Drosophila Melanogasterサンプルの超音波溶解

Drosophila melanogasterは、実験室でモデル生物として広く使用されています。そのため、Drosophila melanogasterサンプルの溶解、細胞破砕、タンパク質抽出、DNAせん断など、分析前の前処理工程を頻繁に実施する必要があります。超音波破砕装置は信頼性と効率に優れ、超音波プロセスパラメータを調整するだけで、溶解、タンパク質抽出、DNA断片化などのさまざまな作業を容易に実施できます。このように、超音波ホモジナイザーは幅広い用途に対応する柔軟なツールです。

超音波溶解とタンパク質抽出

溶解、細胞の可溶化、組織のホモジナイズ、タンパク質抽出は、生物学実験室における超音波破砕装置の代表的な用途です。超音波破砕装置や細胞破砕装置は、動物組織、昆虫（例：Drosophila melanogaster、C. elegans）、植物試料のホモジナイズに適しています。さらに、超音波処理は、細胞懸濁液やペレットの溶解、および細胞内タンパク質の抽出にも使用されます。
超音波溶解とタンパク質抽出は、信頼性と再現性が非常に高いプロセスであり、確立されたプロトコルに基づいて実施できます。振幅、サイクル / パルスモード、温度、サンプル容量などの超音波処理パラメータによって超音波プロセスの強度を正確に調整できるため、一度有効性が確認されたプロトコルを繰り返し実施し、同じ結果を何度でも得ることができます。

超音波によるDNAとRNAの断片化

細胞溶解とタンパク質抽出の後、サンプル前処理で一般的に必要となる工程は、DNA、RNA、クロマチンのせん断と断片化です。例えば、クロマチン免疫沈降（ChIP）の前に実施されます。DNAとRNAの断片化は、DNAをつなぎ留めている共有結合を物理的な力で切断することによって、確実に行うことができます。超音波処理などの物理的せん断を用いると、まずDNA鎖が切断され、その後DNAがより小さな断片へと断片化されます。
超音波によるDNA断片化は、DNAを目的の長さ、例えば500bp（塩基対）にせん断するうえで、信頼性と効率に優れています。超音波によるDNA断片化の主な利点には、超音波プロセスパラメータと強度を精密に制御できることが挙げられます。超音波プロセスパラメータは、超音波処理の強度、サイクル、時間を正確に調節することで調整できます。これにより、希望するサイズのDNAを作製でき、目的のDNA長を確実に生成し、再現することができます。超音波によるDNAせん断は、高分子量DNA断片の作製にも最適です。

Drosophila melanogasterの超音波溶解プロトコル

以下に、Drosophilaサンプルの超音波支援による溶解、タンパク質抽出、DNAまたはクロマチンの断片化に関するさまざまなプロトコルを紹介します。

架橋免疫沈降（CLIP）アッセイのための超音波溶解

CLIPアッセイは、以前に報告された方法に一部変更を加えて実施しました。日齢0–1の野生型雌から得た約20 mgの卵巣をUV架橋（3 × 2000 μJ/cm2）し、300 UのRNAseOUTを添加した1 mLのRCBバッファー（50 mM HEPES pH 7.4、200 mM NaCl、2.5 mM MgCl2、0.1% Triton X-100、250 mMスクロース、1 mM DTT、1× EDTA不含Completeプロテアーゼ阻害剤、1 mM PMSF）中で氷上にてホモジナイズし、氷上に30 min置きました。ホモジネートを氷上で出力80%にて、20 sのバースト処理を五回、各処理の間に60 sの休止を挟んで超音波処理しました。この処理には、Hielscherの超音波プロセッサー UP100H (100 W, 30 kHz) を使用し、その後遠心分離しました（16,000 × g、4°Cで5 min）。可溶性抽出物を20 μlのProtein-G dynabeadsを用いて4°Cで20 minプレクリアしました。イムノブロッティングとRNAインプットの定量（1%）用にサンプルを取り分けた後、450 μlのプレクリア済み抽出物から、抗HP1 9A9抗体と50 μlのProtein-G dynabeadsを用いて4 hインキュベートすることでHP1を免疫沈降させました。免疫沈降物をRCBで4回洗浄しました。免疫沈降したRNAを溶出させるため、ペレット化したビーズを100 μLのUltraPure DEPC処理水中で5 min煮沸しました。RNA調製用に回収した上清に900 μLのQiazol試薬を加えました。精製したRNAを鋳型として、メーカーのプロトコルに従い、oligo dT、ランダムヘキサマー、SuperScript逆転写酵素IIIを使用してcDNAを合成しました。
(Cassale et al. 2019)

