ヒールシャー超音波技術

組織および細胞培養物から超音波タンパク質抽出

  • タンパク質の抽出は、プロテオミクスにおける不可欠なサンプル調製工程です。
  • タンパク質は、植物や動物の組織、酵母や微生物から抽出することができます。
  • 超音波処理は、短い抽出時間以内に高いタンパク質収量を与える信頼性の高い、効率的なタンパク質抽出方法です。

 

組織および細胞からのタンパク質抽出

組織及び培養細胞からのタンパク質抽出は、例えばELISA、PAGEなどの多くの生化学的および分析技術の間に行われる必須の試料調製工程であります ウェスタンブロッティング、質量分析、またはタンパク質精製。超音波 細胞破壊、溶解および抽出 タンパク質の高収量を確保するために正確に制御技術です。

動物組織からのタンパク質抽出

全サイズの組織(例えば、腎臓、心臓、肺、筋肉など)の調製のために、組織は、氷上で、好ましくはプロテアーゼによる分解を可能な限り迅速に、きれいなツールで非常に小さな断片に解剖するべきである。プロテアーゼおよびホスファターゼインヒビターカクテルを含有する低張溶解緩衝液などの溶解緩衝液)中で実施する。切開後、試料を液体窒素に浸漬して急速凍結させる。サンプルは、後で使用するために-80℃で保存するか、または即時の均質化のために氷上で保存することができます。超音波抽出の直前に、氷冷溶解緩衝液(プロテアーゼ阻害剤DTT、ロイペプチンおよびアプロチニンを含む)を試料管に迅速に添加する(約10mgの組織につき約600μLの緩衝液を推奨する)。約サンプルチューブあたり20〜60mgの組織が推奨されます。
超音波均質化、溶解および抽出のような超音波ホモジナイザーを用いて行われます Uf200ःトン または UP200Stマイクロチップソノトロードを備えました。超音波処理時間は60〜90秒です。 15秒の超音波サイクルモードで。超音波処理し、10秒。休憩時間。サンプルは、氷の中にすべての時間を保つ必要があります。
超音波均質化/抽出の後、溶解物を約ための27000グラムで遠心分離します。 20分。タンパク質濃度は、Pierce社製タンパク質アッセイ、BCAのタンパク質アッセイによって決定することができるように、その後上清が収集されます。

タンパク質超音波処理は、サンプル調製の重要な方法です

細胞からの超音波タンパク質抽出 UP200St

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血清からのタンパク質の抽出

血清とリン酸緩衝液との均質な混合物の場合、超音波細胞溶解の前にまず試料をボルテックスする。超音波溶解のために、試料を超音波実験室ホモジナイザー、例えば UP100H 上の各5秒のサイクルについて20%の振幅で8サイクル、オフ15秒。 Sonocationはサイクルでsonicationgにより、サンプルの過熱及び熱分解が回避されるように氷上に試料を置くことによって行われます。血清はIEF中の低分子量タンパク質の分離に干渉する(例えば、アルブミン、α1アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロブリン、免疫グロブリンGおよび免疫グロブリンAなど)、高分子量タンパク質を多く含むので、それらを枯渇することが推奨されます血清から枯渇カラムを使用。

植物組織からのタンパク質抽出

新鮮な、柔らかい植物組織、例えば苔など、容易に単に超音波処理のための溶解緩衝液中で刻んだサンプル材料を配置することによって破壊することができます。そのようなモミ針等の種子、などタフ、ligenous植物組織は、乾式粉砕されなければなりません。いくつかのハード、木本植物材料は、前に超音波処理により抽出された液体窒素で凍結し、地面にする必要があります。植物細胞培養懸濁液は、溶解緩衝液中で30〜150秒の超音波処理はほとんど十分です。以下のようなカボチャの種などの厳しい材料がより強い超音波処理を必要とします。

