組織および細胞培養物からの超音波タンパク質抽出
- タンパク質抽出は、プロテオミクスにおいて重要なサンプル調製ステップです。
- タンパク質は、植物や動物の組織、酵母、微生物から抽出できます。
- 超音波処理は、信頼性があり効率的なタンパク質抽出法であり、短い抽出時間で高いタンパク質収量を提供します。
組織および細胞からのタンパク質抽出
組織および培養細胞からのタンパク質抽出は、ELISA、PAGE、ウェスタンブロッティング、質量分析、タンパク質精製などの多くの生化学的および分析技術において行われる重要なサンプル調製ステップです。超音波細胞破壊、溶解および抽出は、タンパク質の高収率を確保するための精密に制御可能な非熱的技術である。
細胞からのタンパク質抽出 超音波プローブ UP200St
- 急速
- 高収率
- 高効率
- パラメータの正確な制御
- 再現性のある結果
- 線形スケーラビリティ
超音波溶解とタンパク質抽出のための一般的な指示
- 温度制御: 熱変性を起こさずに高いタンパク質収率を確保するには、抽出中の温度を制御する必要があります。ヒールシャーの最先端の超音波ホモジナイザー – 超音波崩壊器または超音波洗浄器とも呼ばれます – 正確に制御できます。プラグ可能な温度センサーが付属しています。超音波ホモジナイザーの設定オプションでは、最高温度を設定することができます。この最大温度に達すると、サンプルが冷えるまで超音波装置は自動的に停止します。
- バッファ： 適切なバッファーと適切な量のバッファーの選択は組織ごとに異なり、試行錯誤のテストによって把握する必要があります。
- 単離/精製: タンパク質溶解物には、DNAや炭水化物などの生体分子が過剰に含まれていることがあり、これらはタンパク質沈殿(デオキシコール酸-トリクロロ酢酸)または緩衝液交換によって除去される可能性があります。
ChittapaloとNoomhorm(2009)は、彼らの研究で、超音波処理を使用してタンパク質収量が増加し、超音波組織均質化および溶解プロセスが既存の抽出プロセスを大幅に強化できることを報告しました – 新たな商業的抽出の機会を可能にします。
超音波カップホーン タンパク質の単離とDNA断片化について、同じ条件下で複数のサンプルを同時に高効率のサンプル調製します。
動物組織からのタンパク質抽出
全体のサイズの組織(例えば、腎臓、心臓、肺、筋肉など)の調製のために、組織は非常に小さな断片に解剖されるべきであり、清潔な道具で、できれば氷上で、そしてできるだけ早くプロテアーゼによる分解を防ぐ必要があります(例えば、RIPAなどの溶解緩衝液またはプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤カクテルを含む低張溶解緩衝液)。解剖後、サンプルを液体窒素に浸して急速凍結します。サンプルは、後で使用するために-80°Cで保存することも、氷上に保管してすぐに均質化することもできます。超音波抽出の直前に、氷冷溶解緩衝液(プロテアーゼ阻害剤DTT、ロイペプチンおよびアプロチニンを含む)をサンプルチューブに急速に添加する(組織約~10mgあたり約~600μLの緩衝液が推奨される)。サンプルチューブあたり約20〜60mgのティッシュが推奨されます。
超音波均質化、溶解および抽出は、マイクロチップソノトロードを装備したUP100HまたはUP200Htなどの超音波ホモジナイザーを用いて行われる。超音波処理時間は、超音波処理15秒、休止時間10秒の超音波サイクルモードで60〜90秒です。サンプルは常に氷の中に保管する必要があります。
超音波均質化/抽出後、ライセートを27,000gで約20分間遠心分離する。その後、上清が収集されるため、タンパク質濃度はPierceタンパク質アッセイBCAなどのタンパク質アッセイによって決定できます。
血清からのタンパク質抽出
血清とリン酸緩衝液の均質な混合物の場合、超音波細胞溶解の前にサンプルを最初にボルテックスします。超音波溶解のために、サンプルを超音波実験室用ホモジナイザーで超音波処理します UP100H 20%の振幅で8サイクル、各5秒のオンと15秒のオフのサイクル。タンパク質抽出は、サイクルで超音波処理(脈動モード)し、サンプルの過熱および熱劣化が回避されるようにサンプルを氷上に置くことによって行われる。血清には高分子タンパク質(アルブミン、α1-アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロブリン、免疫グロブリンG、免疫グロブリンAなど)が大量に含まれており、IEF中の低分子タンパク質の分離を妨げるため、デプレッションカラムを使用して血清からそれらを枯渇させることをお勧めします。
植物組織からのタンパク質抽出
