次世代シーケンシングのための超音波DNA断片化

次世代シーケンシング（NGS）では、ゲノムDNA鎖の配列を決定し、ゲノムライブラリーを作成するために、ゲノムDNAを確実にせん断・断片化する必要があります。DNAを制御された条件でDNA断片に分割することは、DNAの配列決定前に必要なサンプル調製の必須ステップです。超音波処理は、DNAを特定の長さに断片化する効率的で信頼性の高い技術として実証されています。超音波DNA断片化プロトコルは、再現性のある断片化結果をもたらします。Hielscherの超音波処理装置は、さまざまなゲノムDNA断片サイズ分布を生成でき、その分布は動作パラメーターによって精密に制御できます。Hielscherの超音波DNAせん断システムは、単一および複数のバイアルだけでなく、マイクロプレートにも対応しているため、サンプル調製が非常に効率的になります。

次世代シーケンシング：ライブラリー調製のための超音波DNA断片化

次世代シーケンシングを実施するには、（1）ライブラリー調製、（2）シーケンシング、（3）データ解析という三つの基本ステップを行う必要があります。ライブラリー調製では、DNAを断片化し、次にアデニン塩基を一つ付加して断片末端を修復（平滑化）し、目的の断片を二本鎖DNAに変換します。最後に、ライゲーション、PCR、またはタグメンテーションによって、いわゆるアダプターを付加し、最終的なライブラリーDNA産物をシーケンシング用に定量できるようにします。
超音波処理によるDNA断片化： 特に、長いDNA断片を容易に読み取れないIlluminaなどのショートリードシーケンシング技術を使用する場合、DNA鎖を特定のサイズに断片化する必要があり、これは超音波処理によって確実に達成できます。
超音波処理は、DNA、RNA、クロマチンの断片化に信頼性高く使用できます。

次世代シーケンシング – ライブラリー調製

超音波DNA断片化は、次世代シーケンシング（NGS）プラットフォーム向けのDNAシーケンシングライブラリー調製で一般的に使用されています。この技術は、DNA分子を目的のサイズ範囲の小さな断片に分割するために用いられ、ライブラリー調製の後続ステップを容易にします。超音波DNA断片化は通常、NGSワークフローのライブラリー調製ステップで、ゲノムDNAを後続の処理およびシーケンシングに適した小さな断片に分割するために必要です。使用する特定のシーケンシングプラットフォームに適したサイズ範囲のDNA断片を生成することで、シーケンシング実験の成功を確実にするうえで重要な役割を果たします。

次世代シーケンシング – プロセスの各ステップ：

• 超音波DNA断片化： ライブラリー構築の前に、ゲノムDNAをより小さく、扱いやすい断片に分割します。超音波断片化では、高周波の音波を使用してDNA分子をせん断し、目的のサイズ範囲の断片にします。このステップは、後で生成されるシーケンシングリードが、使用するシーケンシングプラットフォームに適した長さになるようにするため、非常に重要です。断片のサイズ範囲は、シーケンシング実験の具体的な要件に基づいて調整できます。
• PCRによるクローン増幅： 超音波断片化の後、DNA断片に末端修復、アダプターライゲーション、PCR増幅を行い、最終的なDNAシーケンシングライブラリーを生成します。これらのステップでは、シーケンシングプラットフォームへの結合に必要なアダプター配列を付加し、PCR増幅のためのプライミング部位を設けることで、断片化されたDNA分子をシーケンシングプロセスに向けて調製します。
• 合成によるDNAシーケンシング： シーケンシングライブラリーの調製が完了すると、合成によるDNAシーケンシング（SBS）プロセスが始まります。SBSでは、相補鎖にヌクレオチドを順次付加することによってDNA配列を決定します。このステップでは、ヌクレオチドの取り込み、画像取得、切断の反応を周期的に繰り返し、取り込まれたヌクレオチドが発する蛍光シグナルに基づいてDNA配列を決定できます。
• 超並列シーケンシング： 最終ステップでは、空間的に分離された増幅済みのDNA鋳型の配列を、超並列方式で同時に決定します。この処理能力の高いシーケンシング手法では、単一のシーケンシングランで数百万から数十億のシーケンシングリードを生成でき、DNA配列を効率的かつ迅速に決定できます。