カボチャの種からのアルブミンの超音波抽出のためのプロトコル

超音波組織ホモジナイザーS24d40とUP400St  - 植物や動物組織からのタンパク質抽出のために(クリックすると拡大します!)微粉砕カボチャ種子粉からアルブミンの超音波タンパク質抽出のために、脱脂カボチャ種子粉末10g、溶媒として脱イオン水100mLを250mLのガラスビーカーに添加されます。タンパク質抽出は、2つのステップからなる:第一に、サンプルは、プローブ型超音波発生装置を用いて超音波処理されます UP400St(400W、24kHzの) マウントソノトロードS24d7と。ガラスビーカーを超音波均質化の間に冷水浴に入れています。超音波装置の設定 UP400St プラグ可能な温度センサーにより、サンプル温度は常に30℃以下に保たれます。超音波処理中の正確な温度制御により、アルブミンの変性が回避される。第2に、ミキサーを用いて200rpmの速度および30℃で抽出を行った。その後、ビーカーをサーモスタットシェーカーに移す。グロブリンを蒸留水で透析して除去する。グロブリン除去後、アルブミンプロフィールの測定のためにタンパク質抽出物をサンプリングし、続いてアルブミン凝固のために0.1M HClを用いてpI = 3.0に調整する。固相を5000g、20℃での遠心分離によって分離し、脱イオン水に再溶解する。アルブミン凝固は、アルブミン濃縮物中のタンパク質比を増加させるために2回行われる。

米糠から蛋白質濃縮物を調製するための超音波アルカリ性タンパク質抽出は著しく短い抽出時間でより高いタンパク質収率で超音波処理した結果ことを示しています – 従来の抽出方法に比べ。

組織サンプルからのタンパク質抽出のための超音波装置のVialTweeter(クリックすると拡大します!)

VialTweeter 間接的な超音波処理のために。

メリット

  • 急速
  • 高収率
  • 高効率
  • パラメータを正確に制御
  • 再現性のある結果
  • リニアなスケーラビリティ

機能性のiNOS酵素のための試料調製プロトコル

(例えば、薬物スクリーニングのために)完全に機能するのiNOS酵素を得るために、以下のプロトコルが推奨される:細胞懸濁液を氷上で超音波処理上に配置されるべきです UP100H 5秒のサイクルモードで10μmの振幅で。超音波処理し、25秒。氷の上に載ります。手順は約繰り返すべきです。 3回。超音波処理サイクル間での休憩時間は、温度上昇を低減し、したがって、変性のリスクを軽減します。

超音波タンパク質の可溶化

超音波処理は、通常、数時間を必要とする、タンパク質の可溶化プロセスを加速することがあります。サンプルを過熱し、尿素を含む溶液中でタンパク質分解および修正を防ぐないようにするために、超音波バーストが長く、数秒以上続かないようにしてください。

一般的な手順

温度管理: 熱変性することなく、高いタンパク質収量を確保するために、抽出時の温度は制御されなければなりません。ヒールシャーの最先端の超音波ホモジナイザー – また、超音波破砕またはsonificatorと呼ばれます – 正確に制御されています。彼らは、プラグ可能な温度センサが付属しています。超音波ホモジナイザーの設定オプションでは、最高温度を設定することができます。この温度最大に達すると、サンプルが冷めるまで、超音波装置が自動的に停止します。
バッファ: 適切な緩衝液および緩衝液の右ボリュームのチョイスは、組織に組織から変化し、試行錯誤試験によって把握アウトでなければなりません。
単離/精製: タンパク質溶解物を、タンパク質沈殿(デオキシコール酸、トリクロロ酢酸)またはバッファー交換により除去することができるようなDNAまたは炭水化物などの生体分子の過剰を含有することができます。

ChittapaloとNoomhorm(2009)は、タンパク質収率は、超音波処理を使用して増加することを報告し、超音波組織ホモジナイズおよび溶解プロセスが大幅に既存の抽出プロセスを向上させることができること – 新しい商業抽出の機会を有効にします。

ヒールシャーのサウンドエンクロージャSPB-Lおよび超音波装置UP200Stと保護を鳴らします。 (拡大するにはクリックしてください!)

超音波組織ホモジナイザー UP200St 効率的なタンパク質抽出のため

超音波治療の正確な制御(クリックすると拡大します!)

超音波処理プロセスの正確な操作とモニタリングのためのブラウザ制御

タンパク質抽出のための超音波機器

ヒールシャー超音波は、細胞、組織、細菌、微生物、酵母、および胞子の崩壊のために超音波ホモジナイザーの広い範囲を提供します。
ヒールシャーラボultrasonicatorsは、強力で操作が簡単です。 24/7操作のために建てられ、それらは、堅牢かつ効率的なラボやベンチトップデバイスとして設計されています。すべてのデバイスについては、エネルギー出力と振幅を正確に制御することができます。広い範囲の アクセサリー さらに設定オプションを開きます。などのデジタル機器 VialTweeterUf200ःトンUP200St、および UP400St 統合された温度制御を持っており、内蔵のSDカード自動データ記録のため。
間接的に、交差汚染のない、複数の試料の同時超音波処理のために、私たちが提供します VialTweeter または 超音波cuphorn
お使いのアプリケーション、材料、およびサンプル量に応じて、我々はあなたのサンプル調製のために最も適した設定をお勧めします。今日お問い合わせください!

