次世代シーケンシングのための超音波DNAフラグメンテーション

次世代シーケンシング（NGS）では、ゲノムDNA鎖の塩基配列を決定し、ゲノムライブラリーを作成するために、ゲノムDNAの確実なせん断と断片化が必要です。DNAをDNA断片に制御して断片化することは、DNAの塩基配列を決定する前に必要不可欠なサンプル前処理工程である。超音波処理は、一定の長さのDNA断片化において効率的で信頼性の高い技術であることが証明されている。超音波DNA断片化プロトコルは、再現性のある断片化結果を達成します。Hielscher社の超音波破砕機は、操作パラメーターによって正確に制御可能な、幅広いゲノムDNA断片サイズ分布を生成することができる。Hielscherの超音波DNAシアリングシステムは、マイクロプレートだけでなく、シングルバイアルやマルチバイアルにも対応しているため、サンプル調製が非常に効率的になります。

次世代シーケンサーライブラリー調製のための超音波DNAフラグメンテーション

次世代シーケンシングを行うためには、(1)ライブラリー調製、(2)シーケンス、(3)データ解析の3つの基本ステップを行う必要がある。ライブラリー調製では、DNAを断片化し、アデニン塩基を1つ加えることで断片末端を修復（ポリッシュ）し、標的断片を二本鎖DNAに変換する。最後に、いわゆるアダプターがライゲーション、PCR、またはタグメンテーションによって取り付けられ、最終的なライブラリーDNA産物がシーケンス用に定量できるようになる。
超音波によるDNA断片化： 特に、イルミナのようなショートリードシーケンス技術では、長いDNA断片を容易に読み取ることができないため、DNAスタンドは超音波処理によって確実に達成できる一定のサイズに断片化されなければならない。
超音波処理は、DNA、RNA、クロマチンの断片化に確実に使用できる。

次世代シーケンサー – 図書館準備

超音波DNA断片化は、次世代シーケンシング（NGS）プラットフォーム用のDNAシーケンシング・ライブラリーの調製において一般的に採用されている。この技術は、DNA分子を所望のサイズ範囲の小さな断片に分断するために利用され、ライブラリー調製の後続ステップを容易にする。超音波DNAフラグメンテーションは通常、NGSワークフローのライブラリー調製ステップで必要とされ、ゲノムDNAを下流の処理やシーケンスに適した小さな断片に断片化する。超音波DNA断片化は、使用する特定のシーケンスプラットフォームに適したサイズのDNA断片を生成することで、シーケンス実験の成功を確実にする上で重要な役割を果たします。

次世代シーケンス – プロセスのステップ

• 超音波によるDNA断片化： ライブラリーを構築する前に、ゲノムDNAはより小さく扱いやすい断片に断片化される。超音波フラグメンテーションでは、高周波の音波を使ってDNA分子をせん断し、目的のサイズの断片にする。このステップは、後に生成されるシーケンスリードが、使用するシーケンスプラットフォームにとって適切な長さになるようにするために非常に重要である。断片のサイズ範囲は、シーケンス実験の特定の要件に基づいて調整することができます。
• PCRによるクローン性増幅： 超音波断片化後、DNA断片は末端修復、アダプターライゲーション、PCR増幅を経て、最終的なDNAシーケンスライブラリーが生成される。これらのステップにより、断片化されたDNA分子は、シーケンスプラットフォームへの結合に必要なアダプター配列を付加し、PCR増幅のためのプライミング部位を提供することで、シーケンスプロセスの準備が整う。
• 合成によるDNA配列決定： シーケンスライブラリーが調製されると、合成によるDNAシーケンス（SBS）プロセスが開始される。SBSの間、DNA配列は相補鎖へのヌクレオチドの逐次付加によって決定される。このステップでは、ヌクレオチドの取り込み、イメージング、切断の反応を繰り返し行い、取り込まれたヌクレオチドが発する蛍光シグナルに基づいてDNA配列を決定する。
• 超並列シーケンス： 最終段階では、空間的に分離された増幅DNAテンプレートが、超並列方式で同時に配列決定される。この高スループットシーケンスアプローチにより、1回のシーケンス実行で数百万から数十億のシーケンスリードの生成が可能となり、DNA配列の効率的かつ迅速な決定が可能となる。

