超音波処理によるSARS-CoV-2コロナウイルス不活化のプロトコル

Hielscher VialTweeterは、コロナウイルスSARS-COV-2を不活性化するために使用されるユニークな超音波マルチサンプル調製ユニットです。VialTweeterは、最大10個のサンプルバイアルを同時に調製できるため、大量サンプル処理に理想的なユニットです。

SARS-CoV-2コロナウイルスの不活性化 VialTweeter

固定剤を除去した後、単分子膜をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄した後、細胞を1mLのMEM / 5�Sに掻き取り、ヒールシャー超音波プロセッサを使用して超音波処理(3×10秒オン、100%電力および振幅で10秒オフ)した UP200StとVialTweeter 愛着。上清は、3000 × gで10分間遠心分離することにより清澄化しました。

Welch et al. (2020) による SARS-CoV-2 コロナウイルス不活化に関するプロトコルの全文は、以下をご覧ください。

細胞とウイルス

Vero E6細胞(Vero C1008;ATCC CRL-1586)を、10%(v/v)のウシ胎児血清(FCS)を添加した改変Eagleの最小必須培地(MEM)で培養しました。使用されたウイルスはSARS-CoV-2株hCOV-19/England/2/2020で、2020年1月29日に英国で最初の患者クラスターからPHEによって分離されました。このウイルスは1番で採取され、2番または3番で不活化試験に使用されました。
SARS-CoV-2の不活化、および試薬の細胞毒性の除去に使用される試薬および化学物質については、Welch et al. (2020)の科学レポートをご覧ください。

洗剤によるウイルスの不活化 – SARS-CoV-2 Coronavirus Inactivation protocol by Welch et al. 2020 (英語)

SARS-CoV-2の不活化

市販品の場合、ウイルス調製物(組織培養液、1〜10×力価⁶ 1 × 10まで⁸ PFU/ml)を、製造元の使用説明書で推奨されている濃度と接触時間(利用可能な場合)、または試験所が特に要求した濃度と時間で、試薬を使用して三重に処理しました。メーカーが濃度の範囲を指定した場合、サンプルに対する製品の最も低い比率がテストされました(つまり、テスト製品の推奨濃度が最も低い)。検体輸送チューブ試薬は、サンプル液と試薬の体積比がメーカーによって指定されていない限り、1容量の組織培養液と10容量の試薬の比率を使用して試験されました。洗剤、固定剤、溶剤を、指示された濃度で指示された時間試験しました。すべての不活化ステップは、室温(18〜25°C)で実行しました。代替サンプルタイプの試験では、ウイルスを指定されたサンプルマトリックスに1:9の比率でスパイクし、上記のように試験試薬で処理しました。すべての実験には、試験試薬の代わりに同量のPBSを用いたトリプリケートコントロール模擬サンプルが含まれていました。必要な接触時間の直後に、適切に選択されたろ過マトリックスを使用して、処理されたサンプル1mLを処理しました。不活化試験のための試薬除去は、Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns(Thermo Fisher)を使用してより大きなスピンカラム形式で行うか、空のPierce 10 mL容量遠心分離カラム(Thermo Fisher)にSM2 Bio-Beads、Sephacryl S-400HR、またはSephadex LH-20を充填して4mLの充填ビーズ/樹脂を得ることによって行いました。アミコンフィルターを用いた精製では、2個×500μlのサンプルを2枚の遠心フィルターを用いて前述の方法で精製し、プールしました。グルタルアルデヒドを除去したホルムアルデヒドおよびホルムアルデヒドの場合、1つのフィルターを1× 500μlのサンプル容量で使用し、500μlのPBSで処理した後に再懸濁し、400ul MEM/5�Sに添加しました。感染者の不活化に 単層, 12.5 cm² Vero E6細胞のフラスコ(2.5 × 10⁶ 2.5 mL MEM/5% FBS)中の細胞/フラスコをMOI 0.001で感染させ、37°C/5% COでインキュベートしました。₂ 24時間。上清を除去し、5mLのホルムアルデヒド、またはホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドを使用して室温で15分または60分間細胞を固定しました。固定剤を除去し、単層をPBSで3回洗浄した後、細胞を1mLのMEM / 5�Sに掻き取り、超音波処理(3×10秒オン、100%の電力と振幅で10秒オフ)UP200Stを使用してVialTweeterアタッチメント(ヒールシャー超音波技術)を使用して。上清は、3000 × gで10分間遠心分離することにより清澄化しました。

超音波によるSARS-CoV-2コロナウイルスの不活性化に使用された試薬の詳細 VialTweeter Welchらによるプロトコルによる 2020年

Hielscher VialTweeterの使用を含む完全なプロトコルは、ここにあります。
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

洗練された超音波記憶装置と細胞破壊器

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