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文学/参考文献

  • Chittapalo T、Noomhorm A(2009):超音波脱脂米糠およびタンパク質濃縮物の性質からタンパク質のアルカリ抽出をアシスト。 Int J食品サイエンス技術総合44:1843年から1849年。
  • Simoes、アンドレ・E.S:;ペレイラ、ダイアンM。;アマラル、ジョアン。ヌネス、アナM。;ゴメス、ソフィアE。;ロバーツ、ピーター・M。;ロー、エイドリアンC。; D'Hooge、ルディ。クリフォード・J、スティア。 Thibodeau、スティーブン・C。; Borralho、ピーター・M。;ロドリゲス、セシリアM. P.(2013):トリゾールまたはトリゾールLS RNA抽出および長期保存後の複数のソース・サンプルからのタンパク質の効率的な回収。 BMCゲノミクス、2013、14:181。


知る価値のある事実

プロテオミクス

プロテオミクスは、タンパク質およびプロテオームを調査研究分野です。タンパク質は、生物内の重要な機能の広大な配列をfullfil。プロテオームは、特定の時間に、ゲノム、細胞、組織、または生物によって発現されるタンパク質の全体集合です。プロテオームは、細胞または生物が受ける、時間と異なる要件、又は応力に応じて変化します。具体的には、所与の時間に、定義された条件下で、細胞または生物の所与のタイプで発現されたタンパク質の集合です。用語は、タンパク質およびゲノムのブレンドです。プロテオミクスは、プロテオームの研究です。

タンパク質

大きな生体分子であるタンパク質、いわゆる高分子 – これらはアミノ酸残基の1つ以上の長鎖から構成されている。タンパク質は、植物起源および動物起源のすべての生物に存在し、それらは生物学的機能の大部分にとって重要である。タンパク質には多くの生物学的情報が含まれているため、例えばプロテオーム研究などの分析目的で抽出されます。タンパク質によって行われる最も重要な機能には、代謝反応の触媒作用、DNA複製、刺激に対する応答、およびある位置から別の位置への分子の輸送が含まれる。タンパク質は、主に、それらの遺伝子のヌクレオチド配列によって決定され、通常、その活性を決定する特定の三次元構造にタンパク質をフォールディングさせるアミノ酸配列において互いに異なる。タンパク質は – ペプチドのほかに – 食品の主要な構成要素の一つ。したがって、プロテオミクス、プロセス、食品の安全性と栄養評価を最適化するために、食品科学における強力なツールです。

ゲル電気泳動

ゲル電気泳動は、それらのサイズおよび電荷に基づいてDNA、RNAおよびタンパク質、ならびにそれらの断片、などの高分子の分離及び分析のための主要な方法です。それ(本質的にサイズ独立アガロースIEF)電荷および/またはサイズによってタンパク質を分離するために、臨床化学に使用され、DNAの大きさを推定するために、長さDNA及びRNA断片の混合集団を分離するために、生化学、分子生物学およびプロテオミクスにおけるおよびまたはRNA断片は、電荷によってタンパク質を分離します。

細胞培養

細胞培養は、細胞が制御された条件下で栽培されていることにより、制御成長過程です。細胞培養条件は、各細胞タイプについて異なり。一般に、細胞培養の環境が必須栄養素(アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル)、成長因子、ホルモン、及びガス(CO供給する基板又は媒体と適切な容器(例えばペトリ皿)で構成され22)、及び物理化学的環境(pH緩衝剤、浸透圧、温度)を調節します。他の細胞培養物を培養培地(懸濁培養、細胞懸濁液)中に浮遊する遊離培養することができる一方で、ほとんどの細胞は、表面または人工基質を必要とします。
動物細胞株の大量培養は、ウイルスワクチンおよび他のバイオテクノロジー由来製品の工業的生産に使用されています。ヒト幹細胞は、細胞の数を拡張し、移植目的のための種々の体細胞型への細胞を区別するために培養されます。

