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組織および細胞培養からの超音波タンパク質抽出

  • タンパク質抽出はプロテオミクスにおいて不可欠なサンプル調製ステップである。
  • タンパク質は、植物や動物の組織、酵母、微生物から抽出することができる。
  • ソニケーションは信頼性が高く、効率的なタンパク質抽出法であり、短い抽出時間で高いタンパク質収率を得ることができる。

組織と細胞からのタンパク質抽出

組織や培養細胞からのタンパク質抽出は、ELISA、PAGE、ウェスタンブロッティング、質量分析、タンパク質精製など、多くの生化学的・分析的手法で行われる必須のサンプル調製ステップです。超音波による細胞破砕、溶解、抽出は、タンパク質の高い収率を保証する、正確に制御可能な非加熱技術です。

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UP200Stのようなプローブ型超音波装置は、信頼性の高い組織ホモジナイザーであり、遺伝子研究やプロテオミクス研究のサンプル前処理に広く使用されている。

による細胞からのタンパク質抽出 超音波プローブ UP200St

超音波溶解とタンパク質抽出の利点
 

  • 迅速
  • 高収量
  • 高効率
  • パラメーターの精密制御
  • 再現性のある結果
  • 線形スケーラビリティ

超音波溶解とタンパク質抽出の一般的手順

  • 温度管理: 熱変性することなく高いタンパク質収量を確保するためには、抽出中の温度をコントロールする必要があります。Hielscher社の最新式超音波ホモジナイザー – 超音波崩壊器、超音波発生器とも呼ばれる。 – は正確に制御できる。プラグ式温度センサー付き。超音波ホモジナイザーの設定オプションで、最高温度を設定することができます。この最高温度に達すると、試料が冷めるまで超音波ホモジナイザーは自動的に停止します。
  • バッファ: 適切なバッファーと適切なバッファー量の選択は、組織によって異なるため、試行錯誤のテストによって見つけ出す必要がある。
  • 単離/精製: タンパク質溶解液にはDNAや糖鎖などの生体分子が過剰に含まれていることがあり、タンパク質沈殿(デオキシコール酸-トリクロロ酢酸)や緩衝液交換によって除去することができる。

Chittapalo and Noomhorm (2009)は、超音波処理によりタンパク質の収量が増加し、超音波による組織ホモジナイズと溶解プロセスにより、既存の抽出プロセスを大幅に強化できることを報告した。 – 新たな商業的採掘の機会を可能にする。
 

タンパク質分離とDNA断片化のために、同一条件下で複数のサンプルを同時に前処理するための超音波カップホーン。

超音波カップホーン タンパク質分離とDNA断片化のために、同一条件下で複数のサンプルを同時に高効率で前処理することができます。

動物組織からのタンパク質抽出

超音波ホモジナイザーUP100Hは、細胞培養プレートのサンプル調製によく使用されます。ホールサイズの組織(腎臓、心臓、肺、筋肉など)を調製する場合、プロテアーゼによる分解を防ぐため、清潔な器具を用い、できれば氷上で、できるだけ短時間で、組織を非常に小さく切り離す必要がある(プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含むRIPAまたは低張溶解バッファーなどの溶解バッファーなど)。解剖後、サンプルを液体窒素に浸し、スナップ凍結する。サンプルは、後で使用するために-80℃で保存することも、すぐにホモジナイズするために氷上で保存することもできる。超音波抽出の直前に、氷冷溶解バッファー(プロテアーゼ阻害剤DTT、ロイペプチン、アプロチニンを含む)をサンプルチューブに素早く加える(~10mgの組織あたり約~600μLのバッファーが推奨される)。サンプルチューブ1本あたり約20~60mgの組織を推奨する。
超音波ホモジナイズ、溶解、抽出は、マイクロチップソノトロードを装備したUP100HやUP200Htなどの超音波ホモジナイザーを用いて行う。超音波処理時間は、超音波処理15秒、静止時間10秒の超音波サイクルモードで60~90秒である。試料は常に氷の中に入れておく。
超音波ホモジナイズ/抽出後、ライセートを 27,000g で約 20 分間遠心する。その後、上清を回収し、Pierce protein assay BCA などのプロテインアッセイでタンパク質濃度を測定する。