超音波DNA断片化はどのように機能するのでしょうか？

超音波処理は、音響サンプル処理とも呼ばれ、DNAを断片化するために広く使用されている方法です。超音波DNAせん断では、制御された条件下でサンプルに超音波を照射します。超音波DNA断片化の動作原理は、超音波が生み出す振動とキャビテーションに基づいています。超音波（音響）キャビテーションによって生じるせん断力が、高分子量DNA分子を切断します。強度（振幅、処理時間）、パルスモード、温度などの超音波処理設定により、DNAを目的とする特定の断片長に精密に断片化できます。超音波処理ではDNAが100–600 bpに短縮されることが多い一方、より穏やかな超音波条件を適用すると、最大1300 bpのより長いDNA断片を得られます。

DNAの分解を防ぐための温度制御

DNAの二本鎖分子構造は温度上昇に非常に敏感なため、サンプル調製ステップで温度を正確に制御することは、信頼性の高い解析結果を得るための重要な要因です。
Hielscherのプローブ型超音波処理装置、VialTweeter、UIP400MTPのいずれを使用する場合でも、接続式温度センサーとインテリジェントな装置ソフトウェアにより、継続的な温度監視と制御が確保されます。温度を特定の範囲内に維持するために、温度の上限と下限を設定できます。これにより、温度が設定した上限を超えると超音波処理装置は直ちに一時停止し、温度が設定した∆Tだけ低下すると、自動的に超音波処理を再開します。
Hielscherの超音波処理装置の高度なソフトウェアにより、理想的なサンプル処理条件を確実に維持できます。

UIP400MTPマルチウェルプレート超音波処理装置による大量サンプルのDNA断片化

生命科学分野のサンプル数は、過去十年間で大幅に増加しています。そのため、比較可能で妥当な結果を得るには、非常に多数のサンプル（例：マイクロプレート一枚あたり384、1536、3456ウェル）を、サンプル調製および解析中に常に同一の条件で処理する必要があります。Hielscher Ultrasonicsは、UIP400MTPによって大量サンプル処理の動向に対応しています。UIP400MTPは、マイクロプレートを使用したサンプル調製用の超音波処理装置です。UIP400MTPは、6、12、24、48、96、384、1536、3456ウェルのプレートを処理できます。マイクロプレートの種類に応じて、各ウェルは通常、数十ナノリットルから数ミリリットルのサンプル容量を収容できます。生命科学研究で広く使用されているUIP400MTPは、ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）やPCRなどのアッセイ前、タンパク質分析前のサンプル調製に加え、CHiPおよびCHiP-seq前のクロマチン調製、ヒストン修飾の同定、その他の分析処理（例：ゲル電気泳動、質量分析）にも非常によく使用されています。
PCRプレートの高処理能力での処理について詳しくご覧ください！

最大10本のバイアルのサンプル調製に対応するVialTweeter

VialTweeterは、研究室で広く使用されている超音波処理装置VialTweeterで、最大10本のバイアルを同時に効果的かつ快適に超音波処理できます。バイアルや試験管（例：Eppendorfバイアル、クライオバイアル、遠心管）を間接的に超音波処理するため、あらゆる交差汚染を回避できます。各サンプルに同じ超音波強度が伝達されるため、すべての超音波処理結果が均一で再現性のあるものになります。VialTweeterは、当社の他のデジタル装置と同様に、すべてのインテリジェントな機能（例：インテリジェントなメニュー、プログラム可能な設定、温度制御、遠隔操作など）を備え、最高の使用快適性を確保します。