クロマチン免疫沈降アッセイのための超音波溶解

クロマチン免疫沈降は、Menetが記載した方法に軽微な変更を加えて実施しました。日齢0–1の野生型雌から得た約20 mgの卵巣を、1 mLのNEBバッファー（10 mM HEPES-Na pH 8.0、10 mM NaCl、0.1 mM EGTA-Na pH 8、0.5 mM EDTA-Na pH 8、1 mM DTT、0.5% NP-40、0.5 mMスペルミジン、0.15 mMスペルミン、1× EDTA不含Completeプロテアーゼ阻害剤）中で、ホモジナイザー / 浸漬型分散機を用いて1 min（3000 rpmで）ホモジナイズしました。ホモジネートをあらかじめ冷却したガラス製ダウンスホモジナイザーに移し、密着型ペッスルを用いて15回完全に往復させました。その後、遊離核を6000xg、4°Cで10 min遠心分離しました。核を含むペレットを1 mLのNEBに再懸濁し、スクロース勾配（NEB中の1.6 Mスクロース溶液0.65 mL、NEB中の0.8 Mスクロース溶液0.35 mL）上で20000 × gにて20 min遠心分離しました。ペレットを1 mLのNEBと、最終濃度が1%となるホルムアルデヒドに再懸濁しました。核を室温で10 min架橋し、1.375 Mグリシンを1/10 vol加えて反応を停止しました。6000 × gで5 min遠心分離して核を回収しました。核を1 mLのNEBで二回洗浄し、1 mLの溶解バッファー（15 mM HEPES-Na pH 7.6、140 mM NaCl、0.5 mM EGTA、1 mM EDTA pH 8、1% Triton X-100、0.5 mM DTT、0.1%デオキシコール酸Na、0.1% SDS、0.5% N-ラウロイルサルコシン、1× EDTA不含Completeプロテアーゼ阻害剤）に再懸濁しました。核の超音波処理には、Hielscherの超音波プロセッサー UP100H (100 W, 30 kHz) を使用し、20 sの超音波照射と氷上での1 minの保持を六回繰り返しました。超音波処理した核を13000 × g、4°Cで4 min遠心分離しました。超音波処理したクロマチンの大部分は、長さが500–1000塩基対（bp）でした。各免疫沈降では、15 μgのクロマチンを10 μgのHP1 9A9モノクローナル抗体の存在下でインキュベートしました（回転ホイール上で4°C、3 h）。その後、50 μlのdynabeads protein Gを加え、4°Cで一晩インキュベートを続けました。上清を廃棄し、サンプルを溶解バッファーで二回（各洗浄は4 °Cで15 min）、TEバッファー（1 mM EDTA、10 mM TrisHCl pH 8）で二回洗浄しました。クロマチンをビーズから二段階で溶出させました。まず、100 μlの溶出バッファー1（10 mM EDTA、1% SDS、50 mM TrisHCl pH 8）中で65°C、15 min処理し、その後遠心分離して上清を回収しました。ビーズ画分を100 μlのTE + 0.67% SDSで再抽出しました。合わせた溶出液（200 μl）を65°Cで一晩インキュベートして架橋を解除し、50 μg/mlのRNaseAで65°C、15 min、500 μg/mlのプロテイナーゼKで65°C、3 h処理しました。サンプルをフェノール–クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させました。DNAを25 μlの水に再懸濁しました。免疫沈降したDNAによる分子解析を最大限に活用するため、単一反応内で融解温度の近い二種類のプライマーセットを使用する最適化されたデュプレックスPCRプロトコルにより、候補遺伝子を二つずつ増幅しました。
(Casale et al. 2019)
 