血液血清からのタンパク質抽出

血清とリン酸緩衝液を均一に混合するために、超音波細胞溶解の前にまず試料をボルテックスする。超音波溶解では、サンプルをUP100Hのような超音波ラボ用ホモジナイザーで、20%の振幅で8サイクル、5秒オン、15秒オフのサイクルで超音波処理する。サイクルの超音波処理(パルセーションモード)と、サンプルの過熱と熱劣化を避けるためにサンプルを氷上に置くことによって、タンパク質抽出が行われる。血清中には高分子量のタンパク質(アルブミン、α1-アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロブリン、免疫グロブリンG、免疫グロブリンAなど)が多量に含まれており、IEF中の低分子量タンパク質の分離を阻害するため、除タンパクカラムを用いて血清中から除タンパクすることが推奨される。

植物組織からのタンパク質抽出

新鮮で軟らかい植物組織(コケなど)は、刻んだ試料を超音波処理用の溶解バッファーに入れるだけで、簡単に破砕できる。種子やモミの針など、硬くて固着した植物組織は、乾燥した状態で粉砕する必要がある。硬い木質植物体の一部は、超音波処理で抽出する前に液体窒素で凍結粉砕する必要がある。植物細胞培養懸濁液の場合は、溶解バッファー中で30~150秒の超音波処理で十分な場合がほとんどである。カボチャの種のような硬い材料は、以下に述べるように、より強力な超音波処理を必要とする。
 

このチュートリアルでは、ラボでの溶解、細胞破砕、タンパク質の単離、DNAやRNAの断片化などのサンプル前処理作業、分析、研究に最適なソニケーターのタイプについて説明します。アプリケーション、サンプル量、サンプル数、スループットに最適なソニケーターのタイプをお選びください。Hielscher Ultrasonicsは、お客様に最適な超音波ホモジナイザーを提供します!

科学と分析における細胞破砕とタンパク質抽出に最適なソニッケーターを見つける方法

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カボチャ種子からのアルブミン超音波抽出プロトコール

超音波組織ホモジナイザー UP400St と S24d40 - 動植物組織からのタンパク質抽出用 (クリックで拡大!)微粉砕したカボチャ種子粉末からアルブミンを超音波でタンパク質抽出するために、脱脂したカボチャ種子粉末10gと溶媒として脱イオン水100mLを250mLのガラスビーカーに加える。タンパク質抽出は2段階からなる:まず、試料を プローブ型超音波発生装置UP400St(400W、24kHz)にソノトロードS24d7を装着。 超音波ホモジナイズ中、ガラスビーカーは冷水槽に置かれる。超音波ホモジナイザーUP400Stの温度センサーと温度制御設定により、サンプル温度は常に30℃以下に保たれます。超音波処理中の正確な温度制御により、アルブミンの変性が回避される。次に、ミキサーを使用し、回転数200rpm、温度30℃で抽出を行った。その後、ビーカーを恒温シェーカーに移す。グロブリンは蒸留水による透析で除去される。グロブリン除去後、アルブミンプロファイルの測定のためにタンパク質抽出物をサンプリングし、アルブミン凝固のために0.1 M HClを用いてpI=3.0に調整する。固相は5000g、20℃の遠心分離で分離し、脱イオン水に再溶解する。アルブミン凝固は、アルブミン濃縮物のタンパク質比率を高めるために2回行われる。

米糠からの蛋白質濃縮物の調製のための超音波アルカリ蛋白質抽出は、超音波処理により有意に短い抽出時間でより高い蛋白質収量をもたらすことを示している。 – 従来の抽出法に比べて

