超音波処理によるBL21細胞の細胞溶解
BL21細胞は、タンパク質を非常に効率的に発現する能力により、研究所、バイオテクノロジー、工業生産で広く使用されている大腸菌の株です。超音波細胞破壊、溶解およびタンパク質抽出は、BL21細胞の細胞内部から標的タンパク質を単離しそして収集するための一般的な方法である。超音波処理は細胞を完全に破壊し、閉じ込められたすべてのタンパク質を放出し、タンパク質の100%を利用可能にします。
BL21 タンパク質発現用細胞
BL21細胞は、T7 RNAポリメラーゼ-IPTG誘導システムを用いた形質転換および高レベルタンパク質発現に適した、化学的にコンピテントな大腸菌株です。BL21細胞は、T7プロモーターの制御下にある任意の遺伝子の高効率なタンパク質発現を可能にします。大腸菌BL21(DE3)株は、T7プロモーターベースの発現ベクターと組み合わせたT7 RNAポリメラーゼベースのタンパク質生産株であり、組換えタンパク質を作製するために研究室や産業界で広く適用されています。BL21(DE3)では、遺伝子組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現が染色体コードT7 RNAポリメラーゼ(T7 RNAP)によって転写され、従来の大腸菌RNAの8倍の速さで転写されます。これにより、BL21(DE3)株は非常に効率的になり、最も好ましいタンパク質発現細胞システムの1つに変わります。
BL21細胞からの超音波溶解およびタンパク質抽出のためのプロトコル
BL21細胞の細胞溶解は、主にラウロイルサルコシネートナトリウム(サルコシルとしても知られる)と組み合わせた超音波処理を使用して行われます 溶解緩衝液として。超音波細胞破壊およびタンパク質抽出の利点は、信頼性、再現性、ならびに超音波装置の単純で安全かつ迅速な操作にある。以下のプロトコルは、超音波BL21細胞溶解の段階的な方向性を示しています。
- シャペロンタンパク質を除去するために、BL21細菌ペレットを50mlの氷冷Tris-EDTA(STE)緩衝液(10 mM Tris-HCL、pH 8.0、1 mM EDTA、150 mM NaCl、100 mM PMSFを添加)に再懸濁しました。
- 500 ulのリゾチーム(10 mg / ml)を添加し、細胞を氷上で15分間インキュベートします。
- その後、500 ulのDTTと7 mlのサルコシル(STEバッファーで10%(w / v)を構成する)を添加します。
- すべての精製バッファーを氷冷に保ち、サンプルを常に氷上に維持することが不可欠です。すべての精製ステップは、可能であれば冷蔵室で実行する必要があります。
- 超音波溶解およびタンパク質抽出のために、サンプルは超音波処理されます VialTweeterマルチサンプル超音波装置 100%の振幅で4 x 30秒間、各超音波処理の間に2分の間隔を空けます。あるいは、マイクロチップを備えたプローブ型超音波ホモジナイザー、例えば、 UP200HTの S26d2(3 x 30秒、超音波サイクル間の2分間の一時停止、80%振幅)を使用できます。
- さらなる精製ステップでは、サンプルを氷上に保管するか、またはさらなる処理まで-80°Cで保存する必要があります。
超音波細胞破壊器 UP200St マイクロチップS26d2付きで溶解およびタンパク質抽出用
精密温度制御下での超音波溶解
正確で信頼性の高い温度制御は、生物学的サンプルを取り扱う際に非常に重要です。高温は、サンプル中の熱的に誘発されたタンパク質分解を開始します。
すべての機械的なサンプル調製技術と同様に、超音波処理は熱を発生させます。ただし、VialTweeterを使用すると、サンプルの温度を適切に制御できます。サンプルの温度を監視および制御しながら、 VialTweeter と VialPress 分析のためにサンプルを準備します。
- サンプル温度の監視:超音波プロセッサUP200Stを駆動するVialTweeterには、インテリジェントなソフトウェアとプラグ可能な温度センサーが装備されています。温度センサーをUP200Stに差し込み、温度センサーの先端をサンプルチューブの1つに挿入します。デジタルカラータッチディスプレイを介して、UP200Stのメニューでサンプル超音波処理の特定の温度範囲を設定できます。超音波装置は、最高温度に達すると自動的に停止し、サンプル温度が設定温度∆の低い値まで下がるまで一時停止します。その後、超音波処理が自動的に再開されます。このスマートな機能により、熱による劣化を防ぎます。
- VialTweeterブロックは予冷できます。VialTweeterブロック(トランスデューサーなしのソノトロードのみ)を冷蔵庫または冷凍庫に入れて、チタンブロックを予冷すると、サンプルの温度上昇を延期するのに役立ちます。可能であれば、サンプル自体も予冷することができます。
- 超音波処理中にドライアイスを使用して冷却します。ドライアイスで満たされた浅いトレイを使用し、 VialTweeter 氷の上に置き、熱が急速に放散されるようにします。
世界中のお客様が使用しています VialTweeter と VialPress 生物学的、生化学的、医療、臨床研究所での日常のサンプル調製作業に。UP200Stプロセッサのインテリジェントなソフトウェアと温度制御により、温度を確実に制御し、熱によるサンプルの劣化を回避します。超音波サンプル調製 VialTweeterとVialPressは、信頼性と再現性の高い結果を提供します!
