ELISAアッセイ用超音波サンプル前処理

ELISAなどの測定法は、体外診断、疾患関連タンパク質の検出、品質管理（食物アレルゲンのモニタリングなど）に広く用いられています。超音波によるサンプル前処理は、細胞を溶解し、細胞内タンパク質、DNA、RNA、細胞小器官を単離するための、迅速、信頼性、再現性の高い技術です。Hielscher Ultrasonics社は、マイクロタイタープレートや96ウェルプレートだけでなく、単一サンプル、複数バイアルサンプルの簡便な調製のための様々な超音波ソリューションを提供しています。

ELISA法 – 酵素結合免疫吸着測定法

ELISAは酵素結合免疫吸着分析法（enzyme-linked immunosorbent assay）の略で、リガンド結合アッセイのカテゴリーに属する生化学的分析法として広く用いられている。ELISAでは、液体サンプルを特殊な結合特性を持つ固定固相上に添加する。通常、固定固相はウェルプレートやELISAプレートにコーティングされる。その後、様々な液体試薬が順次添加され、インキュベート、洗浄され、最終的にウェル内の最終液体に光学的変化（例えば、酵素反応産物による発色）が生じる。この光学的変化により、分析物の量をいわゆる定量的に測定することができる。 “読み」である。定量測定では、分光光度計、蛍光光度計、ルミノメーターを用いて透過光の強度を検出・測定する。検出感度は、分析反応中のシグナルの増幅に影響される。酵素反応はよく研究された信頼性の高い増幅プロセスであるため、シグナルを作り出すために酵素が使用される。正確な定量を可能にするため、酵素は検出試薬と一定の割合で結合される。
ELISAアッセイはマイクロタイタープレート/96ウェルプレートで行われるため、プレートベースアッセイ技術として知られ、抗体、ペプチド、タンパク質、ホルモンの検出や定量に臨床体外診断、研究、医薬品開発などで使用されています。
ELISA技術は、医学、バイオテクノロジー、植物病理学の診断ツールとして頻繁に使用され、また、様々な産業において重要な品質管理測定でもある。

ELISA前の超音波サンプル前処理

ELISAアッセイを実施する前に、サンプルは細胞溶解や細胞内タンパク質、DNA、RNAなどの抽出などの準備段階を必要とする。超音波による細胞溶解とタンパク質分離の利点は、その高い効率性、信頼性、再現性にあります。これらの要素はすべて、高品質の診断や研究結果を得るために重要である。

プレELISA超音波細胞溶解プロトコール

• 細胞培養用： 超音波細胞溶解の前に、細胞を微量遠心機で270 x gで5分間遠心する。上清を吸引除去し、細胞を30～100μLのRIPAバッファーに懸濁する。その後、細胞ペレットを氷上で30分間インキュベートする。
• これで、細胞サンプルは超音波溶解の準備ができた：
  プローブタイプの超音波発生器（例． UP200Ht S26d2プローブ付き）、または超音波マルチサンプル装置（最大10本のバイアルを同時に超音波処理するVialTweeterやマイクロタイタープレート/96ウェルプレート用のUIP400MPTなど）を、調製するサンプル量に応じて選択できます。
  単一サンプルのプローブ型超音波処理では、細胞を1.5mLの微量遠心チューブに入れる。
• 超音波持続時間、総エネルギー入力、サイクルモード、温度リミットを超音波発生器のデジタルメニューで事前に設定します。これにより、信頼性の高い超音波処理と再現性が保証されます。
• ソノトロードをセットし、超音波装置のスイッチを入れる。超音波プローブのマイクロチップを試料中でゆっくりと動かし、試料を均一に超音波処理する。
  ほとんどの細胞では、10秒間の超音波処理を2～4回繰り返すと、超音波溶解が完了する。
• 超音波処理後、試料からソノトロードを外す。サンプルを氷上で5分間インキュベートする。その後、10,000×gで20分間遠心し、残渣をペレット化する。上清を新しい微量遠心チューブに移す。分析物にラベルを付け、-20℃で保存する。
• 超音波ソノトロードは、アルコールで適切に拭き取るか、70％エタノールなどのアルコールを入れたビーカーで超音波洗浄することができる。チタン製の超音波プローブはすべてオートクレーブ可能です。