組織サンプル

用語組織は、細胞物質が細胞と完全な器官の間の組織レベルである場合、細胞中間体を記載しています。組織において、同様の細胞は、一緒に特定の機能を行う同じ原点から、組み立てられます。複数の組織の機能的グループ化することによって、器官の複雑な構造が形成されています。
組織は、生物学、組織学/組織病理学、寄生虫学、生化学、免疫組織化学の研究、並びに育成およびDNAを抽出するためにサンプリングされます。および植物組織:それは動物(哺乳類の組織細分化)の間で区別することができます。動物組織は、結合、筋肉、神経、および上皮組織の四つの基本的なタイプに分類されています。表皮、基底組織、および血管組織:植物組織は、次の3つの組織のシステムに細分化されます。
組織サンプルは、例えば、動物または植物の部分から調製することができます。骨、筋肉、葉など

体液

血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液および滑液は、診断に関連する情報の大きな源を提供する体液です。そのため、分析のため体液サンプルの洗練された準備が重要です。最初の困難は、体液中に存在する成分の広いダイナミックレンジと関連付けられています。

タンパク質濃度の決意

Bradfordアッセイ、Lowryアッセイ及びビシンコニン酸(BCA)アッセイは、タンパク質の濃度を決定するための一般的なアッセイです。ウシ血清アルブミン(BSA)は、最も頻繁に使用されるタンパク質標準の一つです。

溶解バッファー

溶解緩衝液は、細胞材料または組織(組織培養物、植物、細菌、真菌など)に応じて選びだし、しなければならず、細胞が構造及び構造体のタイプであるかどうか。タンパク質、膜、および細胞小器官の抽出のための溶解緩衝液の広い範囲は、一つ以上の界面活性剤を用いて製剤化されます。洗剤は通常、試行錯誤のテストを経て選択されますか、 – 可能な場合は – 既存のタンパク質抽出プロトコールに従って。洗剤は、組織源とタンパク質との互換性がある必要があります。一般的に、特定の組織/タンパク質のために働く最も穏やかな界面活性剤は、抽出物の最大の機能性を維持するために選択されます。さらに、膜および細胞小器官の抽出の場合には、中性洗剤は、無傷の膜を保持します。溶解緩衝液中で一般的に使用される界面活性剤は、例えば、主に非イオン性又は両性イオン性でありますCHAPS、デオキシコール酸、トリトン™X-100、NP40、およびTween 20。
例えば、脳、肝臓、腸、腎臓、脾臓などのような組織は、単にRIPAで緩衝することができます – しかしながら、プロテアーゼ阻害剤と(例えば、ゲル電気泳動用)DTTは含まれるべきです。
20 mMトリス(pHは7.8)、137mMのNaCl、2.7mMのKCl、1mMのMgCl 2を、1%トリトンX-100、10%(w / v)のグリセロール、1mMのEDTA:骨格筋組織(氷冷)のための溶解バッファー、1 mMのは、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを補っジチオスレイトール
共通バッファの表とそのpH範囲。一般に、これらのバッファは、通常、20〜50 mMの濃度で使用されます。

バッファ pH範囲
クエン酸 – Naoh 2.2年 – 6.5年
クエン酸ナトリウム – クエン酸 3.0年 – 6.2年
酢酸ナトリウム – 酢酸 3.6年 – 5.6年
カコジル酸ナトリウム塩 – 塩酸 5.0年 – 7.4年
MY – Naoh 5.6年 – 6.8年
リン酸二水素ナトリウム – リン酸水素二ナトリウム 5.8件 – 8.0年
イミダゾール – 塩酸 6.2年 – 7.8年
モップ – 島 6.6年 – 7.8年
トリエタノールアミン塩酸塩 – Naoh 6.8年 – 8.8年
トリス – 塩酸 7.0年 – 9.0年
Hepes – Naoh 7.2年 – 8.2年
トリシン – Naoh 7.6年 – 8.6年
四ホウ酸ナトリウム – ホウ酸 7.6年 – 9.2年
ビシン – Naoh 7.7年 – 8.9年
グリシン – Naoh 8.6年 – 10.6年

ほとんどのバッファは、温度とpH依存性を示しました。これは、トリスバッファーに特に当てはまります。 pKaが0℃で8.85に25℃で8.06から変化します。
緩衝液(pHとpKa値:pHは、水溶液中の水素イオン濃度を測定するのpKa(=酸解離定数)が関連するが、より具体的な尺度であり、それは分子の特定で作用する方法を予測するために役立つことができます。 pH値。)

トリゾール

TRIzolはチオシアン酸グアニジニウム - フェノール - クロロホルム抽出の際にRNA / DNA /タンパク質を抽出するために使用される化学溶液です。同じサンプルからの高いDNA、RNA、およびタンパク質収率で超音波アシストのTRIzol抽出結果を利用することにより、他の抽出方法が優れています。