組織および細胞培養からの超音波タンパク質抽出

• タンパク質抽出はプロテオミクスにおいて不可欠なサンプル調製ステップである。
• タンパク質は、植物や動物の組織、酵母、微生物から抽出することができる。
• ソニケーションは信頼性が高く、効率的なタンパク質抽出法であり、短い抽出時間で高いタンパク質収率を得ることができる。

組織と細胞からのタンパク質抽出

組織や培養細胞からのタンパク質抽出は、ELISA、PAGE、ウェスタンブロッティング、質量分析、タンパク質精製など、多くの生化学的・分析的手法で行われる必須のサンプル調製ステップです。超音波による細胞破砕、溶解、抽出は、タンパク質の高い収率を保証する、正確に制御可能な非加熱技術です。

超音波溶解とタンパク質抽出の一般的手順

• 温度管理： 熱変性することなく高いタンパク質収量を確保するためには、抽出中の温度をコントロールする必要があります。Hielscher社の最新式超音波ホモジナイザー – 超音波崩壊器、超音波発生器とも呼ばれる。 – は正確に制御できる。プラグ式温度センサー付き。超音波ホモジナイザーの設定オプションで、最高温度を設定することができます。この最高温度に達すると、試料が冷めるまで超音波ホモジナイザーは自動的に停止します。
• バッファ： 適切なバッファーと適切なバッファー量の選択は、組織によって異なるため、試行錯誤のテストによって見つけ出す必要がある。
• 単離／精製： タンパク質溶解液にはDNAや糖鎖などの生体分子が過剰に含まれていることがあり、タンパク質沈殿（デオキシコール酸-トリクロロ酢酸）や緩衝液交換によって除去することができる。

Chittapalo and Noomhorm (2009)は、超音波処理によりタンパク質の収量が増加し、超音波による組織ホモジナイズと溶解プロセスにより、既存の抽出プロセスを大幅に強化できることを報告した。 – 新たな商業的採掘の機会を可能にする。
 

動物組織からのタンパク質抽出

ホールサイズの組織（腎臓、心臓、肺、筋肉など）を調製する場合、プロテアーゼによる分解を防ぐため、清潔な器具を用い、できれば氷上で、できるだけ短時間で、組織を非常に小さく切り離す必要がある（プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含むRIPAまたは低張溶解バッファーなどの溶解バッファーなど）。解剖後、サンプルを液体窒素に浸し、スナップ凍結する。サンプルは、後で使用するために-80℃で保存することも、すぐにホモジナイズするために氷上で保存することもできる。超音波抽出の直前に、氷冷溶解バッファー（プロテアーゼ阻害剤DTT、ロイペプチン、アプロチニンを含む）をサンプルチューブに素早く加える（～10mgの組織あたり約～600μLのバッファーが推奨される）。サンプルチューブ1本あたり約20～60mgの組織を推奨する。
超音波ホモジナイズ、溶解、抽出は、マイクロチップソノトロードを装備したUP100HやUP200Htなどの超音波ホモジナイザーを用いて行う。超音波処理時間は、超音波処理15秒、静止時間10秒の超音波サイクルモードで60～90秒である。試料は常に氷の中に入れておく。
超音波ホモジナイズ／抽出後、ライセートを 27,000g で約 20 分間遠心する。その後、上清を回収し、Pierce protein assay BCA などのプロテインアッセイでタンパク質濃度を測定する。

血液血清からのタンパク質抽出

血清とリン酸緩衝液を均一に混合するために、超音波細胞溶解の前にまず試料をボルテックスする。超音波溶解では、サンプルをUP100Hのような超音波ラボ用ホモジナイザーで、20％の振幅で8サイクル、5秒オン、15秒オフのサイクルで超音波処理する。サイクルの超音波処理（パルセーションモード）と、サンプルの過熱と熱劣化を避けるためにサンプルを氷上に置くことによって、タンパク質抽出が行われる。血清中には高分子量のタンパク質（アルブミン、α1-アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロブリン、免疫グロブリンG、免疫グロブリンAなど）が多量に含まれており、IEF中の低分子量タンパク質の分離を阻害するため、除タンパクカラムを用いて血清中から除タンパクすることが推奨される。