新鮮で柔らかい植物組織、例えばコケなどは、刻んだサンプル材料を超音波処理のために溶解緩衝液に入れるだけで容易に破壊することができます。種子、モミの針などの丈夫で筋質の植物組織は、粉砕して乾燥させる必要があります。一部の硬い木本植物材料は、超音波処理によって抽出する前に、凍結して液体窒素で粉砕する必要があります。植物細胞培養懸濁液の場合、溶解緩衝液中で30〜150秒の超音波処理が大抵十分です。カボチャの種のようなより丈夫な材料は、以下に説明するように、より強力な超音波処理を必要とします。
カボチャの種からのアルブミンの超音波抽出のためのプロトコル
細かく挽いたカボチャの種粉末からのアルブミンの超音波タンパク質抽出のために、10gの脱脂カボチャ種粉末および溶媒として100mLの脱イオン水を250mLガラスビーカーに添加する。タンパク質抽出は2つのステップからなる:まず、サンプルを超音波処理する。 超音波装置S400d24を搭載したプローブ型超音波装置UP24St(24W、7kHz)。 ガラスビーカーは、超音波均質化中に冷水浴中に置かれます。超音波装置UP400Stのプラグ可能な温度センサーと温度制御設定は、サンプル温度が常に30°C未満に保たれることを保証します。 超音波処理中の正確な温度制御により、アルブミンの変性が回避されます。次に、ミキサーを用いて200rpmの速度で30°Cで抽出を行いました。 その後、ビーカーはサーモスタットシェーカーに移されます。グロブリンは、蒸留水による透析によって除去されます。グロブリン除去後、タンパク質抽出物をサンプリングしてアルブミンプロファイルを測定し、その後、アルブミン凝固のために0.1 M HClを使用してpI=3.0に調整します。固相を5000g、20°Cで遠心分離することにより分離し、脱イオン水に再溶解します。アルブミン凝固は、アルブミン濃縮物中のタンパク質比を増加させるために2回行われます。
米ぬかからのタンパク質濃縮物の調製のための超音波アルカリタンパク質抽出は、超音波処理が有意に短い抽出時間でより高いタンパク質収率をもたらすことを示している – 従来の抽出方法と比較して。
機能性iNOS酵素のサンプル調製プロトコール
完全に機能するiNOS酵素を得るためには(例えば、薬物スクリーニングのために)、次のプロトコルが推奨されます:細胞懸濁液は氷上に置かれるべきであり、5秒のサイクルモードで10μmの振幅でUP100Hで超音波処理されます。この手順を約3回繰り返す必要があります。超音波処理サイクル間の休息時間は、温度上昇を減少させ、したがって変性のリスクを減らすでしょう。
超音波タンパク質可溶化
超音波処理は、通常数時間かかるタンパク質可溶化プロセスを加速する可能性があります。サンプルを過熱させず、尿素を含む溶液中のタンパク質分解および修飾を防ぐために、超音波バーストは数秒以上持続してはいけません。
超音波装置 UP200Ht 小さなサンプルの超音波処理のための2mmマイクロチップS26d2付き。
タンパク質抽出用超音波装置
ヒールシャー超音波は、細胞、組織、細菌、微生物、酵母、および胞子の崩壊のための超音波ホモジナイザーの広い範囲を提供しています。
ヒールシャーラボの超音波装置は強力で操作が簡単です。24/7の運用用に構築され、堅牢で効率的なラボおよびベンチトップデバイスとして設計されています。すべてのデバイスで、エネルギー出力と振幅を正確に制御できます。幅広いアクセサリーにより、さらなるセットアップオプションが広がります。デジタル超音波装置のような VialTweeter、UP200Ht、UP200St、およびUP400Stは、統合された温度制御と自動データ記録用の内蔵SDカードを持っています。
複数のサンプルの間接的でクロスコンタミネーションフリーの同時超音波処理のために、 VialTweeter または超音波CupHorn。
以下の表は、サンプル調製、細胞破壊および抽出のための当社の超音波装置の概要を示しています。デバイスタイプをクリックすると、各超音波ホモジナイザーに関する詳細情報が表示されます。私たちのよく訓練された長年の経験技術スタッフは、あなたがあなたのサンプル調製に最も適した超音波装置を選ぶのを手伝うために喜んでいます!
| バッチボリューム | 流量 | 推奨デバイス |
|---|---|---|
| 最大10本のバイアルまたはチューブ | N.A. | バイアルツイーター |
| マルチウェル/マイクロタイタープレート | N.A. | UIP400MTP |
| 複数のチューブ/容器 | N.A. | カップホーン |
| 1〜500mL | 10〜200mL/分 | UP100Hの |
| 10〜1000mL | 20〜200mL/分 | UP200HTの, UP200セント |
| 10〜2000mL | 20〜400mL/分 | UP400セント |
お客様の用途、材料、サンプル量に応じて、サンプル調製に最適なセットアップをお勧めします。今すぐお問い合わせください!
