ショウジョウバエメラノガスターサンプルの超音波溶解

ショウジョウバエメラノガスターは、モデル生物として実験室で広く使用されています。したがって、Drosophila melanogasterサンプルの溶解、細胞破壊、タンパク質抽出、DNAせん断などの分析前の調製ステップを頻繁に実行する必要があります。超音波記憶器は信頼性と効率性に優れており、超音波プロセスパラメータを調整するだけで、溶解、タンパク質抽出、DNA断片化などの様々な作業を簡単に行うことができます。超音波ホモジナイザーは、それにより、幅広い用途に対応する柔軟なツールです。

超音波溶解とタンパク質抽出

溶解、細胞可溶化、組織均質化、タンパク質抽出は、生物学研究室における超音波記憶装置の典型的なタスクです。超音波記憶装置および細胞攪乱器は、動物組織、昆虫(例えば、Drosophila melanogaster、C. elegans)または植物標本を均質化するのに適している。その後の超音波処理の適用は、細胞懸濁液およびペレットの溶解、ならびに細胞内タンパク質の抽出である。
超音波溶解およびタンパク質抽出は、確立されたプロトコルに基づいて実施することができる、非常に信頼性が高く再現性のあるプロセスである。超音波プロセス強度は、振幅、サイクル/パルスモード、温度、サンプル量などの超音波処理パラメータを介して正確に調整できるため、一度証明されたプロトコルを同じ結果で何度も繰り返すことができます。

超音波DNAおよびRNA断片化

細胞溶解およびタンパク質抽出後、サンプル調製で一般的に必要なステップは、DNA、RNA、およびクロマチンの剪断および断片化です(例:クロマチン免疫沈降(ChIP)前)。DNAとRNAの断片化は、物理的な力によってDNAをつなぎ合わせる共有結合を切断することで確実に達成できます。超音波処理などの物理的せん断を使用して、最初にDNA鎖が切断され、次にDNAがより小さな断片に断片化されます。
超音波DNA断片化は、DNAを目標長さ、例えば500bp(塩基対)に剪断する際に信頼性および効率的である。超音波DNA断片化の主な利点は、超音波プロセスパラメータと強度の正確な制御を含む。超音波プロセスパラメータは、超音波処理強度、サイクルおよび時間を正確に調整することによって調整することができる。これにより、所望のDNAサイズを作成することが可能になり、目標とするDNAの長さを確実に生成および再現することができます。超音波DNA剪断は、高分子量DNA断片を作成するのにも理想的です。

ショウジョウバエmelanogasterの超音波溶解のためのプロトコル

以下に、ショウジョウバエサンプルの超音波支援溶解、タンパク質抽出、およびDNAまたはクロマチン断片化のためのさまざまなプロトコルを示します。

架橋免疫沈降(CLIP)アッセイのための超音波溶解

CLIPアッセイは、以前に報告されたように、いくつかの変更を加えて実施しました。生後0〜1日齢の野生型雌の約20 mgの卵巣をUV架橋(3 × 2000 μJ/cm2)し、1 mL RCBバッファー(50 mM HEPES pH 7.4、200 mM NaCl、2.5 mM MgCl2、0.1% Triton X-100、250 mMスクロース、1 mM DTT、1× EDTAフリー完全プロテアーゼ阻害剤、1 mM PMSF)に300 U RNAseOUTを添加し、氷上に30分間置いた。ホモジネートは、ヒールシャー超音波プロセッサを使用して、80%の出力で、20秒のバーストで5回、その間に60秒の休息で超音波処理した UP100H(100W、30kHz) 遠心分離機にかけました(16000 g × g、4°Cで5分間)。可溶性抽出物を20 μLのProtein-Gダイナビーズで4°Cで20分間プレクリアしました。 免疫ブロッティングのためのサンプルを取り出し、RNAインプット(1%)を定量した後、HP1を450 μlのプレクリア抽出物から抗HP1 9A9抗体で免疫沈降させ、50 μlのProtein-G Dynabeadsと4時間インキュベートしました。免疫沈降物をRCBで4回洗浄した。免疫沈降したRNAを溶出するために、ペレット化したビーズを100 μLのUltraPure DEPC処理水で5分間煮沸し、RNA調製のために回収した上清に900 μLのQiazol Reagentを添加しました。精製したRNAは、オリゴdT、ランダムヘキサマー、およびSuperScript逆転写酵素IIIを使用してcDNAを合成するためのテンプレートとして使用されました。
(Cassale et al. 2019)

