大腸菌の超音波溶解
- 大腸菌は、微生物学やバイオテクノロジーで最もよく使用される細菌である。
- 超音波細胞破砕機は、大腸菌の溶解に信頼性と再現性の高い結果をもたらします。
- 強力でありながら精密に制御可能なキャビテーションとせん断力により、完全な破砕と高い抽出収率（タンパク質、DNAなど）を実現します。
なぜ超音波による大腸菌の細胞破砕が望ましいのか？
超音波ホモジナイザーまたはプローブ型超音波装置は、強力な超音波が細胞壁や細胞膜を効率的に破壊するため、大腸菌の溶解にいくつかの利点を提供する。プローブ型超音波装置は、以下の理由により、大腸菌の溶解に広く使用されている：
を使えば、大腸菌細胞からのタンパク質抽出を効率的に行うことができる。 超音波プローブ UP200St
プローブ型超音波装置は、大腸菌の溶解に多くの利点を提供する。超音波プロセスパラメーターの確実で正確な制御により、出力、時間、サンプルハンドリングなどの操作パラメーターを最適化し、望ましい結果を得ることができる。
大腸菌EDL933のゲノムDNAを0〜15分間超音波処理した際の電気泳動解析。LはDNA Ladderを示す。
(研究・画像：©Basselet et al.）
超音波キャビテーションによる細胞破壊
超音波プローブタイプのホモジナイザーは、毎秒約20,000サイクル（20kHz）で作動し、液体や懸濁液中にキャビテーションを発生させる。音響キャビテーションは、真空のような圧力と高温の微細な領域で、細胞を引き裂く。温度は摂氏数千度に達することもあるが、キャビテーションの体積は非常に小さいため、プロセスを著しく加熱することはない。超音波によって発生する音響キャビテーションとせん断力は、大腸菌などの細菌細胞の細胞膜を穿孔または破壊する。Hielscher社の超音波装置は、超音波強度、振幅、エネルギー入力、温度などのプロセスパラメーターを正確に制御することができます。これにより、超音波溶解プロセスを細胞の種類、細胞培養、プロセス目標に合わせて最適に調整することができる。
- 溶解の精密制御（強度、振幅、温度）
- 信頼性が高く、再現性のある結果
- 特定サンプルへの最適な適応
- 温度調節
- ごく少量から大量サンプルまで（μL～リットル）
- 純粋な機械的治療
- ユーザーフレンドリーで安全な操作
- ラボから生産への直線的なスケールアップ
バイアルツイーター 超音波溶解用
超音波ホモジナイザーと他の溶解技術との比較
化学的溶解や酵素的溶解が問題になることもあるが – 化学的溶解はタンパク質の構造を変化させ、精製の問題を引き起こす可能性があり、酵素的溶解は長いインキュベーション時間を必要とし、再現性がない。 – 超音波破砕法は、洗練された高速細胞破砕法である。
超音波溶解は機械的な力のみに基づいている。化学薬品は加えず、超音波はせん断力によって細胞壁を破壊する。化学的溶解はタンパク質の構造を変化させ、精製の問題を引き起こす可能性がある。酵素的破砕は長い培養時間を必要とし、再現性がない。超音波による大腸菌の細胞破砕は、迅速、簡便、信頼性が高く、再現性が高い。そのため、Hielscher社の超音波破砕機は、サンプル前処理、プレアナリティクス、in-vitroダイアグノスティックス、多様なアッセイなど、世界中の生物学・生化学研究所で使用されています。
超音波溶解に関する一般的な推奨事項
超音波処理は、非常に少量、中量、大量の細胞懸濁液を溶解するための最も一般的な技術である。 – ピコリットルから100L/hrまで（超音波フローセル使用）。細胞は液体のせん断とキャビテーションによって溶解される。DNAも超音波処理中にせん断されるため、細胞懸濁液にDNaseを添加する必要はない。
大腸菌超音波溶解時の温度制御
試料を予冷し、超音波処理中の試料を氷上に保つことで、試料の熱劣化を容易に防ぐことができる。
理想的には、溶解中はサンプルを氷冷状態に保つべきであるが、ほとんどのサンプルでは、培養温度や組織源の温度以上に温度が上昇しなければ十分である。したがって、懸濁液を氷上に保ち、5～10秒の短い超音波パルスと10～30秒の休止を数回繰り返す超音波処理を行うことを推奨する。休止の間、低温を再確立するために熱を放散させることができる。より大きな細胞サンプルの場合は、冷却ジャケッ トを備えた様々なフローセルリアクターが利用可 能である。
