ショウジョウバエメラノガスターサンプルの超音波リシス

ショウジョウバエメラノガスターは、モデル生物として研究室で広く使用されています。そのため、ショウジョウバエメラノガスターサンプルのリシス、細胞破壊、タンパク質抽出およびDNA剪断などの事前分析用調製工程を頻繁に実施しなければならない。超音波ディスメトブラーは信頼性が高く、効率的であり、超音波プロセスパラメータを調整するだけで、リシス、タンパク質抽出、DNA断片化などの様々なタスクを容易に実行するために使用できます。超音波ホモジナイザーは、それによって、アプリケーションの広い範囲で柔軟なツールです。

超音波リシスとタンパク質抽出

溶解、細胞の可溶化、組織の均質化およびタンパク質抽出は、生物学的実験室における超音波ディスメムブラーの典型的なタスクである。超音波ディスメムブラクタおよび細胞破壊剤は、動物組織、昆虫(例えば、ショウジョウバエメラノガスター、C.エレガンス)または植物標本を均質化するのに適している。超音波のその後のアプリケーションは、細胞の懸濁液やペレットのリシスだけでなく、細胞内タンパク質の抽出です。
超音波のリシスおよびタンパク質抽出は確立されたプロトコルに基づいて行うことができる信頼性が高く、再現可能なプロセスである。超音波プロセス強度は、振幅、サイクル/パルスモード、温度およびサンプル量などの超音波処理パラメータを介して正確に調整することができるので、一度証明されたプロトコルは何度も同じ結果で繰り返すことができます。

超音波DNAとRNAフラグメンテーション

細胞溶解およびタンパク質抽出後、サンプル調製に必要な一般的な工程は、DNA、RNA、クロマチン、例えばクロマチン免疫沈降(ChIP)前の剪断および断片化である。DNAとRNAの断片化は、DNAを一緒に保持する共有結合を物理的な力によって破壊することによって確実に達成することができる。超音波処理などの物理的なせん断を使用して、最初はDNA鎖が壊れ、次いでDNAが小さな断片に断片化される。
超音波DNA断片化は、標的長(例えば500bp(塩基対)までDNAを剪断する上で信頼性が高く、効率的である。超音波DNA断片化の主な利点は、超音波プロセスパラメータと強度の正確な制御が含まれます。超音波プロセスパラメータは、超音波処理強度、サイクル、時間を正確に調整することによって調整することができます。これにより、所望のDNAサイズを作成することができ、標的DNA長を確実に作製し、再現することができる。超音波DNA剪断は、高分子量DNA断片を作成するのにも理想的です。

ショウジョウバエメラノガスターの超音波リシスのためのプロトコル

以下では、超音波支援溶解、タンパク質抽出、およびショウジョウバエサンプルのDNAまたはクロマチン断片化のための様々なプロトコルを見つけることができます。

架橋免疫沈降(CLIP)アッセイ用超音波リシス

CLIPアッセイは、いくつかの変更を加えた上で報告されたように行われた。約20mgの卵巣を0〜1日齢の野生型雌は、UV架橋(3×2000 μJ/cm2)、1 mL RCBバッファー(50 mM HEPES pH 7.4)で氷上で均質化された 200 mM NaCl、2.5 mM MgCl2、0.1%トリトンX-100、250 mMスクロース、1×dTTT、EDTAフリーの完全なプロテアーゼ阻害剤、1 mM PMSF)に300 U RNAEOUTを添加し、30分間氷上に置いた。ホモジュネートは氷の上で超音波処理され、80%のパワーで、ヒールシャー超音波プロセッサを使用する間に60の休息で20 sバーストで5回 UP100H(100 W、30 kHz) 遠心分離(16000×g4°Cで5分間)。可溶性エキスは、4°Cで20分間、20μlのプロテインGダイナビーズで予めクリアしました。 免疫ブロット法およびRNA入力定量用サンプルの除去後、HP1は、50μl Protein-Gダイナビーズで4時間インキュベーションすることにより、450μlプリクリアされた抽出物から抗HP1 9A9抗体で免疫沈降した。免疫沈降物をRCBで4回洗浄した。免疫沈降RNAを溶出させるために、ペレット化ビーズを、超純粋DEPC処理水の100μLで5分間沸騰させ、900μLのチアゾール試薬をRNA調製のために回収した上清に添加した。精製されたRNAを鋳型として使用し、オリゴdT、ランダム六角およびスーパースクリプト逆転写酵素IIIをメーカーのプロトコルに従って合成した。
(カザーレら 2019)