超音波DNA断片化はどのように機能するのか？

超音波処理（音響サンプル処理としても知られる）は、DNAを断片化するために広く用いられている方法である。超音波DNAせん断法では、試料は制御された条件下で超音波に曝される。超音波DNA断片化の原理は、超音波によって発生する振動とキャビテーションに基づいています。超音波（音響）キャビテーションから生じるせん断力は、高分子量のDNA分子を切断する。超音波処理の強度（振幅、持続時間）、脈動モード、温度などの設定により、DNA断片をある目的の長さまで正確に断片化することができる。超音波処理によりDNAは100～600bpに短縮されることが多いが、より穏やかな超音波条件を適用すると、1300bpまで長いDNA断片を得ることができる。

DNAの劣化を防ぐ温度管理

DNAの二本鎖の分子形状は、高温に対して非常に敏感であるため、サンプル調製工程における温度の正確な制御は、信頼性の高い分析結果を得るために極めて重要な要素である。
ヒールシャーのプローブ型超音波振動子、VialTweeter、UIP400MTPのいずれを使用している場合でも、超音波振動子、VialTweeter、UIP400MTPのいずれかを使用することができます。 – プラグイン可能な温度センサーとスマートデバイスソフトウェアにより、継続的な温度監視と制御が保証されます。温度を一定の範囲内に保つために、上限温度と下限温度を設定することができます。その結果、この温度制限を超えると超音波振動子は一時停止し、設定した∆Tだけ温度が下がると自動的に超音波振動を継続します。
Hielscher社製超音波処理装置の洗練されたソフトウェアは、理想的な試料処理条件の確実な維持を保証します。

UIP400MTPマルチウェルプレート超音波処理装置による大量サンプルDNAフラグメンテーション

ライフサイエンスにおけるサンプル数は、過去10年間に著しく増加した。これは、比較可能で有効な結果を得るためには、サンプル前処理および分析において、非常に多くのサンプル（例えば、マイクロプレートあたり384、1536、または3456ウェル）を一貫して同じ条件で処理しなければならないことを意味します。UIP400MTP により、Hielscher Ultrasonics 社は大量サンプル処理のトレンドに対応します。UIP400MTPはマイクロプレートを使用したサンプル前処理用の超音波処理装置です。UIP400MTPは6、12、24、48、96、384、1536、3456ウェルのプレートを処理できます。マイクロプレートの種類にもよりますが、各ウェルには通常、数十ナノリットルから数ミリリットルのサンプル量を保持できます。ライフサイエンス研究で広く使用されているUIP400MTPは、ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）やPCRなどのアッセイ前のサンプル前処理、タンパク質分析前のサンプル前処理、CHiPやCHiP-seq、ヒストン修飾同定、その他の分析処理（ゲル電気泳動、質量分析など）前のクロマチン前処理に非常によく使用されています。
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最大10本のバイアル瓶のサンプル分取用VialTweeter

VialTweeterは、最大10本のバイアルを同時に効果的かつ快適に超音波処理できる、広く使用されているラボ用超音波処理装置VialTweeterです。バイアルと試験管（エッペンドルフバイアル、クライオバイアル、遠心チューブなど）は間接的に超音波処理されるため、あらゆるクロスコンタミネーションが回避されます。同じ超音波強度が各試料に照射されるため、すべての超音波処理結果は均一で再現性があります。VialTweeterは、当社の他のデジタル機器と同様に、すべてのスマート機能（スマートメニュー、プログラム可能な設定、温度制御、リモートコントロールなど）を備えているため、最高の使い心地が保証されます。