超音波溶解を成功させるための詳しいヒントと推奨事項はこちらをお読みください！
大腸菌溶解液の超音波調製プロトコール
研究者は大腸菌の細胞破砕にHielscher社の超音波ホモジナイザーを使用しています。以下に、大腸菌関連の様々な用途で、Hielscher社製超音波ホモジナイザーを使用した大腸菌溶解のための、試験済みで実績のある様々なプロトコルをご紹介します。
超音波を用いた細胞増殖、架橋および大腸菌細胞抽出物の調製
SeqAおよびRNAポリメラーゼChIP-Chipのために、大腸菌MG1655またはMG1655 ΔseqAを37℃でOD600 50mlのLB（+0.2%グルコース）に約0.15のホルムアルデヒド（37%）を添加した後、培地1mlあたり27μlのホルムアルデヒド（最終濃度1%）を添加した。架橋は室温で20分間ゆっくり振盪（100rpm）した後、10mlの2.5Mグリシン（最終濃度0.5M）でクエンチした。熱ショック実験では、大腸菌MG1655を65mlのLB培地で30℃、OD600 約0.3であった。その後、30mlの培養液をあらかじめ43℃に加温したフラスコに移し、残りは30℃に保った。架橋とクエンチは、細胞を30℃または43℃で5分間保持した後、室温でさらにゆっくり振盪する以外は、上述のように行った。細胞を遠心分離で回収し、冷TBS（pH7.5）で2回洗浄した。mlの溶解バッファー（10mM Tris（pH8.0）、20％スクロース、50mM NaCl、10mM EDTA、10mg/mlリゾチーム）に再懸濁し、37℃で30分間インキュベートした後、4mlのIPバッファーを加え、Hielscher社製超音波プロセッサーUP400Stを100％出力設定で使用し、氷上で30秒と30秒の休憩を12回挟みながら細胞を超音波処理した。9000gで10分間遠心した後、800μlの上清を-20℃で保存した（Waldminghaus 2010）。(Waldminghaus 2010)
超音波プローブによる酵素の過剰生産と精製
デカヒスチジン(His10)タグタンパク質を過剰生産するために、大腸菌BL21(DE3)をpET19bコンストラクトで形質転換した。一晩の前培養を遠心分離で回収し、1%を発現培養に用いた。pET19mgtBを導入した細胞を22℃で600nmの光学密度（OD600）が0.7になるまで培養した。培養液を17℃に移し、100μM IPTGで誘導した。16時間後、培養液を7,500×g、4℃で遠心分離して回収した。細胞をpH7.4の0.3M NaClを含む50mMリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁し、Hielscher社製超音波発生装置UP200StのS2マイクロチップソノトロードを用い、0.5サイクル、振幅75%で超音波処理を行い破砕した。
デカヒスチジンタグGtfCの過剰生産は、37℃でOD600 を100μM IPTGで0.6に調整した。その後、細胞を4時間インキュベートし、収穫し、MgtBについて上記したように溶解した。
粗細胞抽出物を15,000×g、4℃で遠心分離し、細胞残屑を沈殿させた。清澄化した抽出液をÄKTAprime Plusシステムを用いて1mlのHisTrap FF Crudeカラムにロードした。酵素は、Hisタグタンパク質のグラジエント溶出のための製造業者のプロトコールに従って精製した。溶出したタンパク質溶液は、4℃で0.3 M NaClを含む1,000容量の50 mM PBS, pH 7.4に対して2回透析した。精製は12% SDS-PAGEで分析した。タンパク質の濃度は、Roti-Quantを用いたBradford法で決定した。(Rabausch et al. 2013)
大腸菌からのタンパク質の超音波抽出
目的のベイトタンパク質（この場合はシロイヌナズナのMTV1）をGSTタグに融合し、BL21大腸菌（E. coli）細胞で発現させる。
- GST-MTV1とGSTのペレットを1つずつ（50 mlの細菌培養に相当）取り、それぞれを2.5 mLの氷冷抽出バッファーに懸濁する。