マイクロウェルプレート用マルチフィンガープローブ

超音波プローブ型ホモジナイザーUP200HtおよびUP200Stに対応する4本または8本のフィンガーを備えたマルチフィンガープローブは、複数のサンプルを同一条件で同時に超音波処理するための使いやすい選択肢です。例えば、ソノトロードMTP-24-8-96は八本のフィンガーを備えたプローブで、自動化システムへの組み込みや、マルチウェルプレートの各ウェルの効率的な手動サンプル調製に最適です。マルチフィンガーソノトロードは、標準的な超音波ソノトロードを使用して主にビーカーや試験管を処理する研究室の自動化に最適です。マルチフィンガープローブと標準プローブは数分以内に迅速に交換でき、単一プローブの超音波処理装置をマルチプローブの超音波破砕装置に変換できます。

DNA断片化用Hielscher超音波処理装置

Hielscher Ultrasonicsは、DNA、RNA、クロマチンの断片化用に、超音波を基盤とするさまざまなプラットフォームを提供しています。これらには、超音波プローブ（ソノトロード）、複数のチューブやマルチウェルプレート（例：96ウェルプレート、マイクロタイタープレート）の同時サンプル調製用の間接超音波処理ソリューション、超音波反応器、超音波CupHornが含まれます。DNAせん断用のすべてのプラットフォームは、周波数を調整した高性能超音波プロセッサーによって駆動され、精密に制御でき、再現性のある結果をもたらします。

あらゆるサンプル数とサイズに対応する超音波プロセッサー

Hielscherのマルチサンプル超音波処理装置VialTweeter（最大10本の試験管用）およびUIP400MTP（マイクロプレート／マルチウェルプレート用）を使用すると、強力で精密に制御可能な超音波処理により、目的のDNA断片サイズ分布と収量を得ながら、サンプル処理時間を短縮できます。超音波DNA断片化により、サンプル調製の効率、信頼性、拡張性が向上します。常に制御された超音波を適用することで、プロトコルを単一のサンプルから多数のサンプルへと線形にスケールアップできます。
一本から五本のフィンガーを備えたプローブ型超音波処理装置は、少数のサンプルの調製に最適です。Hielscherの研究室用超音波処理装置はさまざまなサイズで提供されているため、お客様の用途と要件に最適な装置をご提案できます。

精密なプロセス制御

過度な超音波処理はDNA、RNA、クロマチンを破壊する可能性がある一方、不十分な超音波せん断ではDNAやクロマチンの断片が長すぎるため、精密に制御できる超音波処理設定が極めて重要です。Hielscherのデジタル超音波処理装置では、超音波処理パラメーターを容易かつ精密に設定できます。特定の超音波処理設定をプログラム設定として保存し、同じ手順を迅速に繰り返すこともできます。
すべての超音波処理は自動的に記録され、内蔵SDカードにCSVファイルとして保存されます。これにより、実施した試験を正確に文書化でき、超音波処理の各実行を容易に見直せます。
ブラウザーによる遠隔操作により、すべてのデジタル超音波処理装置を標準的な任意のブラウザーから操作・監視できます。LAN接続によって非常に簡単にプラグアンドプレイでセットアップできるため、追加ソフトウェアのインストールは不要です。


超音波サンプル調製における最高の使いやすさ

Hielscherのすべての超音波処理装置は、高性能な超音波を提供すると同時に、常に非常に使いやすく、操作が簡単になるよう設計されています。すべての設定は明確なメニュー内で整理されており、カラータッチディスプレイやブラウザーによる遠隔操作から容易にアクセスできます。プログラム可能な設定と自動データ記録を備えたインテリジェントなソフトウェアにより、信頼性と再現性のある結果を得るための最適な超音波処理設定が確保されます。明快で使いやすいメニューインターフェースにより、Hielscherの超音波処理装置は使いやすく効率的な装置となっています。
以下の表は、DNAおよびRNAの断片化、細胞溶解、タンパク質抽出などのサンプル調製作業に最適な、当社の研究室用超音波処理装置のおおよその処理能力を示しています：