お 問い合わせ！/ お問い合わせください!
ヒールシャーデジタル超音波装置は、統合されたSDカード上のブラウザのリモコンと自動データプロトコルを備えています。
バイアルツイーター 間接的な超音波処理用。
知っておく価値のある事実
プロテオミクス
プロテオミクスは、タンパク質とプロテオームを研究する研究分野です。タンパク質は、生物内で膨大な数の生命機能を果たしています。プロテオームとは、ゲノム、細胞、組織、または生物によって特定の時間に発現されるタンパク質の全セットです。プロテオームは、細胞や生物が受ける時間や明確な要件、またはストレスによって異なります。より具体的には、特定の種類の細胞または生物において、特定の時間に、定義された条件下で発現されたタンパク質のセットです。この用語は、タンパク質とゲノムのブレンドです。プロテオミクスはプロテオームの研究です。
蛋白質
タンパク質は大きな生体分子、いわゆる高分子です – これは、アミノ酸残基の1つ以上の長鎖から構成されています。タンパク質は、植物由来と動物由来の両方のすべての生物に存在し、ほとんどの生物学的機能にとって重要です。タンパク質には多くの生物学的情報が含まれているため、プロテオミクス研究などの分析目的で抽出されます。タンパク質が果たす最も重要な機能には、代謝反応の触媒作用、DNA複製、刺激に対する応答、およびある場所から別の場所への分子の輸送が含まれます。タンパク質は、主にアミノ酸の配列が互いに異なり、これは遺伝子のヌクレオチド配列によって決定され、通常、タンパク質はその活性を決定する特定の三次元構造に折り畳まれます。タンパク質は – ペプチド以外にも – 食品の主要成分の1つ。したがって、プロテオミクスは、プロセス、食品の安全性、栄養評価を最適化するための食品科学の強力なツールです。
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction は、分析種を分離し、事前にコンセレートするための分析前手順です。超音波処理と組み合わせて、曇点抽出を強化して、プロセスをより効率的、迅速、そしてより環境に優しいものにすることができます。超音波処理では、曇点抽出は分析物調製のかなり効率的な方法です。 超音波支援曇点抽出についてもっと読む!電気泳動
ゲル電気泳動は、DNA、RNA、タンパク質などの高分子とそのフラグメントを、そのサイズと電荷に基づいて分離および分析するための主要な方法です。臨床化学では、電荷やサイズ(IEFアガロース、基本的にサイズに依存しない)でタンパク質を分離し、生化学、分子生物学、プロテオミクスでは、DNAとRNAフラグメントの混合集団を長さで分離したり、DNAとRNAフラグメントのサイズを推定したり、電荷でタンパク質を分離したりするために使用されます。
細胞培養
細胞培養は、制御された条件下で細胞を培養する制御された増殖プロセスです。細胞培養条件は細胞の種類によって異なります。一般に、細胞培養の環境は、必須栄養素(アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル)、成長因子、ホルモン、およびガス(CO2、O2)、物理化学的環境(pH緩衝液、浸透圧、温度)を調節します。ほとんどの細胞は表面または人工基質を必要としますが、他の細胞培養物は培養培地(懸濁培養、細胞懸濁液)で自由に浮遊して培養できます。
動物細胞株の大量培養は、ウイルスワクチンやその他のバイオテクノロジー由来製品の工業生産に使用されています。ヒト幹細胞は、移植目的で細胞の数を増やし、細胞をさまざまな体細胞タイプに分化させるために培養されます。
ティッシュサンプル
組織という用語は、細胞材料が細胞と完全な器官との間の組織レベルにある細胞中間体を表します。組織では、同じ起源から特定の機能を果たす類似の細胞が組み立てられます。複数の組織の機能的なグループ化により、臓器の複雑な構造が形成されます。
組織は、生物学、組織学/組織病理学、寄生虫学、生化学、免疫組織化学の研究、およびDNAの培養と抽出のためにサンプリングされます。動物(細分化:哺乳動物組織)と植物組織とを区別することができます。動物組織は、結合組織、筋肉組織、神経組織、上皮組織の4つの基本的なタイプに分類されます。植物組織は、表皮、地上組織、血管組織の3つの組織系に細分されます。
組織サンプルは、骨、筋肉、葉などの動物または植物の部分から調製できます。
体液