生物学的サンプル用の高性能超音波細胞破砕装置

Hielscher Ultrasonicsは、細胞破砕、溶解、タンパク質抽出、DNA、RNA、クロマチンの断片化、およびその他の分析前のサンプル前処理工程に使用する高性能超音波装置について、豊富な経験を持つパートナーです。実験室用超音波ホモジナイザーとサンプル前処理ユニットを幅広く取り揃えるHielscherは、お客様の生物学的用途と要件に最適な超音波装置を提供します。
マイクロチップを備えた従来型のプローブ式超音波装置である UP200St （200W；左の写真を参照）などや、超音波サンプル前処理ユニットの VialTweeter または UP200ST_TD_CupHorn にVialHolderを組み合わせたモデルは、研究・分析実験室で人気があります。従来型の超音波プローブは、少数のサンプルを溶解、抽出、断片化する必要がある場合に最適です。サンプル前処理ユニットのVialTweeterとUP200St_TD_CupHornは、それぞれ最大10本と5本のバイアルを同時に超音波処理できます。
多数のサンプル（例：96ウェルプレート、マイクロタイタープレートなど）を処理する必要がある場合は、 UIP400MTP が最適な超音波処理装置です。UIP400MTPは、水を満たし、マイクロウェルプレートを収容するのに十分なスペースを備えた大型のCupHornのように機能します。400ワットの強力な超音波プロセッサーで駆動されるUIP400MTPは、細胞破砕、サンプル溶解、ペレットの可溶化、タンパク質抽出、DNAせん断のために、マルチウェルプレートに対して非常に均一かつ強力な超音波処理を行います。

スマートソフトウェアによる精密制御

200ワット以上のHielscherの超音波処理ソリューションはすべて、デジタルカラータッチスクリーンとインテリジェントなソフトウェアを備えています。スマートなデータ記録機能により、超音波装置を起動するとすぐに、すべての超音波プロセスパラメータが内蔵SDカードにCSVファイルとして自動保存されます。これにより、研究と記録作業が格段に便利になります。超音波処理試験やサンプル前処理の後は、各超音波処理のパラメータを簡単に確認し、比較できます。
直感的なメニューを通じて、超音波処理前に多くのパラメータをあらかじめ設定できます。例えば、サンプル内の温度を制御して熱劣化を防ぐため、サンプル温度の上限を設定できます。超音波ユニットに付属する着脱可能な温度センサーは、超音波処理中の実際の温度を超音波プロセッサーにフィードバックします。温度が上限に達すると、超音波装置は設定した∆Tの下限に達するまで処理を一時停止し、その後自動的に超音波処理を再開します。
特定のエネルギー投入量で超音波処理する必要がある場合は、その処理の最終的な超音波エネルギー量をあらかじめ設定できます。もちろん、超音波のパルス動作とサイクルモードも個別に設定できます。
最も良好な結果が得られた超音波処理パラメータを再利用するため、さまざまな超音波処理モード（例：処理時間、強度、サイクルモードなど）をプリセットモードとして保存でき、簡単かつ迅速に再び開始できます。
操作の利便性をさらに高めるため、すべてのデジタル超音波ユニットは、一般的なブラウザー（例：InternetExplorer、Safari、Chromeなど）を使用したブラウザー遠隔操作に対応しています。LAN接続は簡単なプラグアンドプレイ方式で、追加のソフトウェアをインストールする必要はありません。
Hielscherは、生物学的サンプルの超音波処理を成功させるには精度と反復性が必要であることを理解しています。そのため、効率的で信頼性が高く、再現性に優れた便利なサンプル前処理を可能にするすべての機能を備えたスマートデバイスとして、超音波装置を設計しました。

以下の表は、多数のサンプルを便利かつ確実に前処理するための、超音波マイクロチップや従来型の超音波ホモジナイザーから複数サンプル用超音波装置まで、当社の超音波システムのおおよその処理能力を示しています。