超音波処理によるSARS-CoV-2コロナウイルス不活化プロトコール

Hielscher VialTweeterは、コロナウイルスSARS-COV-2の不活性化に使用されるユニークな超音波マルチサンプル調製ユニットです。VialTweeterは最大10個のサンプルバイアルを同時に調製でき、大量サンプル処理に理想的なユニットです。

VialTweeterによるSARS-CoV-2コロナウイルスの不活化

固定液を除去した後、単層膜をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄してから、1mLのMEM/5％FBSに細胞を掻き入れ、Hielscher社製の超音波処理装置を用いて超音波処理（100％の出力と振幅で10秒オン、10秒オフ×3回）を行った。 UP200StとVialTweeter 添付文書上清は3000×gで10分間遠心分離して清澄化した。Welchら(2020)によるSARS-CoV-2コロナウイルスの不活化に関するプロトコール全文は以下を参照のこと：

細胞とウイルス

Vero E6細胞（Vero C1008; ATCC CRL-1586）は、10％（v/v）の子牛胎児血清（FCS）を添加した改良イーグル最小必須培地（MEM）で培養した。使用したウイルスはSARS-CoV-2株hCOV-19/England/2/2020で、PHEが2020/01/29に英国で発生した最初の患者群から分離したものである。このウイルスは継代1で入手し、継代2または3で不活化試験に使用した。
SARS-CoV-2の不活化および試薬の細胞毒性の除去に使用した試薬と化学物質については、Welchら（2020年）の科学的報告を参照されたい。

洗剤によるウイルスの不活化 – WelchらによるSARS-CoV-2コロナウイルスの不活化プロトコール（2020年

SARS-CoV-2の不活化

市販品では、ウイルス製剤（組織培養液、力価1×10～）を使用する。⁶ から1×10⁸ PFU/ml）を、製造業者の使用説明書（入手可能な場合）に推奨されている濃度および接触時間、または試験所から特に要求された濃度および接触時間で、試薬で3連処理した。メーカーが濃度範囲を指定している場合は、製品対試料の比率が最も低いもの（すなわち、試験製品の推奨濃度が最も低いもの）を試験した。検体輸送用チューブ試薬は、製造業者により検体液と試薬の容量比が指定されていない限り、1容量の組織培養液と10容量の試薬の割合で試験した。洗浄剤、固定剤および溶媒は、指示された濃度で指示された時間試験した。不活化工程はすべて室温（18～25℃）で行った。代替サンプルの試験では、ウイルスを1:9の割合で指示されたサンプルマトリックスにスパイクし、上記のように試験試薬で処理した。すべての実験には、試験試薬の代わりに等容量のPBSを用いた3連対照モック処理試料が含まれる。必要な接触時間の直後に、適切に選択された濾過マトリックスを用いて1mLの処理サンプルを処理した。不活性化試験用の試薬除去は、Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns（Thermo Fisher社製）を用いて大きめのスピンカラム形式で行うか、空のPierce 10mL容量遠心カラム（Thermo Fisher社製）にSM2 Bio-Beads、Sephacryl S-400HRまたはSephadex LH-20を充填して4mL充填ビーズ/樹脂を得た。Amiconフィルターを用いた精製では、2×500μlのサンプルを2つの遠心フィルターを用いて前述の方法で精製し、プールした。ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒド除去ホルムアルデヒドの場合は、1×500μlのサンプル量でフィルター1枚を使用し、処理後500μlのPBSに再懸濁し、400μlのMEM/5�Sに加えた。感染した モノレイヤー、12.5cm² フラスコにVero E6細胞（2.5×10⁶ 細胞/フラスコ、2.5mL MEM/5% FBS）をMOI 0.001で感染させ、37℃/5% CO₂ を24時間続けた。上清を除去し、5mLのホルムアルデヒド、またはホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドを用い、室温で15分または60分間細胞を固定した。固定液を除去し、単層をPBSで3回洗浄した後、細胞を1mLのMEM/5% FBSに掻き入れ、VialTweeterアタッチメント付きUP200St（Hielscher Ultrasound Technology社製）を用いて超音波処理（100%の出力と振幅で10秒オン、10秒オフ×3回）を行った。上清は3000×gで10分間遠心して清澄化した。

SARS-CoV-2コロナウイルスの不活化に使用した試薬の詳細（Welchらのプロトコールに従った超音波VialTweeterによる）。

Hielscher VialTweeterの使用を含む完全なプロトコルはこちらをご覧ください：
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

洗練された超音波剥離装置と細胞破砕装置

マルチサンプル超音波ディスメンブレーターVialTweeterは、生物学、生化学、臨床検査室におけるサンプル前処理のための数多くの超音波ソリューションの一つに過ぎません。例えば、細胞溶解、細胞抽出、組織ホモジナイズ、溶解液の可溶化、溶解、サンプルの脱気などです。
1時間に何個、1日に何個の試料を処理するのか、直接超音波処理か間接超音波処理か、また超音波試料処理の目的をお知らせください。お客様の日常業務に最適な超音波ユニットをご提案いたします！
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