血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、滑液は体液であり、診断に関連する情報の優れた情報源を提供します。したがって、分析のための体液サンプルの高度な調製が重要です。最初の問題は、体液中に存在する成分の広いダイナミックレンジに関連しています。
タンパク質濃度の測定
Bradfordアッセイ、Lowryアッセイ、およびビシンコニン酸(BCA)アッセイは、タンパク質の濃度を決定するための一般的なアッセイです。ウシ血清アルブミン(BSA)は、最も頻繁に使用されるタンパク質標準物質の1つです。
溶解バッファー
溶解バッファーは、細胞の材料または組織(組織培養、植物、細菌、真菌など)、および細胞が構造内にあるかどうか、および構造の種類に応じて選択する必要があります。タンパク質、メンブレン、オルガネラの抽出用の幅広い溶解バッファーには、1つ以上の界面活性剤が配合されています。洗剤は通常、試行錯誤のテストまたは – 利用可能な場合 – 既存のタンパク質抽出プロトコルによる。界面活性剤は、組織源およびタンパク質に適合している必要があります。一般に、特定の組織/タンパク質に作用する最も穏やかな界面活性剤は、抽出物の最大限の機能を維持するために選択されます。さらに、メンブレンやオルガネラを抽出する場合、中性洗剤がメンブレンを無傷に保ちます。溶解バッファーで一般的に使用される界面活性剤は、CHAPS、デオキシコール酸、Triton™ X-100、NP40、Tween 20など、ほとんどが非イオン性または双性イオン性です。
例えば、脳、肝臓、腸、腎臓、脾臓などの組織は、RIPAで簡単に緩衝することができます – ただし、プロテアーゼ阻害剤とDTT(ゲル電気泳動など)を含める必要があります。
骨格筋組織用溶解緩衝液(氷冷):20 mM Tris(pH 7.8)、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、1 mM MgCl2、1 % Triton X-100、10 %(w/v)グリセロール、1 mM EDTA、1 mM ジチオスレイトール、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを添加
一般的なバッファーとその pH 範囲の表。一般に、これらの緩衝液は通常、20〜50 mMの濃度で使用されます。
| バッファ | pH範囲 |
|---|---|
| クエン酸 – NaOHの | 2.2 – 6.5 |
| クエン酸ナトリウム – クエン酸 | 3.0 – 6.2 |
| 酢酸ナトリウム – 酢酸 | 3.6 – 5.6 |
| カコジル酸ナトリウム塩 – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MESの – NaOHの | 5.6 – 6.8 |
| リン酸二水素ナトリウム – リン酸水素二ナトリウム | 5.8 – 8.0 |
| イミダゾール – HCl | 6.2 – 7.8 |
| モップ – 島 | 6.6 – 7.8 |
| トリエタノールアミン塩酸塩 – NaOHの | 6.8 – 8.8 |
| トリス – HCl | 7.0 – 9.0 |
| ヘープス – NaOHの | 7.2 – 8.2 |
| トリシン – NaOHの | 7.6 – 8.6 |
| 四ホウ酸ナトリウム – ホウ酸 | 7.6 – 9.2 |
| バイシン – NaOHの | 7.7 – 8.9 |
| グリシン – NaOHの | 8.6 – 10.6 |
ほとんどのバッファーは、温度に対してpH依存性を示します。これは、トリスバッファに特に当てはまります。pKaは25°Cで8.06から0°Cで8.85に変化します。
(pH と pKa of a buffer: pH は水溶液中の水素イオンの濃度を測定します。pKa (= 酸解離定数) は、分子が特定の pH 値でどのように作用するかを予測するのに役立つという点で、関連していますが、より具体的な測定値です。
トリゾール
TRIzolは、グアニジンチオシアン酸フェノール-クロロホルム抽出中にRNA/DNA/タンパク質を抽出するために使用される化学溶液です。超音波支援TRIzol抽出の使用は、同じサンプルから高いDNA、RNA、およびタンパク質の収率をもたらし、それにより他の抽出方法に優れています。
文献/参考文献
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.