クロマチン免疫沈降アッセイのための超音波溶解

クロマチン免疫沈降は、Menetが記載した方法に従って、わずかな変更を加えて行った。0〜1日齢の野生型雌の約20 mgの卵巣を、1 mLのNEB緩衝液(pH 8.0の10 mM HEPES-Na、10 mM NaCl、pH 8の0.1 mM EGTA-Na、pH 8の0.5 mM EDTA-Na、1 mM DTT、0.5% NP-40、0.5 mMスペルミジン、0.15 mMスペルミン、1× EDTAフリーの完全プロテアーゼ阻害剤)でホモジナイザー/浸漬分散器1分間(3000 rpm)でホモジナイザー/浸漬分散器でホモジナイザー/浸漬分散器でホモジナイザー/浸漬分散器1分間(3000 rpm)でホモジナイザー/浸漬分散器でホモジナイザー/浸漬分散機でホモジナイザー/浸漬分散機1分間(3000 rpm)でホモジナイザー/浸漬分散機でホモジナイザー/浸漬分散機で1〜1〜3000 rpmでホモジナイザー/浸漬分散機でホモジナイザー/イマージョンディスパーチャーでホモジナイザー1〜10 mの軟化酵素阻害剤でホモジナイザー/浸漬分散機で0.5 mMスペルミジン、0.15 mMスペルミジン、0.15 mMスペルミン、1EDTAフリーの完全プロテアーゼ阻害剤)でホモジナイザー/液浸分散機1〜1分間(3000rpm)でホモジナイザー/液浸分散機でホモジナイザー/浸漬分散機1〜10mの完全プロテアーゼ阻害剤。ホモジネートを事前に冷却したガラス製ダンスに移し、15回のフルストロークをタイトな乳棒で適用しました。次に、遊離核を6000xgで4°Cで10分間遠心分離しました。 核含有ペレットを 1 mL の NEB に再懸濁し、ショ糖勾配 (0.65 mL の 1.6 M スクロースを NEB に、0.35 mL の 0.8 M スクロースを NEB に含ませる)、20000 ×g で 20 分間遠心分離しました。ペレットを 1 mL の NEB とホルムアルデヒドに再懸濁し、最終濃度 1% にしました。核を室温で10分間架橋し、1.375 Mグリシンを1/10 vol添加して急冷しました。核を6000 × gで5分間遠心分離することにより収集した。核を 1 mL の NEB で 2 回洗浄し、1 mL の Lysis Buffer (15 mM HEPES-Na pH 7.6、140 mM NaCl、0.5 mM EGTA、1 mM EDTA (pH 8)、1% Triton X-100、0.5 mM DTT、0.1% Na Deoxycholate、0.1% SDS、0.5% N-lauroylsarcosine および 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors) に再懸濁しました。核は、ヒールシャー超音波プロセッサを使用して超音波処理された UP100H(100W、30kHz) 氷上で20秒、氷上で1分間の6回。超音波処理した核を13000 × gで4°Cで4分間遠心分離しました。 超音波処理されたクロマチンの大部分は、長さが500〜1000塩基対(bp)でした。各免疫沈降について、10 μgのHP1 9A9モノクローナル抗体の存在下で15 μgのクロマチンをインキュベートしました(回転ホイールで4°Cで3時間)。次に、50 μlのダイナビーズプロテインGを添加し、4°Cで一晩インキュベートを続けました。 上清を廃棄し、サンプルを Lysis Buffer で 2 回洗浄し (各洗浄で 4 °C で 15 分間)、TE Buffer で 2 回 (1 mM EDTA、10 mM TrisHCl pH 8) で洗浄しました。クロマチンはビーズから2つのステップで溶出しました。まず、溶出バッファー1 (10 mM EDTA、1% SDS、50 mM TrisHCl、pH 8) 100 μLを65°Cで15分間中、遠心分離して上清を回収します。ビーズ材料を 100 μl の TE + 0.67% SDS で再抽出しました。混合溶出液(200 μl)を65°Cで一晩インキュベートして架橋を逆転させ、50 μg/ml RNaseAで65°Cで15分間、500 μg/ml Proteinase Kで65°Cで3時間処理しました。 サンプルはフェノール-クロロホルムを抽出し、エタノールを沈殿させた。DNAを25μlの水に再懸濁しました。DNA免疫沈降による分子解析を最大化するために、1回の反応で融解温度が類似する2つの異なるプライマーセットを使用して、最適化されたデュプレックスPCRプロトコルにより、候補遺伝子をペアで増幅しました。
(Casale et al. 2019)
 