このビデオクリップは、研究室でのサンプル前処理に広く使用されている超音波発生装置、Hielscher社製超音波ホモジナイザーUP100Hを紹介しています。

超音波ホモジナイザー UP100H

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機能性iNOS酵素のサンプル調製プロトコール

完全に機能的なiNOS酵素を得るには(例えば薬剤スクリーニング用)、以下のプロトコールが推奨される:細胞懸濁液を氷上に置き、UP100Hを用い、振幅10µm、超音波処理5秒、静止25秒のサイクルで超音波処理を行う。この操作を約3回繰り返す。超音波処理サイクルの間の休止時間は温度上昇を抑えるので、変性リスクを低減する。

超音波によるタンパク質の可溶化

超音波処理は、通常数時間を要するタンパク質の可溶化プロセスを促進する可能性がある。サンプルを過熱せず、尿素を含む溶液中でのタンパク質の分解や変化を防ぐため、超音波のバーストは数秒以下とする。

VialTweeterは、クロスコンタミネーションを起こすことなく、最大10本のバイアルを全く同じ条件で同時に超音波処理するユニークな超音波システムです。

UP200St、密閉バイアルの超音波処理用VialTweeter付き

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生物試料の超音波溶解用マイクロチップS26d2付き超音波装置UP200Ht

超音波発生装置 UP200Ht 2mmのマイクロチップS26d2付きで、小さなサンプルの超音波処理に使用。

タンパク質抽出用超音波装置

Hielscher Ultrasonics社は、細胞、組織、細菌、微生物、酵母、芽胞を分解するための幅広い超音波ホモジナイザーを提供しています。
Hielscher社のラボ用超音波発生装置は、パワフルで操作が簡単です。年中無休で稼動するよう設計されており、堅牢で効率的なラボ用・卓上用装置として設計されています。すべての装置において、エネルギー出力と振幅を正確に制御することができます。豊富なアクセサリーにより、セットアップの選択肢が広がります。VialTweeter、UP200Ht、UP200St、UP400Stなどのデジタル超音波発生装置には、温度制御機能が内蔵されており、自動データ記録用のSDカードが内蔵されています。
複数のサンプルの間接的でクロスコンタミネーションのない同時超音波処理には、VialTweeterまたは超音波CupHornをご用意しています。
下の表は、サンプル前処理、細胞破砕、抽出用の超音波ホモジナイザーの概要です。各超音波ホモジナイザーの詳細については、機器の種類をクリックしてください。お客様のサンプル前処理に最適な超音波ホモジナイザーをお選びいただけるよう、長年経験を積んだ当社の技術スタッフがお手伝いいたします!
 

バッチ量 流量 推奨デバイス
10本までのバイアルまたはチューブ n.a. バイアルツイーター
マルチウェル/マイクロタイタープレート n.a. UIP400MTP
複数のチューブ/容器 n.a. カップホーン
1〜500mL 10~200mL/分 UP100H
10〜1000mL 20~200mL/分 UP200Ht, UP200St
10〜2000mL 20~400mL/分 UP400ST

お客様のアプリケーション、材料、サンプル量に応じて、サンプル前処理に最適なセットアップをご提案します。お気軽にお問い合わせください!

お問い合わせ/ お問い合わせ

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超音波ホモジナイザー、バイオテクノロジーやプロテオミクスにおけるアプリケーション、価格に関する追加情報をご希望の方は、以下のフォームをご利用ください。お客様の細胞破砕やタンパク質抽出プロセスについてご相談させていただき、ご要望に合った超音波ホモジナイザーをご提案させていただきます!









ご注意ください プライバシーポリシー.




 

このビデオでは、高強度超音波を使用して、あらゆる標準的なマルチウェルプレートで信頼性の高いサンプル調製を可能にする超音波サンプル調製システムUIP400MTPを紹介しています。UIP400MTPの代表的なアプリケーションには、細胞溶解、DNA、RNA、クロマチンシェアリング、タンパク質抽出などがあります。

マルチウェルプレート超音波処理用超音波発生装置 UIP400MTP

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Hielscher社製超音波発生装置は、ブラウザー制御による遠隔操作が可能です。超音波処理パラメータを監視し、プロセス要件に合わせて正確に調整することができます。

Hielscher社製デジタル超音波装置は、ブラウザーリモコンと内蔵SDカードへの自動データプロトコール機能を備えています。

組織サンプルからのタンパク質抽出用超音波装置 VialTweeter (クリックで拡大!)