クロマチン免疫沈降アッセイ用超音波溶解

クロマチン免疫沈降は、メネが説明した方法に従って軽微な改変を行った。0~1日齢の野生型雌の約20mgの卵巣をNEB緩衝液の1mL(pH8.0で10 mM HEPES-Naで均質化した。 10 mM NaCl, 0.1 mM EGTA-Na at pH 8, 0.5 mM EDTA-Na at pH 8, 1 mM DTT, 0.5% NP-40, 0.5 mM スペルミジン, 0.15 mM スペルミン, 1× EDTA- フリー完全プロテアーゼ阻害剤 (30 rpm)ホモゲネートは冷蔵ガラスの日当てに移され、15本のフルストロークがタイトな害虫で適用された。その後、遊離核を6000xgで4°Cで10分間遠心分離した。 核含有ペレットをNEBの1mLで再懸濁し、ショ糖勾配(NEBでは1.6Mスクロースの0.6mL、NEBでは0.8Mスクロースの0.35mL)で20000×gで20分間遠心した。ペレットをNEBとホルムアルデヒドの1mLで1%の最終濃度に再懸濁した。核は室温で10分間架橋し、1.375 Mグリシンの1/10体積を加えてクエンチした。核を5分間6000×gで遠心分離して回収した。核をNEBの1mLで2回洗浄し、1mLのリシスバッファー(pH 7.6で15 mM HEPES-Na)に再懸濁した。 140 mM NaCl,0.5 mM EGTA, 1 mM EDTA at pH 8, 1% トリトン X-100, 0.5 mM DTT, 0.1% ナ デオキシコール酸, 0.1% SDS, 0.5% N-ラウロロサルコシンおよび 1× EDTA フリー コンプリートプロテアーゼ阻害剤).核はヒールシャー超音波プロセッサを使用して超音波処理された UP100H(100 W、30 kHz) 20 sで6回、氷の上で1分。超音波付き核を4°Cで4分間13000×gで遠心した。 超音波クロマチンの大部分は、長さが500〜1000塩基対(bp)であった。各免疫沈降について、15μgのクロマチンをHP1 9A9モノクローナル抗体の10 μg(回転ホイールで4°Cで3h)の存在下でインキュベートした。その後、50μlのダイナビーズタンパク質Gを添加し、4°Cで一晩インキュベーションを続けた。 上清を廃棄し、サンプルをリシスバッファー(各洗浄15分4°C)で2回洗浄し、TEバッファ(1 mM EDTA、pH8で10 mM TrisHCl)で2回洗浄した。クロマチンは2つのステップでビーズから溶出した;100 μl のエルイションバッファー 1 (10 mM EDTA、 1% SDS、pH 8 で 50 mM TrisHCl) を 65°C で 15 分間、次いで遠心分離と上清の回収。ビーズ材料を100 μlのTE+0.67%SDSで再抽出した。合わせて溶出した溶出液(200 μl)を、クロスリンクを逆にするために一晩インキュベートし、65°Cで15分間50 μg/ml RNaseA、65°Cで3時間500 μg/mlのプロテネーゼKによって処理しました。 試料をフェノールクロロホルム抽出し、エタノールを沈殿させた。DNAを25μlの水に再懸濁させた。DNA免疫沈降で分子解析を最大化するために、候補遺伝子は、単一の反応で同様の融解温度を有する2つの異なるプライマーセットを使用して、最適化されたduplex-PCRプロトコルを介してペアで増幅された。
(カザーレら 2019)

