超音波処理によるSARS-CoV-2コロナウイルス不活性化のためのプロトコル

VIAを用いてSARS-CoV-2コロナウイルスを非活性化

After removing the fixative, monolayers were washed three times with phosphate-buffered saline (PBS) before scraping cells into 1mL MEM/5% FBS and sonicated (3 × 10 second on, 10 seconds off at 100% power and amplitude) using the Hielscher ultrasonic processor VIAlTweeterを使用したUP200St 添付 ファイル。上清は、10分間3000×gの遠心分離機で明らかにした。

以下のWelchらによるSARS-CoV-2コロナウイルスの不活性化に関する完全なプロトコルをここで読んでください。

細胞とウイルス

ベロ E6 細胞 (ベロ C1008;ATCC CRL-1586)は、10%(v/v)胎児子牛血清(FCS)を添加した修飾イーグルの最小必須培地(MEM)で培養した。使用されたウイルスは、2020年29月1日に英国で最初の患者クラスターからPHEによって分離された、SARS-CoV-2株hCOV-19/イングランド/2020であった。このウイルスは、継代1で得られ、継代2又は3の不活性化試験に用いた。
SARS-CoV-2不活性化に使用される試薬および化学物質、ならびに試薬細胞毒性の除去については、Welchらの科学的報告を参照してください(2020)。

洗剤によるウイルス不活性化 – SARS-CoV-2 ウェルチらによるコロナウイルス不活性化プロトコル 2020

SARS-CoV-2 の無効化

市販品の場合、ウイルス製剤(組織培養液、1×10から及ぶタンター)⁶ 1 × 10⁸ PFU/ml) were treated in triplicate with reagents at concentrations and for contact times recommended in the manufacturers’ instructions for use, where available, or for concentrations and times specifically requested by testing laboratories. Where a range of concentrations was given by the manufacturer, the lowest ratio of product to sample was tested (i.e. lowest recommended concentration of test product). Specimen transport tube reagents were tested using a ratio of one volume of tissue culture fluid to ten volumes of reagent, unless a volume ratio of sample fluid to reagent was specified by the manufacturer. Detergents, fixatives and solvents were tested at the indicated concentrations for the indicated times. All inactivation steps were performed at ambient room temperature (18 – 25°C). For testing of alternative sample types, virus was spiked into the indicated sample matrix at a ratio of 1:9, then treated with test reagents as above. All experiments included triplicate control mock-treated samples with an equivalent volume of PBS in place of test reagent. Immediately following the required contact time, 1mL of treated sample was processed using the appropriately selected filtration matrix. Reagent removal for inactivation testing was carried out in a larger spin column format using Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), or by filling empty Pierce 10mL capacity centrifuge columns (Thermo Fisher) with SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR or Sephadex LH-20 to give 4mL packed beads/resin. For purification using Amicon filters, 2 × 500μl samples were purified using two centrifugal filters by the method previously described, then pooled together. For formaldehyde and formaldehyde with glutaraldehyde removal, one filter was used with 1× 500μl sample volume, resuspended after processing in 500μl PBS, and added to 400ul MEM/5% FBS. For inactivation of infected モノレイヤー、12.5 cm² ベロE6細胞のフラスコ(2.5×10⁶ cells/flask in 2.5mL MEM/5% FBS) were infected at MOI 0.001 and incubated at 37°C/5% CO₂ for 24 hours. Supernatant was removed, and cells fixed using 5mL of formaldehyde, or formaldehyde and glutaraldehyde at room temperature for 15 or 60 mins. The fixative was removed, and monolayers washed three times with PBS before scraping cells into 1mL MEM/5% FBS and sonicated (3 × 10 second on, 10 seconds off at 100% power and amplitude) using a UP200St with VialTweeter attachment (Hielscher Ultrasound Technology). Supernatants were clarified by centrifuging at 3000 × g for 10 mins.


SarS-CoV-2 コロナウイルスの超音波 VialTweeter によるプロトコルに従って使用される試薬の詳細 2020

ヒールシャー VialTweeter の使用を含む完全なプロトコルは、ここで見つけることができます。
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

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