超音波処理によるSARS-CoV-2コロナウイルス不活化のプロトコル

Hielscher VialTweeterは、コロナウイルスSARS-COV-2の不活化に使用される独自の超音波マルチサンプル調製装置です。VialTweeterは最大10本のサンプルバイアルを同時に調製できるため、大量のサンプル処理に理想的な装置です。

VialTweeterによるSARS-CoV-2コロナウイルスの不活化

固定液を除去した後、単層培養細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で三回洗浄してから、細胞を掻き取って1mL MEM/5% FBSに回収し、超音波処理（3 × 10秒間オン、10秒間オフ、出力と振幅はともに100%）を、Hielscherの超音波プロセッサー UP200StとVialTweeter アタッチメントを用いて実施した。上清は3000 × gで10分間遠心分離して清澄化した。Welch et al. (2020)によるSARS-CoV-2コロナウイルス不活化の完全なプロトコルを以下でご覧ください：

細胞とウイルス

Vero E6細胞（Vero C1008; ATCC CRL-1586）は、10% (v/v)のウシ胎仔血清（FCS）を添加した改変Eagle最小必須培地（MEM）で培養した。使用したウイルスはSARS-CoV-2株hCOV-19/England/2/2020で、29/01/2020に英国で最初に発生した患者クラスターからPHEが分離したものである。このウイルスを継代1代目で入手し、継代2代目または3代目で不活化試験に使用した。
SARS-CoV-2の不活化に使用した試薬と化学物質、および試薬の細胞毒性の除去については、Welch et al. (2020)の科学報告を参照してください。

界面活性剤によるウイルス不活化 – Welch et al. 2020によるSARS-CoV-2コロナウイルス不活化プロトコル

SARS-CoV-2の不活化


市販製品については、ウイルス調製液（組織培養液、力価の範囲は1 × 10⁶ – 1 × 10⁸ PFU/ml）を試薬で処理し、各条件で三反復を実施した。濃度と接触時間は、製造者の使用説明書が入手可能な場合はそこで推奨されている条件とし、または試験機関が具体的に指定した条件とした。製造者が濃度範囲を示している場合は、製品とサンプルの比率が最も低い条件（すなわち、試験製品の推奨最低濃度）を試験した。検体輸送チューブの試薬は、製造者がサンプル液と試薬の体積比を指定していない限り、組織培養液一容量に対して試薬十容量の比率で試験した。界面活性剤、固定液および溶媒は、指定された濃度と時間で試験した。すべての不活化工程は室温（18 – 25°C）で実施した。別のサンプル種を試験する場合は、指定されたサンプルマトリックスにウイルスを1:9の比率で添加し、上記と同様に試験試薬で処理した。すべての実験に、試験試薬の代わりに同量のPBSを用いた模擬処理対照サンプルを三反復で含めた。必要な接触時間が経過した直後に、処理済みサンプル1mLを、適切に選択したろ過マトリックスで処理した。不活化試験のための試薬除去は、より大型のスピンカラム形式で行い、Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns（Thermo Fisher）を使用するか、容量10mLの空のPierce遠心カラム（Thermo Fisher）にSM2 Bio-Beads、Sephacryl S-400HRまたはSephadex LH-20を充填し、充填ビーズ／樹脂の体積を4mLとした。Amiconフィルターを用いた精製では、先に記載した方法により二つの遠心フィルターを用いて2 × 500μlのサンプルを精製し、その後合わせた。ホルムアルデヒド、およびホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドの除去では、1× 500μlのサンプルに対して一つのフィルターを使用し、処理後のサンプルを500μl PBSに再懸濁して、400ul MEM/5% FBSに添加した。感染した 単層培養細胞を不活化するため、12.5 cm² フラスコ内のVero E6細胞（2.5 × 10⁶ cells/flask、2.5mL MEM/5% FBS中）にMOI 0.001で感染させ、37°C/5% CO₂ で24時間インキュベートした。上清を除去し、5mLのホルムアルデヒド、またはホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドを用いて、室温で15分間または60分間、細胞を固定した。固定液を除去し、単層培養細胞をPBSで三回洗浄してから、細胞を掻き取って1mL MEM/5% FBSに回収し、VialTweeterアタッチメントを装着したUP200St（Hielscher Ultrasound Technology）を用いて超音波処理した（3 × 10秒間オン、10秒間オフ、出力と振幅はともに100%）。上清は3000 × gで10分間遠心分離して清澄化した。


Welch et al. 2020のプロトコルに従い、超音波装置VialTweeterによるSARS-CoV-2コロナウイルスの不活化に使用した試薬の詳細

Hielscher VialTweeterの使用を含む完全なプロトコルはこちらでご覧いただけます：
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

高度な超音波破砕装置と細胞破砕装置

マルチサンプル超音波処理装置VialTweeterは、生物学、生化学および臨床の研究室で行うサンプル調製に向けた、多数の超音波ソリューションの一つです。Hielscher Ultrasonicsは、細胞溶解、細胞抽出、組織の均質化、細胞溶解液の可溶化、溶解、サンプルの脱気など、お客様の用途に理想的な超音波破砕装置を提供します。
毎時および毎日の処理が必要なサンプル数、直接超音波処理と間接超音波処理のどちらをご希望か、そしてサンプルの超音波処理の目的をお知らせください。日々の業務に最適な超音波装置をご提案します！
Hielscher Ultrasonicsのデジタル超音波プロセッサーは、スマートソフトウェア、自動データ記録、温度制御・超音波処理時間・サイクル／パルスモードを簡単に事前設定できる機能に加え、サンプル照明とブラウザーによる遠隔操作機能を備えています。お客様の研究や日々の業務を可能な限り便利にし、最大限の成果につなげられるよう、当社は超音波装置を可能な限りスマートにすることに努めています。
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