マイクロウェルプレート用マルチフィンガープローブ

超音波プローブホモジナイザーUP200HtおよびUP200Stに使用できる4本または8本のフィンガーを持つマルチフィンガープローブは、複数のサンプルを同じ条件で同時に超音波処理するための快適なオプションです。例えば、ソノトロードMTP-24-8-96は8フィンガープローブで、自動化システムへの組み込みや、マルチウェルプレートのウェルの効率的な手動試料調製に最適です。マルチフィンガーソノトロードは、標準的な超音波ソノトロードを使用してビーカーや試験管を処理するラボの自動化に最適です。マルチフィンガープローブと標準プローブは数分で交換でき、シングルプローブ超音波破砕機がマルチプローブ超音波破砕機に早変わりします。

DNA断片化用ヒールシャー超音波装置

Hielscher Ultrasonics社は、DNA、RNA、クロマチン断片化のための様々な超音波ベースのプラットフォームを提供しています。これらの様々なプラットフォームには、超音波プローブ（ソノトロード）、複数のチューブやマルチウェルプレート（96ウェルプレート、マイクロタイタープレートなど）を同時にサンプル調製するための間接超音波処理ソリューション、ソノリアクター、超音波カップホーンなどがあります。DNAシアリング用のプラットフォームはすべて、周波数チューニングされた高性能超音波プロセッサーを搭載しており、精密に制御可能で、再現性の高い結果をもたらします。

あらゆるサンプル数とサイズに対応する超音波プロセッサー

Hielscher社のマルチサンプル超音波破砕装置VialTweeter（最大10本の試験管用）とUIP400MTP（マイクロプレート/マルチウェルプレート用）を使用すると、目的のDNA断片サイズ分布と収量を得ながら、強力で正確に制御可能な超音波処理によりサンプル処理時間を短縮することが容易になります。超音波DNAフラグメンテーションは、サンプル調製を効率的で、信頼性が高く、スケーラブルにします。常に制御された超音波を適用することで、1サンプルから多数のサンプルまで、プロトコルをリニアにスケールアップすることができます。
1本から5本のフィンガーを持つプローブ超音波装置は、より少ないサンプル数の試料作製に最適です。Hielscher社のラボ用超音波発生装置は様々なサイズを取り揃えており、お客様の用途やご要望に最適な装置をご提案いたします。

精密なプロセス制御

超音波処理を徹底的に行うと、DNA、RNA、クロマチンが破壊される可能性があり、超音波剪断が不十分だと、DNAやクロマチンの断片が長くなりすぎるため、正確に制御可能な超音波処理設定は極めて重要である。Hielscher社のデジタル超音波装置は、正確な超音波処理パラメータを簡単に設定することができる。また、特定の超音波処理設定をプログラム設定として保存し、同じ手順を素早く繰り返すことができる。
すべての超音波処理は自動的にプロトコル化され、内蔵SDカードにCSVファイルとして保存されます。これにより、実施された試験が正確に記録され、超音波処理を簡単に修正することができます。
ブラウザー・リモート・コントロールにより、すべてのデジタル超音波発生器は、標準的なブラウザーで操作・監視することができます。LAN接続により非常にシンプルなプラグアンドプレイセットアップが可能なため、追加ソフトウェアのインストールは不要です。

超音波サンプル前処理における最高の使いやすさ

Hielscher社の超音波装置は、高性能な超音波を提供すると同時に、常に非常にユーザーフレンドリーで操作しやすいように設計されています。すべての設定はわかりやすいメニューで構成されており、カラータッチディスプレイやブラウザリモコンから簡単にアクセスできます。プログラム可能な設定と自動データ記録機能を備えたスマートなソフトウェアにより、最適な超音波処理設定が保証され、信頼性と再現性の高い結果が得られます。清潔で使いやすいメニューインターフェースにより、Hielscherの超音波装置はユーザーフレンドリーで効率的な装置となります。
下の表は、DNAやRNAの断片化、細胞溶解、タンパク質抽出などのサンプル前処理に理想的なラボ用超音波発生装置のおおよその処理能力を示しています：