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ヒールシャー超音波は、マルチサンプル(最大10バイアル)の同時超音波処理のためのさまざまなソリューションを提供しています VialTweeter)および質量サンプル(すなわち、マイクロタイタープレート/ UIP400MTP付きELISAプレート)、ならびに50から400ワットまでの異なる電力レベルを持つ古典的なプローブタイプのラボ超音波装置から、商業細胞破壊および大規模生産でのタンパク質抽出のためのユニットあたり最大16,000ワットの完全工業用超音波プロセッサまで。すべてのヒールシャー超音波装置は、全負荷時の24/7/365操作のために構築されています。堅牢性と信頼性は、当社の超音波デバイスの中核的な特徴です。
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どのような種類の細胞、どのくらいの量、どのくらいの頻度で、どのターゲットで生物学的サンプルを処理する必要があるのか、お知らせください。私たちはあなたのプロセス要件に最も適した超音波細胞破壊器をお勧めします。
以下の表は、コンパクトなハンドヘルドホモジナイザーとマルチサンプル超音波処理装置から商用アプリケーション用の工業用超音波プロセッサまで、当社の超音波システムのおおよその処理能力を示しています。
| バッチボリューム | 流量 | 推奨デバイス |
|---|---|---|
| 96ウェル/マイクロタイタープレート | N.A. | UIP400MTP |
| 10バイアルà0.5〜1.5mL | N.A. | VialTweeterUP200Stで |
| 0.01〜250mL | 5〜100mL/分 | UP50Hの |
| 0.01〜500mL | 10〜200mL/分 | UP100Hの |
| 10〜2000mL | 20〜400mL/分 | UP200HTの, UP400セント |
| 0.1〜20L | 0.2 から 4L/min | UIP2000hdT |
| 10〜100L | 2〜10L/分 | UIP4000hdTの |
| N.A. | 10〜100L/min | UIP16000 |
| N.A. | 大きい | クラスタ UIP16000 |
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知っておく価値のある事実
大腸菌バクテリア
大腸菌は細菌タイプであり、胞子形成性がなく、グラム陰性であり、まっすぐな棒の形を特徴としています。大腸菌は、人間や動物の環境、食品、腸に存在します。大腸菌は通常、ペリトリコスべん毛を使用して運動しますが、非運動性のタイプもあります。大腸菌は、いわゆる通性嫌気性化学有機栄養生物であり、呼吸器代謝と発酵代謝の両方が可能です。ほとんどの大腸菌の種類は良性で、有害な細菌種の増殖を抑制したり、ビタミンを合成したりするなど、体内で有用な機能を果たしています。
大腸菌B型と呼ばれる大腸菌細胞は、大腸菌株の中でも特殊なカテゴリーであり、バクテリオファージ感受性や制限修飾系などのメカニズムを調べる研究に広く用いられています。さらに、大腸菌は、バイオテクノロジーやライフサイエンスの研究室でタンパク質発現の信頼できる働き者として評価されています。例えば、大腸菌は、タンパク質やオリゴ糖などの化合物を工業規模で合成するために使用されます。プロテアーゼ欠乏症、高レベルのグルコースでの低アセテート産生、および透過性の向上などの特定の特徴により、大腸菌B細胞は、遺伝子組み換えタンパク質の生産に最も頻繁に使用される宿主細胞です。
組換えタンパク質
組換えタンパク質(rProt)は、化学品製造、製薬、化粧品、人間および動物医学、農業、食品、廃棄物処理産業など、さまざまな分野で重要性を増しています。
組換えタンパク質の産生には、発現系の使用が必要です。組換えDNAの産生のための発現細胞系として、原核細胞と真核細胞の両方を使用することができる。細菌細胞は、低コスト、容易なスケーラビリティ、単純な培地条件などの要因により、タンパク質発現に最も広く使用されていますが、哺乳類、酵母、藻類、昆虫、無細胞のシステムが確立された代替手段です。タンパク質の種類、機能活性、および発現タンパク質の必要な収量は、タンパク質発現に使用される細胞系の選択に影響を与えます。
組換えタンパク質を発現させるためには、特定の細胞に組換えDNAのテンプレートを含むDNAベクターをトランスフェクションする必要があります。次に、テンプレートでトランスフェクションした細胞を培養します。細胞メカニズムの結果として、細胞は目的のタンパク質を転写および翻訳し、それによって標的タンパク質を産生します。
発現したタンパク質が細胞マトリックスに閉じ込められると、タンパク質を放出するために細胞を溶解(破壊および破壊)する必要があります。その後の精製ステップで、タンパク質を分離し、精製します。
治療に使用された最初の組換えタンパク質は、1982年の組換えヒトインスリンでした。今日、世界中で170種類以上の組換えタンパク質が治療用に生産されています。医学で使用される一般的に使用される組換えタンパク質は、例えば、組換えホルモン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、腫瘍壊死因子、血液凝固因子、血栓溶解薬、および糖尿病、小人症、心筋梗塞、うっ血性心不全、脳卒中、多発性硬化症、好中球減少症、血小板減少症、貧血、肝炎、関節リウマチ、喘息、クローン病、癌治療などの主要な疾患を治療するための酵素です。(cf. Phuc V. Pham, in Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
文献/参考文献
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Vialツイーター ソニケーター 10個のサンプルの同時超音波処理、例えばBL21細胞を破壊するため
高性能超音波!ヒールシャーの製品範囲は、コンパクトなラボ用超音波装置からベンチトップユニットまでの全スペクトルをカバーしています 卓上型超音波システム フルインダストリアル超音波システムまで。