超音波処理によるBL21細胞の溶解

BL21細胞は、タンパク質を高効率で発現できることから、研究室、バイオテクノロジー、工業生産で広く使用されている大腸菌株です。超音波による細胞破砕、溶解、タンパク質抽出は、BL21細胞の内部から目的のタンパク質を分離して回収するための一般的な方法です。超音波処理は細胞を完全に破砕し、内部に閉じ込められたすべてのタンパク質を放出するため、タンパク質の100%を利用できるようになります。

タンパク質発現用のBL21細胞

BL21細胞は、T7 RNAポリメラーゼ-IPTG誘導系を用いた形質転換と高レベルのタンパク質発現に適した、化学的コンピテント大腸菌株です。BL21細胞では、T7プロモーターの制御下にあるあらゆる遺伝子のタンパク質を高効率で発現できます。大腸菌株BL21(DE3)は、T7プロモーターに基づく発現ベクターと組み合わせて使用する、T7 RNAポリメラーゼに基づくタンパク質生産株であり、組換えタンパク質の生産のために研究室や産業分野で広く使用されています。BL21(DE3)では、組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現が、染色体にコードされたT7 RNAポリメラーゼ（T7 RNAP）によって転写されます。この酵素は、通常の大腸菌RNAPより八倍速く転写します。このため、BL21(DE3)株は高い効率を示し、最も好まれるタンパク質発現細胞系の一つとなっています。

BL21細胞の超音波溶解とタンパク質抽出のプロトコル

BL21細胞の溶解は、主に超音波処理と、溶解バッファーとしてのラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシルとも呼ばれます）を組み合わせて行われます。超音波による細胞破砕とタンパク質抽出の利点は、信頼性、再現性に加え、超音波処理装置の操作が簡単、安全、迅速であることです。以下のプロトコルは、BL21細胞の超音波溶解の手順を段階的に示しています。

• シャペロンタンパク質を除去するため、BL21菌体ペレットを、氷冷したSodium Tris-EDTA（STE）バッファー50 mlに再懸濁しました。このバッファーは、10 mM Tris-HCL、pH 8.0、1 mM EDTA、150 mM NaClからなり、100 mM PMSFを添加したものです。
• 次に、リゾチーム（10 mg/ ml）500 ulを添加し、細胞を氷上で15 minインキュベートします。
• その後、DTT 500 ulとサルコシル7 ml（STEバッファーで調製した10% (w/v)溶液）を添加します。
• すべての精製バッファーを氷冷状態に保ち、サンプルを常に氷上に置くことが不可欠です。可能であれば、すべての精製工程を低温室で行うべきです。



• 超音波溶解とタンパク質抽出には、 VialTweeterマルチサンプル超音波処理装置 を用い、振幅100%で4 x 30 secの超音波処理を行い、各処理の間に2 minの間隔を設けます。代わりに、マイクロチップを備えたプローブ型超音波ホモジナイザー、例えば UP200Ht にS26d2を装着して使用することもできます（3 x 30 sec、超音波処理サイクル間の休止時間2 min.、振幅80%）。
• その後の精製工程に備え、サンプルは氷上に保つか、または次の処理まで-80°Cで保存する必要があります。

精密な温度制御下での超音波溶解

生物学的サンプルを扱う際には、精密で信頼性の高い温度制御が極めて重要です。高温は、サンプル中のタンパク質の熱による分解を引き起こします。
すべての機械的なサンプル調製技術と同様に、超音波処理も熱を発生させます。しかし、VialTweeterを使用すれば、サンプルの温度を適切に制御できます。VialTweeterとVialPressを使用して分析用のサンプルを調製する際に、サンプルの温度を監視・制御するためのさまざまな方法をご紹介します。

1. サンプル温度の監視：VialTweeterを駆動する超音波プロセッサーUP200Stには、インテリジェントソフトウェアと接続式温度センサーが搭載されています。温度センサーをUP200Stに接続し、温度センサーの先端をサンプルチューブの一つに挿入します。デジタルカラータッチディスプレイを通じて、UP200Stのメニューでサンプルの超音波処理に用いる特定の温度範囲を設定できます。超音波処理装置は最高温度に達すると自動的に停止し、サンプル温度が設定温度∆の下限値まで下がるまで休止します。その後、超音波処理が自動的に再開されます。このインテリジェントな機能は、熱による分解を防ぎます。
2. VialTweeterブロックは予冷できます。VialTweeterブロック（トランスデューサーを含めず、ソノトロードのみ！）を冷蔵庫または冷凍庫に入れてチタンブロックを予冷すると、サンプルの温度上昇を遅らせるのに役立ちます。可能であれば、サンプル自体も予冷できます。
3. 超音波処理中の冷却にはドライアイスを使用します。ドライアイスを入れた浅いトレーを用意し、その上にVialTweeterを置くことで、熱を速やかに放散させることができます。

世界中のお客様が、生物学、生化学、医学、臨床の研究室における日常的なサンプル調製作業にVialTweeterとVialPressを使用しています。UP200Stプロセッサーのインテリジェントソフトウェアと温度制御により、温度が確実に制御され、熱によるサンプルの分解が回避されます。VialTweeterとVialPressを用いた超音波サンプル調製は、極めて高い信頼性と再現性を備えた結果をもたらします！
 

溶解用途に最適な超音波破砕装置を見つける

Hielscher Ultrasonicsは、研究室用、卓上型、工業規模のシステム向けに高性能の超音波細胞破砕装置とホモジナイザーを製造してきた、長年の経験を持つメーカーです。用途に適した超音波細胞破砕装置を見つけるには、細菌細胞の培養規模、研究または生産の目的、時間当たりまたは日当たりに処理する細胞の量が重要な要素となります。
Hielscher Ultrasonicsは、複数サンプルの同時超音波処理（VialTweeterでは最大10本のバイアル）や多数のサンプルの処理（すなわち、UIP400MTPによるマイクロタイタープレート / ELISAプレートの処理）向けのさまざまなソリューションに加え、出力50–400ワットの各種従来型プローブ式実験室用超音波処理装置から、大規模生産における商業的な細胞破砕とタンパク質抽出のための、装置当たり最大16,000ワットの本格的な工業用超音波プロセッサーまで提供しています。Hielscherのすべての超音波処理装置は、全負荷で24/7/365運転するように設計されています。堅牢性と信頼性は、当社の超音波装置の中核となる特長です。
すべてのデジタル超音波ホモジナイザーには、インテリジェントソフトウェア、カラータッチディスプレイ、自動データ記録機能が搭載されており、研究室や生産施設で便利に使える作業ツールとなっています。
生物学的サンプルについて、処理する細胞の種類、量、頻度、目的をお知らせください。お客様のプロセス要件に最も適した超音波細胞破砕装置をご提案します。

以下の表は、小型のハンドヘルドホモジナイザーやマルチサンプル超音波処理装置から商業用途の工業用超音波プロセッサーまで、当社の超音波システムのおおよその処理能力を示しています。

文献 / 参考資料

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