植物組織からのタンパク質抽出

新鮮で軟らかい植物組織（コケなど）は、刻んだ試料を超音波処理用の溶解バッファーに入れるだけで、簡単に破砕できる。種子やモミの針など、硬くて固着した植物組織は、乾燥した状態で粉砕する必要がある。硬い木質植物体の一部は、超音波処理で抽出する前に液体窒素で凍結粉砕する必要がある。植物細胞培養懸濁液の場合は、溶解バッファー中で30～150秒の超音波処理で十分な場合がほとんどである。カボチャの種のような硬い材料は、以下に述べるように、より強力な超音波処理を必要とする。
 

カボチャ種子からのアルブミン超音波抽出プロトコール

微粉砕したカボチャ種子粉末からアルブミンを超音波でタンパク質抽出するために、脱脂したカボチャ種子粉末10gと溶媒として脱イオン水100mLを250mLのガラスビーカーに加える。タンパク質抽出は2段階からなる：まず、試料を プローブ型超音波発生装置UP400St（400W、24kHz）にソノトロードS24d7を装着。 超音波ホモジナイズ中、ガラスビーカーは冷水槽に置かれる。超音波ホモジナイザーUP400Stの温度センサーと温度制御設定により、サンプル温度は常に30℃以下に保たれます。超音波処理中の正確な温度制御により、アルブミンの変性が回避される。次に、ミキサーを使用し、回転数200rpm、温度30℃で抽出を行った。その後、ビーカーを恒温シェーカーに移す。グロブリンは蒸留水による透析で除去される。グロブリン除去後、アルブミンプロファイルの測定のためにタンパク質抽出物をサンプリングし、アルブミン凝固のために0.1 M HClを用いてpI=3.0に調整する。固相は5000g、20℃の遠心分離で分離し、脱イオン水に再溶解する。アルブミン凝固は、アルブミン濃縮物のタンパク質比率を高めるために2回行われる。

米糠からの蛋白質濃縮物の調製のための超音波アルカリ蛋白質抽出は、超音波処理により有意に短い抽出時間でより高い蛋白質収量をもたらすことを示している。 – 従来の抽出法に比べて

機能性iNOS酵素のサンプル調製プロトコール

完全に機能的なiNOS酵素を得るには（例えば薬剤スクリーニング用）、以下のプロトコールが推奨される：細胞懸濁液を氷上に置き、UP100Hを用い、振幅10µm、超音波処理5秒、静止25秒のサイクルで超音波処理を行う。この操作を約3回繰り返す。超音波処理サイクルの間の休止時間は温度上昇を抑えるので、変性リスクを低減する。

超音波によるタンパク質の可溶化

超音波処理は、通常数時間を要するタンパク質の可溶化プロセスを促進する可能性がある。サンプルを過熱せず、尿素を含む溶液中でのタンパク質の分解や変化を防ぐため、超音波のバーストは数秒以下とする。

タンパク質抽出用超音波装置

Hielscher Ultrasonics社は、細胞、組織、細菌、微生物、酵母、芽胞を分解するための幅広い超音波ホモジナイザーを提供しています。
Hielscher社のラボ用超音波発生装置は、パワフルで操作が簡単です。年中無休で稼動するよう設計されており、堅牢で効率的なラボ用・卓上用装置として設計されています。すべての装置において、エネルギー出力と振幅を正確に制御することができます。豊富なアクセサリーにより、セットアップの選択肢が広がります。VialTweeter、UP200Ht、UP200St、UP400Stなどのデジタル超音波発生装置には、温度制御機能が内蔵されており、自動データ記録用のSDカードが内蔵されています。
複数のサンプルの間接的でクロスコンタミネーションのない同時超音波処理には、VialTweeterまたは超音波CupHornをご用意しています。
下の表は、サンプル前処理、細胞破砕、抽出用の超音波ホモジナイザーの概要です。各超音波ホモジナイザーの詳細については、機器の種類をクリックしてください。お客様のサンプル前処理に最適な超音波ホモジナイザーをお選びいただけるよう、長年経験を積んだ当社の技術スタッフがお手伝いいたします！
 

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