ELISAアッセイのための超音波サンプル前処理

ELISAなどのアッセイは、体外診断、疾患関連タンパク質の検出、品質管理（食品アレルゲンの監視など）に広く用いられています。超音波サンプル前処理は、細胞を溶解し、細胞内のタンパク質、DNA、RNA、細胞小器官を単離するための迅速で信頼性が高く、再現性のある技術です。Hielscher Ultrasonicsは、単一サンプル、複数のバイアル、マイクロタイタープレート、96ウェルプレートを容易に前処理するための各種超音波ソリューションを提供しています。

ELISA – 酵素結合免疫吸着測定法

ELISAは酵素結合免疫吸着測定法の略称で、リガンド結合アッセイに分類される、広く用いられている生化学分析技術です。ELISAでは、特定の結合特性を持つ固定された固相に液体サンプルを添加します。通常、この固相はウェルプレートまたはELISAプレートのコーティングとして施されます。その後、各種液体試薬の添加、インキュベーション、洗浄を順に行うことで、最終的にウェル内の液体に光学的変化（酵素反応の生成物による発色など）が生じます。この光学的変化により、いわゆる定量的な「読み取り」で分析対象物の量を測定できます。定量的な読み取りには、分光光度計、蛍光光度計、発光測定器を用い、透過光の強度を検出して測定します。検出感度は、分析反応中の信号増幅の影響を受けます。酵素反応は十分に研究されており、信頼性の高い増幅プロセスであるため、信号の生成に酵素が用いられます。正確な定量を可能にするため、酵素は一定の比率で検出試薬に結合されています。これが「酵素結合」免疫吸着測定法という名称の由来でもあります。
ELISAアッセイはマイクロタイタープレート / 96ウェルプレートで実施されるため、プレートを用いたアッセイ技術として知られています。臨床体外診断、研究、医薬品開発などで、抗体、ペプチド、タンパク質、ホルモンの検出と定量に用いられます。
ELISA技術は、医学、バイオテクノロジー、植物病理学で診断ツールとして頻繁に用いられ、多くの産業でも重要な品質管理測定法となっています。

ELISA前の超音波サンプル前処理

ELISAアッセイを実施する前に、サンプルには細胞溶解や細胞内のタンパク質、DNA、RNAなどの抽出といった前処理工程が必要です。超音波による細胞溶解とタンパク質単離の利点は、その高い効率、信頼性、再現性にあります。これらはいずれも、高品質な診断結果と研究結果を得るために重要な要素です

ELISA前の超音波細胞溶解プロトコル

• 培養細胞の場合： 超音波細胞溶解の前に、マイクロ遠心機で細胞を270 x gで5分間遠心分離します。上清を吸引して除去し、細胞を30 – 100 μLのRIPAバッファーに再懸濁します。その後、細胞ペレットを氷上で30分間インキュベートします。
• これで細胞サンプルの超音波溶解の準備が整いました：
  前処理するサンプル数に応じて、プローブ型超音波処理装置（例： UP200Ht とS26d2プローブの組み合わせ）または超音波マルチサンプル装置（最大10本のバイアルを同時に超音波処理するVialTweeter、あるいはマイクロタイタープレート / 96ウェルプレート用のUIP400MPTなど）を使用します。
  単一サンプルをプローブ型装置で超音波処理する場合は、細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。
• 超音波処理装置のデジタルメニューで、超音波処理時間、総エネルギー投入量、サイクルモード、および／または温度制限をあらかじめ設定します。これにより、信頼性が非常に高い超音波処理と反復性が確保されます。
• ソノトロードを挿入し、超音波装置の電源を入れます。サンプルを均一に超音波処理するため、超音波プローブのマイクロチップをサンプル内でゆっくり動かします。
  ほとんどの細胞では、10秒間の超音波処理を2–4サイクル行うと超音波溶解が完了します。
• 超音波処理後、ソノトロードをサンプルから取り出します。サンプルは氷上で5分間インキュベートしてください。その後、10,000 x gで20分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化します。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。分析対象物にラベルを付け、-20°Cで保存します。
• 超音波ソノトロードは、アルコールで適切に拭くか、70%エタノールなどのアルコールを満たしたビーカー内で超音波処理することで洗浄できます。チタン製の超音波プローブはすべてオートクレーブ滅菌が可能です。