バイアルツイーター 間接的な超音波処理



知っておくべき事実

プロテオミクス

プロテオミクスは、タンパク質とプロテオームについて研究する分野である。タンパク質は、生体内で膨大な数の重要な機能を果たしている。プロテオームとは、ある時点でゲノム、細胞、組織、または生物によって発現されるタンパク質の全セットのことである。プロテオームは、細胞や生物が受ける時間や明確な要求、あるいはストレスによって変化する。より具体的には、プロテオームとは、ある特定の種類の細胞や生物において、ある特定の時間に、定義された条件下で発現されるタンパク質の集合のことである。この用語は、タンパク質とゲノムを合わせたものである。プロテオミクスはプロテオームの研究である。

タンパク質

タンパク質は大きな生体分子で、いわゆる高分子である。 – タンパク質とは、アミノ酸残基から構成される1本以上の長い鎖のことである。タンパク質は動植物由来のすべての生物に存在し、ほとんどの生物学的機能に不可欠である。タンパク質は多くの生物学的情報を含んでいるため、プロテオミクス研究などの分析目的で抽出される。タンパク質が果たす最も重要な機能には、代謝反応の触媒、DNA複製、刺激への応答、ある場所から別の場所への分子の輸送などがある。タンパク質は、遺伝子のヌクレオチド配列によって決定されるアミノ酸の配列が主な相違点であり、その結果、通常、タンパク質はその活性を決定する特定の立体構造に折り畳まれる。タンパク質は – ペプチド以外 – 食品の主要成分のひとつである。したがって、プロテオミクスは食品科学において、プロセスの最適化、食品の安全性、栄養評価のための強力なツールである。

Cloud Point Extraction

Cloud Point Extraction は、分析対象物を分離し、あらかじめ共沈させる分析前の手順です。超音波処理と組み合わせることで、クラウドポイント抽出をより効率的に、より速く、より環境に優しいプロセスにすることができます。超音波処理により、クラウドポイント抽出は、より効率的な分析物の前処理方法となります。 超音波による雲点抽出について詳しく読む!

ゲル電気泳動

ゲル電気泳動は、DNA、RNA、タンパク質などの高分子やその断片を、そのサイズや電荷に基づいて分離・分析するための主要な方法である。生化学、分子生物学、プロテオミクスでは、DNAやRNA断片の混合集団を長さ別に分離したり、DNAやRNA断片のサイズを推定したり、タンパク質を電荷別に分離したりするのに用いられる。

細胞培養

細胞培養とは、細胞を制御された条件下で培養する、制御された成長過程である。細胞培養の条件は細胞の種類によって異なる。一般的に、細胞培養の環境は、基質または培地を入れた適切な容器(ペトリ皿など)から成り、必須栄養素(アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル)、成長因子、ホルモン、ガス(CO2, O2)、物理化学的環境(pHバッファー、浸透圧、温度)を調節する。ほとんどの細胞は表面基質または人工基質を必要とするが、その他の細胞培養は培養液中で自由に浮遊させて培養することができる(懸濁培養、細胞懸濁液)。
動物細胞株の大量培養は、ウイルスワクチンやその他のバイオテクノロジー由来の製品の工業生産に用いられる。ヒト幹細胞は、細胞数を増やし、移植を目的とした様々な体細胞に分化させるために培養される。

組織サンプル

組織という用語は、細胞材料が細胞と完全な器官との間の組織レベルにある、細胞中間体を表す。組織では、同じ起源を持ち、共に特定の機能を遂行する類似の細胞が集合している。複数の組織が機能的にグループ化されることで、器官という複雑な構造が形成される。
組織は、生物学、組織学/病理組織学、寄生虫学、生化学、免疫組織化学の研究のために採取されるだけでなく、培養やDNA抽出のためにも採取される。組織は、動物組織(細分類:哺乳類組織)と植物組織に区別される。動物組織は、結合組織、筋肉組織、神経組織、上皮組織の4つの基本タイプに分類される。植物組織は、表皮、地上組織、血管組織の3つの組織系に細分される。
組織サンプルは、骨、筋肉、葉など、動物や植物の部分から調製することができる。