- 超音波発生装置UP100H（約2～5mLの少量用MS3マイクロチップソノトロード付き）を使用し、細菌細胞が溶解するまで破砕する。これは氷上で行う必要があり、間隔をあけて超音波処理することを推奨する（例えば、10秒超音波処理した後、氷上で10秒休止するなど）。強すぎる超音波処理には注意が必要である。発泡や白色沈殿物の生成が検出された場合は、強度を下げる必要がある。
- 溶解した菌液を1.5 mL微量遠心チューブに移し、4℃、16,000 x gで20分間遠心する。
UP400Stのようなプローブタイプの超音波発生器 大腸菌の効率的な溶菌のために音響キャビテーションの作動原理を使用する。
超音波を用いた組換えタンパク質の発現解析と精製
大腸菌ペレットをHielscher社製超音波処理装置UP100Hで超音波処理した。この目的のため、細胞ペレットを冷やした溶解バッファー（50 mM Tris-HCl pH=7.5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF）に懸濁し、氷上で10分間冷却した。次に、細胞懸濁液を10秒間の短いバースト10回で超音波処理し、その後30秒間冷却した。最後に、4℃で15分間、14000 rpmで超遠心し、細胞残屑を除去した。rPRの発現を確認するため、上清を12%ポリアクリルアミドゲルにかけ、SDS-PAGEとウェスタンブロッティングで解析した。rPRの精製は、Ni2+-NTA樹脂（Invitrogen, USA）を用いてメーカーガイドに従って行った。この段階では、ネイティブ精製法を用いた。精製タンパク質の純度は、12％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動とその後のクマシーブルー染色を用いて評価した。精製タンパク質濃度は、Micro BCA protein assay kit (PIERCE, USA)を用いて測定した。(Azarnezhad et al.）
大腸菌溶解用超音波ホモジナイザー
Hielscher Ultrasonics社は、大腸菌やその他の細胞、組織、細胞培養を確実かつ効率的に溶解するための高性能超音波ホモジナイザーを設計、製造、供給しています。
超音波プローブおよび間接超音波処理システムの幅広いポートフォリオにより、お客様の細胞破砕および抽出アプリケーションに理想的な超音波組織ホモジナイザーを提供することができます。
デザイン、製造、コンサルティング – 品質 ドイツ製
Hielscher社の超音波装置は、その最高の品質と設計基準でよく知られています。スマートなソフトウェア、直感的なメニュー、プログラム可能な設定、自動データプロトコールは、Hielscher超音波発生装置の特徴のほんの一部に過ぎません。頑丈で操作が簡単なため、研究施設やバイオテクノロジー施設にスムーズに組み込むことができます。Hielscherの超音波装置は、過酷な条件や厳しい環境にも容易に対応します。
Hielscher Ultrasonics社は、ISO認証取得企業であり、最先端の技術と使いやすさを特徴とする高性能超音波振動子に特に重点を置いています。もちろん、Hielscherの超音波装置はCEに準拠しており、UL、CSA、RoHsの要件を満たしています。
下の表は、超音波処理装置の処理能力の目安です：
| バッチ量 | 流量 | 推奨デバイス |
|---|---|---|
| マルチウェル／マイクロタイタープレート | n.a. | UIP400MTP |
| バイアルまたはビーカー用カップホーン | n.a. | 超音波カップホーン |
| 超音波マイクロフローリアクター | n.a. | GDmini2 |
| 0.5～1.5mLバイアル10本まで | n.a. | バイアルツイーター |
| 00.5〜1.5mL | n.a. | バイアルツイーター |
| 1〜500mL | 10～200mL/分 | UP100H |
| 10〜2000mL | 20～400mL/分 | UP200Ht, UP400ST |
| 0.1～20L | 0.2～4L/分 | UIP2000hdT |
| 10～100L | 2～10L/分 | UIP4000 |