生体試料用高性能超音波細胞破壊器

ヒールシャー超音波は、細胞破壊、溶解、タンパク質抽出、DNA、RNA、クロマチンの断片化、ならびに他の分析前のサンプル調製ステップのための高性能超音波装置に関しては、あなたの長年の経験豊富なパートナーです。超音波ラボホモジナイザーとサンプル調製ユニットの包括的なポートフォリオを提供し、ヒールシャーは、あなたの生物学的アプリケーションと要件のための理想的な超音波デバイスを持っています。
のようなマイクロ先端を備えた古典的なプローブ型超音波機 UP200St (200W;写真左参照)または超音波サンプル調製ユニットの1つ VialTweeter または UP200ST_TD_CupHorn VialHolderは、研究および分析研究所で好みのモデルです。古典的な超音波プローブは、準備する場合、より少ないサンプルは、抽出または断片化する必要があります準備する理想的です。サンプル調製ユニットVialTweeterとUP200St_TD_CupHorn、それぞれ最大10または5バイアルの同時超音波処理を可能にします。
高いサンプル数(例えば96ウェルプレート、マイクロティタープレートなど)を処理する必要がある場合は、サンプル UIP400MTP 理想的な超音波処理のセットアップです。UIP400MTPは水で満たされ、マイクロウェルの版を保持するのに十分なスペースがあるより大きいコップのように機能する。400ワット強力な超音波プロセッサを搭載したUIP400MTPは、細胞を破壊し、サンプルを溶解し、ペレットを可溶化し、タンパク質または剪断DNAを抽出するために、マルチウェルプレートの非常に均一で強烈な超音波処理を提供します。

スマートソフトウェアによる精密な制御

200ワット以上のすべてのヒールシャー超音波処理ソリューションは、デジタルカラータッチスクリーンとインテリジェントなソフトウェアが装備されています。すべての超音波プロセスパラメータをプロトコルスマートデータを介して自動的に超音波処理器が起動すると、内蔵のSDカードにCSVファイルとして保存されます。これにより、研究とプロトコルが非常に便利になります。超音波処理の試行またはサンプルの準備の後、あなたは単に各超音波処理の実行の超音波処理パラメータを確認し、それらを比較することができます。
直感的なメニューを介して、多数のパラメータは、超音波処理の前にプリセットすることができます:例えば、サンプル内の温度を制御し、その熱劣化を防ぐために、サンプル温度の上限を設定することができます。超音波ユニットに付属しているプラグ可能な温度センサーは、実際の超音波処理温度に超音波プロセッサフィードバックを与えます。温度の上限に達すると、セット∆Tの下限に達するまで超音波装置が一時停止し、再び自動的に超音波処理を開始します。
特定のエネルギー入力で超音波処理が必要な場合は、超音波処理実行の最終的な超音波エネルギーをプリセットすることができます。もちろん、超音波脈動とサイクルモードも個別に設定することができます。
あなたの最も成功した超音波処理パラメータを再利用するには、彼らが簡単かつ迅速に再び開始できるように、事前設定モードとして様々な超音波処理モード(例えば、超音波処理時間、強度、サイクルモードなど)を保存することができます。
より操作上の利便性のために、すべてのデジタル超音波ユニットは、任意の一般的なブラウザ(例えば、InternetExplorer、Safari、クロムなど)でブラウザのリモコンを介して操作することができます。LAN 接続は単純なプラグ アンド プレイ セットアップで、追加のソフトウェアのインストールは必要ありません。
ヒールシャーの私たちは、生物学的サンプルの成功した超音波処理は、精度と再現性を必要とすることを知っています。そのため、効率的で信頼性が高く、再現性があり、便利なサンプル調製を可能にする、すべての機能を備えたスマートデバイスとして超音波装置を設計しました。

以下の表は、多数のサンプルの便利で信頼性の高い準備のためのMultiSample超音波装置への超音波マイクロチップと古典的な超音波ホモジナイザーから私たちの超音波システムのおおよその処理能力の指標を与えます: