大腸菌の超音波溶解

• 大腸菌細菌が微生物学およびバイオテクノロジーにおいて最も一般的に使用される細菌です。
• 超音波セル撹乱は、大腸菌の溶解のための信頼できる再現性のある結果を提供します。
• 激しいまだ正確に制御キャビテーションおよび剪断力が完全破壊および高い抽出収率（例えばタンパク質、DNA）をもたらします。

キャビテーションによる細胞破壊

超音波プローブ型ホモジナイザーは約で動作します。 （20kHzの時）は、第2の20,000サイクルとは、液体またはsupsensionsにキャビテーションを生じさせます。離れた細胞を引き裂く真空状の圧力および高温の音響キャビテーション微小領域。温度は数千摂氏度に達する可能性がありますが、キャビテーションのボリュームは、彼らが大幅にプロセスを加熱していないので、小さいです。超音波は、音響キャビテーションを発生し、せん断力は、穿孔や大腸菌の細胞膜を破ります – 超音波ホモジナイザーのデバイス設定に応じ。

超音波溶解のメリット

• 溶解の正確な制御（強度、振幅、温度）
• 具体的なサンプルに最適な適応
• 温度管理
• 非常に大規模なサンプル（リットルμL）と非常に小さいため
• 純粋な機械的処理
• 生産への研究室からリニアスケールアップ

化学とenzymtic溶解が問題となる可能性がある一方で – 化学的溶解は、タンパク質の構造を変更し、精製の問題を紹介し、酵素的溶解が長いインキュベーション時間を必要とし、再現性がないことができるので – 超音波破砕は、洗練された、高速の細胞破壊方法です。
超音波リシスは、機械的な力のみに基づいています。化学物質は添加され、超音波処理はせん断力によって細胞壁を破壊する。化学的なライシスは、タンパク質構造を変更し、精製の問題を導入することができます。 酵素破壊は長いインキュベーション時間を必要とし、再現できません。

一般的な推奨事項

超音波処理は、細胞懸濁液の非常に小中規模および大規模の量を溶解するための最も一般的な技術であります – 100L /時間までのピコリットルから（超音波フローセルを用いて）。細胞を液体剪断およびキャビテーションによって溶解されます。 DNAはまた、超音波処理の間に剪断されるので、細胞懸濁液にDNアーゼを添加する必要はありません。
温度管理：
サンプルを予冷し、氷上で超音波処理中に試料を保持することによって、試料の試料の熱分解を容易に防止することができます。
理想的には、サンプルは、リシス中に氷冷に保つ必要がありますが、ほとんどのサンプルでは、温度が培養または組織源の温度を超えて上昇しない場合は十分です。したがって、氷の上に懸濁液を維持し、5-10秒のいくつかの短い超音波パルスと10-30秒の一時停止で超音波処理することをお勧めします。一時停止中、低温を再確立するために熱が放散する可能性があります。より大きい細胞サンプルのために、冷却ジャケットが付いているさまざまな流れの細胞の反応器は利用できる。

大腸菌溶解物の調製のためのプロトコール

組換えタンパク質の発現解析および精製

E.コリペレットを、超音波システムで超音波処理しました。 UP100H （ヒールシャー）。この目的のために、細胞ペレットを冷却し、溶解緩衝液（50mMのTris-HClをpH = 7.5、100mMのNaCl、5mMのDTT、1mMのPMSF）に再懸濁し、氷上で10分間冷却しました。次いで、細胞懸濁液を冷却するために30秒の間隔に続く10秒の10回の短いバーストで超音波処理しました。最後に、細胞破片を14000rpmで15分間4℃で超遠心分離によって除去しました。 RPRの発現の確認のために、上清を12％ポリアクリルアミドゲル上で実行され、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングによって分析しました。 RPRの精製は、Niを用いて行きました²⁺製造元のマニュアルに従って-NTA樹脂（Invitrogen社、USA）。この段階では、天然の精製方法を用いました。精製されたタンパク質の純度は、12％ポリアクリルアミドゲルおよびその後のクマシーブルー染色での電気泳動を用いて評価しました。精製したタンパク質濃度は、マイクロBCAタンパク質アッセイキット（PIERCE、USA）によって測定しました。 （Azarnezhadら、2016）

細胞増殖、架橋および大腸菌細胞抽出物の調製

SeqAおよびRNAポリメラーゼチップ間大腸菌MG1655 MG1655またはΔseqAためODに37℃で増殖させました_600の 培地1mlあたりホルムアルデヒド（37％）27μlを加えた（最終濃度1％）前に、50mlのLB（+ 0.2％グルコース）中に約0.15の濃度で添加した。架橋は室温で20分間ゆっくり振盪（100rpm）し、続いて10mlの2.5Mグリシン（最終濃度0.5M）でクエンチした。熱ショック実験のために、E.coli MG1655を65mlのLB培地中、30℃でOD_600の 約0.3。その後培養物30mlを、事前に移し、43℃でフラスコを温め、残りは30℃に維持しました。細胞を室温でさらに遅い振盪する前に5分間、30又は43℃に維持したことを除いて上記のような架橋と消光がありました。細胞を遠心分離により回収し、冷TBS（pH7.5の）で2回洗浄しました。 1ミリリットルの溶解緩衝液に再懸濁した後（10mMトリス（pH8.0）、20％スクロース、50mMのNaCl、10mMのEDTA、10 mg / mlとリゾチーム）および4 mlのIPを加え、続いて30分間37℃でインキュベーション緩衝液は、細胞は、12時間30秒と30秒の休憩を用いて氷上で超音波処理しました。 UP400St 100％のパワーで超音波処理（ヒールシャー超音波社）。 9000グラムで10分間遠心分離した後、上清の800μlのアリコートを-20℃で保存しました。 （2010 Waldminghaus）

酵素の過剰産生および精製。

decahistidine（His10）タグ付きタンパク質の過剰産生のために、大腸菌BL21（DE3）をpET19b構築物で形質転換しました。一晩前培養物を遠心分離によって回収し、そして1％の発現培養物を接種しました。 pET19mgtBを有する細胞は、OD（600nmでの光学密度まで22℃で増殖させました_600の）0.7。培養物を17℃に移し、100μMのIPTGにより誘導しました。 16時間後、培養物を4℃で7,500×gでの遠心分離によって回収しました。細胞を、pH7.4の0.3MのNaClと50mMのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁し、S2でマイクロチップソノトロードで超音波破砕しました。 UP200St 0.5のサイクルと75％の振幅で超音波発生装置（ヒールシャー、テルトウ、ドイツ）。
decahistidineタグGTFCの過剰産生は、ODで37℃で誘導しました_600の 100μMのIPTGで0.6の。次いで、細胞を、4時間インキュベートし回収し、MgtBについて上で述べたように溶解しました。
粗細胞抽出物は、細胞破片を沈降さ15,000×gで、4℃で遠心分離しました。清澄化した抽出物をÄKTAprimeプラスシステム（GE Healthcare）を用いて1mlのHisTrap FF粗カラムにロードしました。酵素は、Hisタグタンパク質の勾配溶出のために、製造業者のプロトコルに従って精製しました。溶出したタンパク質溶液を4℃で0.3 M NaClを含む50mMのPBS、pH7.4中、1,000容量に対して2回透析しました。精製は、12％SDS-PAGEによって分析しました。タンパク質の濃度は、ロティ、クワント（カール・ロート社、カールスルーエ、ドイツ）を用いてBradford法により決定しました。 （Rabauschら、2013）

大腸菌からのタンパク質の抽出
関心のベイトタンパク質（この場合には、シロイヌナズナのMTV1）は、GSTタグに融合され、BL21大腸菌（E. coli）細胞で発現します。
1.（50ミリリットル細菌培養物に相当する）GST-MTV1及びGSTのペレットを取り、2.5 mLの氷冷抽出緩衝液中にそれぞれ再懸濁。
2.超音波装置を使用してください UP100H これらは、溶解された減少不透明度及び粘度の増加によって示されるまで、細菌細胞を破壊する（少量用MS3のマイクロチップ・ソノトロード（2-5mL）を装備）。これは、氷の上で行わなければならず、間隔（氷上などで10秒間、続いて例えば10秒間の超音波処理）で超音波処理することが推奨されます。ケアは高すぎる強度で超音波処理しないように注意しなければなりません。発泡又は白色沈殿物の形成が検出された場合、強度が低下する必要があります。
3. 4°C、20分間、16,000×gで1.5 mlのマイクロ遠心チューブと遠心分離機に溶解した菌液を移します。

大腸菌におけるアリシン修飾タンパク質

5,5'-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）アッセイによるスルフヒドリル内容の決意
E.コリMG1655一晩培養物を、MOPSを最少培地（1：100）を接種しました。 0.4のA600に達するまで文化が好気的に増殖させました。文化は、ストレス処理のための3つの15-mlの培養液に分けました。未処理の文化は、負の対照としました。 0.79 mMのアリシン（128μgのミリリットル^-1）又は1mMのジアミドは、残りの二つの文化それぞれの一つに加えました。培養物を15分間インキュベートしました。各培養物の5mlを遠心分離（8525×gで、4℃、10分間）により回収しました。細胞をPBS（137mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのナトリウム1mlで2回洗浄しました₂HPO₄、2mMのKH₂Po₄、pHは7.4、使用する嫌気前に記憶されている）および（13,000×gで、4℃、10分間）遠心分離しました。細胞を超音波処理によって、4℃で前破壊に（6mmのグアニジニウム塩酸、pH7.4でPBS）溶解緩衝液に再懸濁しました（VialTweeter 超音波発生装置、ヒールシャー社、ドイツ）（3×1分）。細胞の破片を遠心分離（13,000×gで、4℃、15分）によりペレット化しました。上清を磁気攪拌棒を3.5 mlのQS-マクロキュベット（10ミリメートル）に移し、溶解緩衝液1mlと混合しました。試料の吸光度を室温でPSC-718温度制御セルホルダー（日本分光）を備えたJasco V-650分光光度計を用いて412nmでモニターしました。 3ミリモルのジチオビス（2-ニトロ安息香酸）溶液100μlを加えました。それが飽和状態に達するまで絶滅をモニターしました。チオール濃度の計算は、吸光係数εを用いて行きました_412の = 13,700 M^-1 Cm^-1 チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）のために。セルラチオール濃度は6.7×10の大腸菌細胞の体積に基づいて計算しました^-15歳 リットルとAの細胞密度_600の = 0.5（1当量×10⁸ 細胞ミリリットル^-1 文化）。 （Mullerら。2016）

インビボでのグルタチオンの決意で

大腸菌MG1655はAまで200ミリリットルの総容積でMOPS最少培地で増殖させました_600の 0.5に達しました。文化は、ストレス処理のための50-mlの培養液に分けました。 0.79 mMのアリシン、1mMのジアミド、又はジメチルスルホキシド（対照）とのインキュベーションの15分後、細胞を10分間4℃で4000グラムで回収しました。細胞は、KPE緩衝液の700μlの中で前のペレットの再懸濁にKPE緩衝液で2回洗浄しました。脱タンパク質のために、10％の300リットルは、（w / v）のスルホサリチル酸は、従来の超音波（3×1分による細胞の破壊に加えました。 VialTweeter 超音波装置）。上清を遠心分離（30分、13000グラム、4℃）後に回収しました。スルホサリチル酸濃度は、KPE緩衝液の3つの容量の添加により1％まで減少しました。上述したように、総グルタチオンおよびGSSGの測定を行いました。細胞グルタチオン濃度が6.7の大腸菌細胞の体積に基づいて計算しました×10歳^-15歳 リットルとAの細胞密度_600の 00.5（1に等しいです×10歳⁸ 細胞ミリリットル^-1 文化）。 GSH濃度は、総グルタチオンから2 [GSSG]の減算によって計算しました。 （Mullerら。2016）

大腸菌におけるヒトmAspATの発現

大腸菌BL21（DE3）の単一コロニーを、100μgの/ mLのアンピシリンを含むルリア - ベルターニ（LB）培地30mlに発現ベクターを保有し、その後光学密度まで37℃で培養し（OD_600の）0.6に達しました。細胞を10分間、4,000×gでの遠心分離によって回収し、そして100μgの/ mLのアンピシリンを含有する3Lの新鮮なLB培地に再懸濁しました。
続いて、タンパク質発現は16ºCで20時間、1mMのイソプロピルβ-ᴅ-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導しました。細胞を15分間、8,000×gでの遠心分離によって回収し、緩衝液A（20mMののNaH 2 PO 4、0.5MのNaCl、pH7.4）で洗浄しました。近似45グラム（湿重量）の細胞は、3 Lの培養物から得ました。遠心分離後、細胞ペレットを氷冷抽出緩衝液A（1 L培養のため）40mLに再懸濁し、そして使用して氷冷の温度で超音波処理によって溶解します UP400St 楽器（博士ヒールシャー社、ドイツ）。細胞溶解は、可溶性（上清）および沈殿した（ペレット）画分を分離するために15分間12,000rpmで遠心分離しました。 （ジャンら、2015）

下の表は私達のultrasonicatorsのおおよその処理能力の目安を与えます：