼ばれます – は、精密に制御できます。接続式の温度センサーが付属しています。超音波ホモジナイザーの設定オプションで最高温度を設定できます。この最高温度に達すると、超音波処理装置はサンプルが冷却されるまで自動的に停止します。
• 緩衝液： 適切な緩衝液の選択と適正な緩衝液量は組織によって異なるため、試行錯誤による試験で決定する必要があります。
• 単離／精製： タンパク質を含む溶解液には、DNAや炭水化物などの生体分子が過剰に含まれている場合があります。これらは、タンパク質沈殿（デオキシコール酸塩–トリクロロ酢酸）または緩衝液交換によって除去できる場合があります。

ChittapaloとNoomhorm（2009）は、超音波処理によってタンパク質収量が増加し、超音波による組織ホモジナイズおよび溶解プロセスが既存の抽出プロセスを大幅に改善できることを研究で報告しました – これにより、商業的な抽出に新たな機会が生まれます。
 

動物組織からのタンパク質抽出

組織全体（腎臓、心臓、肺、筋肉など）を前処理する場合は、プロテアーゼによる分解を防ぐため、清潔な器具を用い、できれば氷上で、できるだけ速やかに組織を非常に小さな断片に切り分ける必要があります（例えば、RIPAなどの溶解緩衝液、またはプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む低張溶解緩衝液）。切り分けた後、サンプルを液体窒素に浸して急速凍結します。サンプルは、後で使用するために -80°C で保存するか、すぐにホモジナイズするために氷上に保持できます。超音波抽出の直前に、氷冷した溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤であるDTT、ロイペプチン、アプロチニンを含む）をサンプルチューブに速やかに加えます（組織 ~10 mg あたり、約 ~600 μL の緩衝液を推奨します）。サンプルチューブあたり、約 20–60mg の組織を推奨します。
超音波によるホモジナイズ、溶解、抽出は、マイクロチップ型ソノトロードを装備したUP100HやUP200Htなどの超音波ホモジナイザーで実施します。超音波処理時間は60–90秒で、15秒間の超音波処理と10秒間の休止からなる超音波サイクルモードを使用します。サンプルは常に氷中に保持する必要があります。
超音波によるホモジナイズ／抽出の後、溶解液を27,000gで約20分間遠心分離します。その後、上清を回収し、Pierce BCAタンパク質アッセイなどのタンパク質アッセイでタンパク質濃度を測定できるようにします。

血清からのタンパク質抽出

血清とリン酸緩衝液を均一に混合するため、超音波による細胞溶解の前に、まずサンプルをボルテックス混合します。超音波による溶解では、UP100Hなどの実験室用超音波ホモジナイザーを用い、振幅20%で、各サイクルを5秒間の処理と15秒間の休止として8サイクルの超音波処理を行います。タンパク質抽出は、サイクル式の超音波処理（パルスモード）を行い、サンプルを氷上に置くことで、サンプルの過熱および熱分解を防ぎながら実施します。血清には、IEF中の低分子量タンパク質の分離を妨げる高分子量タンパク質（アルブミン、α1-アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロブリン、免疫グロブリンG、免疫グロブリンAなど）が大量に含まれるため、除去カラムを用いてこれらを血清から除去することを推奨します。

植物組織からのタンパク質抽出

コケなどの新鮮で柔らかい植物組織は、細かく切ったサンプル材料を溶解緩衝液に入れて超音波処理するだけで、容易に破砕できます。種子やモミの針葉などの硬い木質化した植物組織は、乾燥状態で粉砕する必要があります。一部の硬い木質植物材料は、超音波処理による抽出の前に、液体窒素中で凍結して粉砕する必要があります。植物細胞培養懸濁液の場合、溶解緩衝液中で30–150秒間の超音波処理を行えば、通常は十分です。カボチャの種子など、より硬い材料には、以下に記載するような、より強い超音波処理が必要です。
 

カボチャの種子からアルブミンを超音波抽出するためのプロトコル

微粉砕したカボチャ種子粉末からアルブミンを超音波で抽出するには、脱脂カボチャ種子粉末10 gと、溶媒として脱イオン水100 mLを250mLのガラスビーカーに加えます。タンパク質抽出は二つの工程からなります。まず、サンプルの超音波処理には ソノトロードS24d7を装備したプローブ型超音波処理装置UP400St（400W、24kHz）を使用します。 超音波ホモジナイズ中は、ガラスビーカーを冷水浴に入れます。超音波処理装置UP400Stの接続式温度センサーと温度制御設定により、サンプル温度が常に30°C未満に保たれます。超音波処理中の精密な温度制御によって、アルブミンの変性を防ぎます。第二の工程では、ミキサーを用いて200 rpm、30°Cで抽出を行いました。その後、ビーカーを恒温振とう機に移します。蒸留水を用いた透析によってグロブリンを除去します。グロブリンを除去した後、アルブミンのプロファイルを測定するためにタンパク質抽出液を採取できます。その後、アルブミンを凝固させるため、0.1 M HClを用いてpI=3.0に調整します。5000g、20°Cで遠心分離して固相を分離し、脱イオン水に再溶解します。アルブミン濃縮物中のタンパク質比率を高めるため、アルブミンの凝固を二回行います。

米ぬかからタンパク質濃縮物を調製するための超音波アルカリタンパク質抽出では、従来の抽出法と比較して、超音波処理により大幅に短い抽出時間で、より高いタンパク質収量が得られることが示されています。

機能を保持したiNOS酵素のサンプル前処理プロトコル

完全な機能を保持したiNOS酵素を得るため（例えば、薬剤スクリーニング用）、以下のプロトコルを推奨します。細胞懸濁液を氷上に置き、UP100Hを用いて振幅10µmで、5秒間の超音波処理と氷上での25秒間の休止からなるサイクルモードで超音波処理します。この手順を約3回繰り返す必要があります。超音波処理サイクル間の休止時間によって温度上昇が抑えられるため、変性のリスクが低下します。

超音波によるタンパク質の可溶化

超音波処理は、通常数時間を要するタンパク質の可溶化プロセスを促進する可能性があります。サンプルの過熱を防ぎ、尿素を含む溶液中でのタンパク質の分解や修飾を防ぐため、超音波の各照射時間は数秒を超えないようにする必要があります。

タンパク質抽出用の超音波装置

Hielscher Ultrasonicsは、細胞、組織、細菌、微生物、酵母、胞子の破砕に使用する幅広い超音波ホモジナイザーを提供しています。
Hielscherの実験室用超音波処理装置は、強力で操作が簡単です。24/7の運転に対応するよう製造されており、堅牢で効率的な実験室用および卓上型の装置として設計されています。すべての装置で、エネルギー出力と振幅を精密に制御できます。幅広いアクセサリーにより、さらに多様な構成が可能になります。VialTweeter、UP200Ht、UP200St、UP400Stなどのデジタル超音波処理装置には、温度制御機能と自動データ記録用のSDカードが内蔵されています。
複数のサンプルを間接的に、交差汚染なく同時に超音波処理するために、VialTweeterまたは超音波CupHornを提供しています。
以下の表は、サンプル前処理、細胞破砕、抽出に使用する当社の超音波処理装置の概要を示しています。各超音波ホモジナイザーの詳細については、装置名をクリックしてください。十分な訓練を受け、長年の経験を持つ当社の技術スタッフが、お客様のサンプル前処理に最も適した超音波処理装置の選定を喜んでお手伝いします。
 

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