生体サンプル用の高性能超音波細胞かく乱物質

ヒールシャー超音波は、細胞破壊、溶解、タンパク質抽出、DNA、RNA、およびクロマチン断片化、ならびに他の分析前サンプル調製ステップのための高性能超音波装置に関しては、あなたの長年の経験豊かなパートナーです。超音波ラボホモジナイザーとサンプル調製ユニットの包括的なポートフォリオを提供し、ヒールシャーはあなたの生物学的アプリケーションと要件のための理想的な超音波デバイスを持っています。
のようなマイクロチップを備えた古典的なプローブ型超音波装置 UP200セント (200W;左の写真を参照)または超音波サンプル調製ユニットの1つ バイアルツイーター 又は UP200St_TD_CupHorn VialHolderは、研究および分析ラボでお気に入りのモデルです。従来の超音波プローブは、調製するサンプルが少なくて済み、溶解、抽出、または断片化する必要がある場合に理想的です。サンプル調製ユニット VialTweeter およびUP200St_TD_CupHornは、それぞれ最大10または5バイアルの同時超音波処理を可能にします。
高いサンプル数(例:96ウェルプレート、マイクロタイタープレートなど)を処理する必要がある場合、 UIP400MTP 理想的な超音波処理のセットアップです。このUIP400MTPは、水で満たされ、マイクロウェルプレートを保持するのに十分なスペースがある大きなカップホーンのように機能します。400ワットの強力な超音波プロセッサを搭載したこのUIP400MTPは、細胞を破壊し、サンプルを溶解し、ペレットを可溶化し、タンパク質を抽出し、またはDNAをせん断するために、マルチウェルプレートの非常に均一で強烈な超音波処理を提供します。

スマートソフトウェアによる正確な制御

200ワット以上のすべてのヒールシャー超音波処理ソリューションには、デジタルカラータッチスクリーンとインテリジェントなソフトウェアが装備されています。スマートデータプロトコルを介して、超音波処理装置が開始されるとすぐに、すべての超音波プロセスパラメータは、内蔵SDカードにCSVファイルとして自動的に保存されます。これにより、研究とプロトコールが非常に便利になります。超音波処理試験またはサンプル調製後、各超音波処理実行の超音波処理パラメータを簡単に確認し、それらを比較できます。
直感的なメニューを介して、多数のパラメータを超音波処理の前にプリセットすることができます:例えば、サンプル内の温度を制御し、その熱劣化を防ぐために、サンプル温度の上限を設定することができます。超音波ユニットに付属するプラグ可能な温度センサーは、実際の超音波処理温度に関するフィードバックを超音波プロセッサに与えます。温度の上限に達すると、超音波装置は設定された∆Tの下限に達するまで一時停止し、その後自動的に再び超音波処理を開始します。
特定のエネルギー入力による超音波処理が必要な場合は、超音波処理実行の最終的な超音波エネルギーをプリセットできます。もちろん、超音波脈動やサイクルモードも個別に設定することができます。
最も成功した超音波処理パラメータを再利用するために、さまざまな超音波処理モード(例:超音波処理時間、強度、サイクルモードなど)をプリセットモードとして保存して、簡単かつ迅速に再開することができます。
操作上の利便性を高めるために、すべてのデジタル超音波ユニットは、一般的なブラウザ(InternetExplorer、Safari、Chromeなど)のブラウザリモコンを介して操作できます。LAN接続はシンプルなプラグアンドプレイセットアップで、追加のソフトウェアのインストールは必要ありません。
ヒールシャーでは、生物学的サンプルの成功した超音波処理には精度と再現性が必要であることを知っています。したがって、我々は、効率的で信頼性が高く、再現性があり、便利なサンプル調製を可能にするすべての機能を備えたスマートデバイスとして超音波装置を設計しました。

以下の表は、超音波マイクロチップや古典的な超音波ホモジナイザーからMultiSample超音波装置まで、多数のサンプルの便利で信頼性の高い調製のための超音波システムのおおよその処理能力を示しています。