• 氷冷したPBS（0.01M、pH=7.4）で組織をすすぎ、余分な溶血を十分に取り除く。
• 組織（腎臓、心臓、肺、脾臓など）の重量を量り、細かく砕いてPBS中でホモジナイズする。必要なPBSの量は組織の重量に関係する。目安としては、1gの組織に約9mLのPBSが必要である。PBSにプロテアーゼ阻害剤を加えることを推奨する。(プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤のカクテルを含むRIPAまたは低張溶解バッファーでも代用できる）。
• 組織の大きさにもよるが、短いボルテックス処理（15秒パルスで約1～2分）は、組織を前処理するのに有効である。
• マイクロチップ（S26d2など）を超音波発生器に取り付ける。組織の入ったサンプルチューブを氷浴に入れる。
• お手持ちの超音波発生装置（例：UP200St（振幅80%））を使用し、パルスモード（15秒オン、15秒休止）で1分間、試料を超音波処理する。試料を氷浴中で静置する。
• その後、ホモジネートを遠心分離し、特定のプール（細胞質、核、ミトコンドリア、またはリソソーム）を得て、分析用のタンパク質を濃縮する。サンプルを5000×gで5分間遠心し、上清を回収する。

ソニケーション中の確実な温度制御

温度は、タンパク質の熱分解を防ぐなど、生物学的サンプルの処理に特に重要なプロセス影響因子です。すべての機械的サンプル前処理技術と同様に、超音波処理も熱を発生させます。しかし、Hielscher Ultrasonicsの装置を使用すれば、サンプルの温度を適切にコントロールすることができます。弊社では、プローブ型超音波プローブやVialTweeterを使用した分析前の試料調製時に、試料の温度をモニター・コントロールする様々なオプションをご用意しています。

1. サンプル温度のモニタリングすべてのHielscherデジタル超音波プロセッサーは、インテリジェントなソフトウェアとプラグイン可能な温度センサーを備えています。温度センサーを超音波装置（例． UP200Ht, UP200St, バイアルツイーター, マルチウェルプレートソニケーター UIP400MTP温度センサーの先端をサンプルチューブに挿入します。デジタルカラータッチディスプレイにより、超音波プロセッサーのメニューで、サンプルの超音波処理に必要な特定の温度範囲を設定することができます。超音波処理装置は、最高温度に達すると自動的に停止し、サンプル温度が設定温度∆の下限値まで下がるまで一時停止します。その後、超音波処理を自動的に再開します。このスマートな機能により、熱による劣化を防ぐことができます。
2. 超音波マルチサンプルユニットVialTweeterについては、サンプルチューブを保持するチタンブロックを予冷することができます。VialTweeterブロック（トランスデューサのないソノトロードのみ！）を冷蔵庫または冷凍庫に入れ、チタンブロックを予冷することで、サンプルの温度上昇を遅らせることができます。可能であれば、サンプル自体も予冷することができます。
3. 超音波処理中の冷却には、アイスバスまたはドライアイスを使用します。超音波処理中のサンプルチューブをアイスバスに入れます。VialTweeterの場合は、ドライアイスを入れた浅いトレイを使用し、VialTweeterをドライアイスの上に置いて、熱が急速に放散するようにします。

世界中のお客様が、生物学、生化学、医学、臨床検査室での毎日のサンプル前処理作業に、Hielscher社のプローブ型超音波処理装置、マルチサンプル超音波処理装置VialTweeterおよびUIP400MTPを使用しています。Hielscher社製プロセッサーのインテリジェントなソフトウェアと温度制御により、温度は確実に制御され、熱によるサンプルの劣化は回避されます。Hielscherの超音波ソリューションによる超音波サンプル前処理は、高い信頼性と再現性のある結果を提供します！
マルチウェルプレートソニケーターUIP400MTPを使用したハイスループット超音波処理について詳しくはこちらをご覧ください！