| n.a. | 10～100L/分 | uip16000 |
| n.a. | より大きい | クラスタ uip16000 |
お問い合わせ/ お問い合わせ
大腸菌超音波溶解の追加プロトコール
超音波バイアルトゥイーターを用いた大腸菌中のアリシン修飾タンパク質
5,5′-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）アッセイによるスルフヒドリル含量の測定
大腸菌MG1655の一晩培養液をMOPS最小培地（1:100）に接種した。A600が0.4になるまで好気的に培養した。この培養液を3つの15ml培養液に分割し、ストレス処理を行った。未処理の培養はネガティブコントロールとした。0.79mMのアリシン（128μg ml-1）または1mMのジアミドを残りの2つの培養のうち1つにそれぞれ添加した。培養は15分間行った。各培養液5mlを遠心分離（8,525×g、4℃、10分）により回収した。細胞を1mlのPBS（137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、pH7.4、使用前は嫌気的に保存）で2回洗浄し、遠心分離した（13,000×g、4℃、10分間）。細胞を溶解バッファー（6mMグアニジニウムHClを含むPBS、pH7.4）に再懸濁し、4℃で超音波破砕した(バイアルツイーター ultrasonicator, Hielscher GmbH, Germany）（3×1分）。遠心分離（13,000×g、4℃、15分）により細胞残渣をペレット化した。上清をマグネチックスターバー付き3.5ml QS-macroキュベット（10mm）に移し、1mlの溶解バッファーと混合した。サンプルの消光は、PSC-718温度制御セルホルダーを備えたJasco V-650分光光度計を用い、室温で412 nmでモニターした。100μlの3mMジチオビス（2-ニトロ安息香酸）溶液を加えた。消光は飽和に達するまでモニターした。チオール濃度の計算は、消光係数ϵを用いて行った。412 = 13,700 M-1 cm-1 チオ-2-ニトロ安息香酸（TNB）。細胞内チオール濃度は、大腸菌の細胞体積6.7 × 10-15 リットル、細胞密度A600 = 0.5（1×10に相当）。8 細胞 ml-1 培養）。(Müller et al.）
超音波細胞破砕機を用いた生体内グルタチオン測定
大腸菌MG1655をMOPS最小培地にて、A600が0.5になるまで200ml培養した。この培養液をストレス処理用に50mlに分割した。0.79mMアリシン、1mMジアミド、またはジメチルスルホキシド（コントロール）で15分間インキュベートした後、4,000g、4℃で10分間細胞を回収した。700μlのKPEバッファーにペレットを再懸濁する前に、細胞をKPEバッファーで2回洗浄した。脱タンパク質化のために、超音波による細胞破砕（3×1分）の前に10%(w/v)のスルホサリチル酸を300l添加した； バイアルツイーター 超音波処理器）。遠心分離（30分、13,000g、4℃）後、上清を回収した。スルホサリチル酸濃度は、3容量のKPEバッファー添加により1%まで低下させた。総グルタチオンとGSSGの測定は、上述のように行った。細胞内グルタチオン濃度は、大腸菌細胞量6.7g/mlを基準として算出した。×10-15 リットル、細胞密度A600 0.5（1,000mlに相当）。×108 細胞 ml-1 培養）。GSH濃度は、総グルタチオンから2[GSSG]を差し引くことで算出した。(Müller et al. 2016)
超音波ホモジナイザーを用いた大腸菌でのヒトmAspATの発現
発現ベクターを導入した大腸菌BL21（DE3）のシングルコロニーを、100μg/mLのアンピシリンを含むLuria-Bertani（LB）培地30mL中で培養し、37℃で光学密度（OD600)が0.6に達した。細胞を4,000×g、10分間の遠心分離で回収し、100μg/mLのアンピシリンを含む3Lの新鮮なLB培地に再懸濁した。