• 氷冷したPBS（0.01M, pH=7.4）で組織をすすぎ、余分な溶血した血液を十分に除去します。
• 組織（腎臓、心臓、肺、脾臓など）の重量を測定し、細かくほぐしてPBS中でホモジナイズします。必要なPBSの量は、組織の重量に応じて決まります。目安として、1gの組織に約9mLのPBSが必要です。PBSにプロテアーゼ阻害剤を添加することを推奨します。（代わりに、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤のカクテルを含むRIPAまたは低張溶解バッファーを使用することもできます。）
• 組織の大きさによっては、短時間のボルテックス処理（15秒のパルスで約1–2分間）が組織の前処理に役立つ場合があります。
• S26d2などのマイクロチップを超音波処理装置に取り付けます。組織を入れたサンプルチューブを氷浴に置きます。
• UP200St（振幅80%）などの超音波処理装置を使用して、パルスモード（15秒作動、15秒休止）でサンプルを1分間超音波処理します。サンプルは氷浴中に保持します。
• その後、分析用のタンパク質を濃縮するため、ホモジネートを遠心分離して特定の画分（細胞質ゾル、核、ミトコンドリア、またはリソソーム）を得ます。サンプルを5000×gで5分間遠心分離し、上清を回収します。

超音波処理中の信頼性の高い温度制御

温度はプロセスに影響を与える重要な要因であり、タンパク質の熱分解を防ぐなど、生体サンプルの処理において特に重要です。すべての機械的サンプル前処理技術と同様に、超音波処理も熱を発生させます。しかし、Hielscher Ultrasonicsの装置を使用すれば、サンプルの温度を適切に制御できます。プローブ型超音波処理装置またはVialTweeterを用いて分析前の前処理を行う際に、サンプルの温度を監視し、制御するためのさまざまな方法をご紹介します。

1. サンプル温度の監視：Hielscherのすべてのデジタル超音波プロセッサーには、インテリジェントソフトウェアと着脱式温度センサーが搭載されています。温度センサーを超音波装置（例： UP200Ht, UP200St, VialTweeter, マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTP）に接続し、温度センサーの先端をいずれかのサンプルチューブに挿入します。デジタルカラータッチディスプレイを介して、超音波プロセッサーのメニューでサンプルの超音波処理に用いる特定の温度範囲を設定できます。最高温度に達すると超音波処理装置は自動的に停止し、サンプル温度が設定温度∆の下限値まで下がるまで休止します。その後、超音波処理が自動的に再開します。このインテリジェントな機能により、熱による分解を防ぎます。
2. 超音波マルチサンプル装置VialTweeterでは、サンプルチューブを保持するチタンブロックを予冷できます。VialTweeterのブロック（トランスデューサーを除いたソノトロードのみ！）を冷蔵庫または冷凍庫に入れてチタンブロックを予冷すると、サンプルの温度上昇を遅らせることができます。可能であれば、サンプル自体も予冷できます。
3. 超音波処理中の冷却には、氷浴またはドライアイスを使用します。超音波処理中はサンプルチューブを氷浴に置きます。VialTweeterの場合は、浅いトレイにドライアイスを入れ、その上にVialTweeterを置くことで、熱を速やかに放散させることができます。

世界中のお客様が、生物学、生化学、医学、臨床の各研究室における日常的なサンプル前処理に、Hielscherのプローブ型超音波処理装置およびマルチサンプル超音波処理装置VialTweeterとUIP400MTPを使用しています。Hielscherプロセッサーのインテリジェントソフトウェアと温度制御により、温度が確実に制御され、熱によるサンプルの分解を防ぎます。Hielscherの超音波ソリューションによる超音波サンプル前処理は、信頼性が非常に高く、再現性のある結果をもたらします！
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