体液

血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、滑液は体液であり、診断に関連する情報の大きな供給源となる。したがって、分析のための体液サンプルの精巧な調製は重要である。第一の難点は、体液中に存在する成分のダイナミックレンジが広いことである。

タンパク質濃度の測定

ブラッドフォードアッセイ、ローリーアッセイ、ビシンコニン酸(BCA)アッセイは、タンパク質の濃度を測定するための一般的なアッセイである。ウシ血清アルブミン(BSA)は、最も頻繁に使用されるタンパク質標準物質の一つです。

溶解バッファー

溶解バッファー は、細胞材料や組織(組織培養、植物、細菌、真菌など)、細胞の構造の有無や種類に応じて選択する必要がある。タンパク質、膜、オルガネラを抽出するための幅広い溶解バッファーには、1種類以上の洗浄剤が配合されている。洗剤は通常、試行錯誤的に選択される。 – 可能であれば – 既存のタンパク質抽出プロトコールに従う。洗剤は組織源とタンパク質に適合していなければならない。一般的に、抽出液の機能性を最大限に維持するために、特定の組織/タンパク質に適合する最もマイルドな洗浄剤が選択される。さらに、膜やオルガネラの抽出の場合、マイルドな洗浄剤が膜を無傷に保つ。溶解バッファーによく使われる洗剤は、ほとんどが非イオン性または双性イオン性で、例えばCHAPS、デオキシコール酸塩、Triton™ X-100、NP40、Tween 20などがある。
例えば、脳、肝臓、腸、腎臓、脾臓などの組織は、RIPAで簡単に緩衝化できる。 – ただし、プロテアーゼ阻害剤とDTT(ゲル電気泳動用など)は含むべきである。
骨格筋組織用溶解バッファー(氷冷):20 mM Tris(pH7.8)、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2、1 % Triton X-100、10 %(w/v)グリセロール、1 mM EDTA、1 mM ジチオスレイトール、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル添加。
一般的な緩衝液とそのpH範囲の表。一般的に、これらの緩衝液は通常20~50mMの濃度で使用される。
 

バッファ pH範囲
クエン酸 – NaOH 2.2 – 6.5
クエン酸ナトリウム – クエン酸 3.0 – 6.2
酢酸ナトリウム – 酢酸 3.6 – 5.6
カコジル酸ナトリウム塩 – 塩酸 5.0 – 7.4
メス – NaOH 5.6 – 6.8
リン酸二水素ナトリウム – リン酸水素二ナトリウム 5.8 – 8.0
イミダゾール – 塩酸 6.2 – 7.8
モップス – KOH 6.6 – 7.8
トリエタノールアミン塩酸塩 – NaOH 6.8 – 8.8
トリス – 塩酸 7.0 – 9.0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
トリシン – NaOH 7.6 – 8.6
四ホウ酸ナトリウム – ホウ酸 7.6 – 9.2
ビシン – NaOH 7.7 – 8.9
グリシン – NaOH 8.6 – 10.6

ほとんどの緩衝液は温度によってpH依存性を示す。これは特にトリス緩衝液に当てはまる。pKaは25℃で8.06から0℃で8.85まで変化する。
(緩衝液のpHとpKa:pHは水溶液中の水素イオン濃度を測定する。pKa(=酸解離定数)は関連するが、より具体的な指標であり、特定のpH値で分子がどのように作用するかを予測するのに役立つ)

TRIzol

TRIzolは、グアニジニウムチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出の際に、RNA/DNA/タンパク質を抽出するために使用される薬液である。超音波アシストTRIzol抽出を使用すると、同じサンプルから高いDNA、RNA、タンパク質収量が得られ、他の抽出方法よりも優れている。

文献/参考文献

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