その後、1 mMのイソプロピルβ-ᴅ-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いて、16℃で20時間タンパク質発現を誘導した。8,000×g、15分間の遠心分離で細胞を回収し、バッファーA（20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, pH 7.4）で洗浄した。3Lの培養液から約45g（湿重量）の細胞を得た。遠心分離後、細胞ペレットを氷冷した抽出バッファーA 40 mL（1 L培養の場合）に懸濁し、Hielscher社製超音波細胞破砕機UP400Stを用い、氷冷下での超音波処理により細胞溶解を行った。細胞溶解を12,000 rpmで15分間遠心分離し、可溶性画分（上清）と沈殿画分（ペレット）に分離した。(Jiang et al.）
知っておくべき事実
大腸菌
大腸菌（Escherichia coli、E. coli）は、グラム陰性、通性嫌気性、桿状の大腸菌属の細菌で、温血動物（内生動物）の下腸に多く存在する。大腸菌には、多様な特徴を持つ多数の菌株（または亜型）が存在する。ほとんどの大腸菌はヒトに無害であり、例えばB株やK-12株は実験室での研究用途によく使用されている。しかし、一部の菌株は有害で、深刻な病気を引き起こす可能性がある。
大腸菌は操作が容易であるため、現代の生物工学や産業微生物学において重要な役割を果たしている。大腸菌は、組換えデオキシリボ核酸（DNA）を作製したり、モデル生物として機能させるなど、一般的な実験用途によく使用されている。
大腸菌は、異種タンパク質を生産するための非常に汎用性の高い宿主であり、大腸菌で組換えタンパク質を生産するための多様なタンパク質発現系が利用可能である。タンパク質の高発現を可能にするプラスミドを用いることで、細菌に遺伝子を導入することができ、工業的な発酵プロセスでそのようなタンパク質を大量に生産することができる。
大腸菌はインスリンを生産する細胞工場として使用されている。さらなる用途としては、ワクチンや固定化酵素の開発・生産、バイオ燃料の生産、バイオレメディエーションのための改変大腸菌細胞の使用がある。
K-12株は、アルカリホスファターゼ（ALP）という酵素を過剰発現する大腸菌の変異型である。この突然変異は、酵素を常時コードしている遺伝子の欠陥によって起こる。遺伝子が阻害なしに産物を産生する場合、これは構成的活性として知られている。この特異的変異型は、ALP酵素の単離と精製に用いられる。
大腸菌も細胞工場として広く使われている。遺伝子操作された微生物（バクテリアなど）や植物細胞は、いわゆる細胞工場として使用することができる。これらの遺伝子組み換え細胞は、分子、化学物質、ポリマー、タンパク質、その他の物質を生産し、例えば製薬、食品、化学産業で使用される。このような生物工学的に改変された細胞の内部で生産された分子を放出させるためには、細胞壁を破壊して目的物質を周囲の液体に移行させる超音波溶解が一般的な方法である。 バイオエンジニアリングされた細胞の溶解についてもっと読む！
超音波DNAシャーリング
超音波剪断力は、細胞内部から分子、細胞小器官、タンパク質を放出させるだけでなく、DNA鎖を断片に切断するために一般的に使用される方法である。音響キャビテーションは、細胞壁や細胞膜を破壊して細胞からDNAを取り出し、約600μmの断片を生成する。 – 長さは800bpで、分析には理想的である。
DNA断片化用超音波ホモジナイザーについて詳しくはこちらをご覧ください！
文献・参考文献
- Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
- Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
- Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
- Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
- Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
- Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.
