ショウジョウバエ試料の超音波溶解

ショウジョウバエはモデル生物として研究室で広く使用されている。そのため、ショウジョウバエサンプルの溶解、細胞破砕、タンパク質抽出、DNAせん断などの分析前処理を頻繁に行う必要があります。超音波ホモジナイザーは信頼性と効率性に優れ、超音波処理パラメーターを調整するだけで、溶解、タンパク質抽出、DNA断片化などの様々な作業を簡単に行うことができる。このように、超音波ホモジナイザーは幅広い用途に対応できる柔軟なツールである。

超音波溶解とタンパク質抽出

溶解、細胞可溶化、組織ホモジナイズ、タンパク質抽出は、生物学研究室における超音波破砕機の典型的な作業である。超音波破砕機や細胞破砕機は、動物組織、昆虫（ショウジョウバエ、線虫など）、植物試料のホモジナイズに適している。超音波処理には、細胞懸濁液やペレットの溶解、細胞内タンパク質の抽出などがある。
超音波溶解とタンパク質抽出は、確立されたプロトコールに基づいて実施できる、信頼性と再現性の高いプロセスです。超音波プロセスの強度は、振幅、サイクル／パルスモード、温度、サンプル量などの超音波処理パラメーターによって正確に調整できるため、一度実証されたプロトコルを何度でも同じ結果で繰り返すことができる。

超音波によるDNAとRNAの断片化

細胞溶解とタンパク質抽出の後、クロマチン免疫沈降(ChIP)の前などに、DNA、RNA、クロマチンの剪断と断片化がサンプル調製の一般的な必須ステップとなる。DNAやRNAの断片化は、DNAを結合している共有結合を物理的な力で切断することで確実に達成できる。超音波処理などの物理的剪断を用いると、まずDNA鎖が切断され、次にDNAが断片化される。
超音波DNAフラグメンテーションは、例えば500bp（塩基対）のような、目標とする長さまでDNAを剪断するのに、信頼性が高く効率的である。超音波DNAフラグメンテーションの主な利点は、超音波プロセスパラメーターと強度を正確に制御できることである。超音波処理パラメータは、超音波処理強度、サイクル、時間を正確に調整することで調整できる。これにより、所望のDNAサイズを作成することが可能になり、目的とするDNAの長さを確実に製造し、再現することができる。超音波DNA剪断は、高分子量のDNA断片の作成にも最適です。

ショウジョウバエの超音波溶菌プロトコール

以下に、ショウジョウバエサンプルの超音波アシスト溶解、タンパク質抽出、DNAまたはクロマチン断片化のための各種プロトコルを示します。

架橋免疫沈降(CLIP)アッセイのための超音波溶解

CLIPアッセイは既報の方法で行った。0～1日齢の野生型雌の卵巣約20 mgをUV架橋し（3×2000 μJ/cm2）、1 mLのRCBバッファー（50 mM HEPES pH 7.4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1× EDTA-free Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF）に300 U RNAseOUTを加え、氷上で30分間静置した。Hielscher Ultrasonic Processorを用い、ホモジネートを氷上で、80%の出力で、20秒ずつ5回超音波処理した。 UP100H（100W、30kHz） を加え、遠心した（16000×g、5分間、4℃）。可溶性抽出液を20μlのProtein-G dynabeadsで4℃で20分間前清した。イムノブロットおよびRNAインプットの定量（1%）のためにサンプルを除去した後、50μlのProtein-Gダイナビーズで4時間インキュベートすることにより、450μlの前清澄化抽出液から抗HP1 9A9抗体でHP1を免疫沈降させた。免疫沈降物をRCBで4回洗浄した。免疫沈降したRNAを溶出するために、ペレット化したビーズを100μLのUltraPure DEPC-treated Water中で5分間煮沸し、回収した上清に900μLのQiazol Reagentを加えてRNA調製を行った。精製したRNAを鋳型として、オリゴdT、ランダムヘキサマー、SuperScript逆転写酵素IIIを用いて、メーカーのプロトコールに従ってcDNAを合成した。
(カッサーレ他2019年）

クロマチン免疫沈降アッセイのための超音波溶解

クロマチン免疫沈降は、Menetによって記載された方法に若干の修正を加えて行った。0～1日齢の野生型雌の卵巣約20 mgを1 mLのNEB緩衝液（10 mM HEPES-Na、pH 8.0、10 mM NaCl、0.1 mM EGTA-Na、pH 8、0.5 mM EDTA-Na at pH 8、1 mM DTT、0.5% NP-40、0.5 mM Spermidine、0.15 mM Spermine、1× EDTA- free Complete Protease Inhibitors）をホモジナイザー／浸漬分散機で1分間（3000 rpm）処理した。ホモジネートをあらかじめ冷やしたガラスダウンスに移し、タイトペストルで15回フルストロークした。遊離核を6000xg、4℃で10分間遠心した。核を含むペレットを1 mLのNEBに再懸濁し、ショ糖勾配（NEBの1.6 Mショ糖0.65 mL、NEBの0.8 Mショ糖0.35 mL）上で20000×g、20分間遠心した。ペレットを1 mLのNEBに懸濁し、ホルムアルデヒドを最終濃度1%にした。核を室温で10分間架橋し、1.375 M グリシンを1/10 vol加えてクエンチした。6000×gで5分間遠心して核を回収した。核を1mLのNEBで2回洗浄し、1mLのLysis Buffer（15mM HEPES-Na at pH7.6、140mM NaCl、0.5mM EGTA、1mM EDTA at pH8、1% Triton X-100、0.5mM DTT、0.1% Na Deoxycholate、0.1% SDS、0.5% N-ラウロイルサルコシン、1×EDTA-free Complete Protease Inhibitors）に懸濁した。Hielscher Ultrasonic Processorを用いて核を超音波処理した。 UP100H（100W、30kHz） を6回、氷上で20秒間、1分間行った。超音波処理した核を13000×g、4℃で4分間遠心した。超音波処理したクロマチンの大部分は500から1000塩基対（bp）の長さであった。各免疫沈降のために、15μgのクロマチンを10μgのHP1 9A9モノクローナル抗体存在下でインキュベートした（回転ホイールの中で4℃で3時間）。その後、50μlのdynabeads protein Gを加え、4℃で一晩インキュベーションを続けた。上清を捨て、サンプルをLysis Bufferで2回（各洗浄15分、4℃）、TE Buffer（1 mM EDTA、10 mM TrisHCl、pH 8）で2回洗浄した。クロマチンは2段階でビーズから溶出した。まず、100μlのEluition Buffer 1（10mM EDTA、1% SDS、50mM TrisHCl、pH 8）で65℃、15分間、続いて遠心分離し、上清を回収した。ビーズを100μlのTE+0.67% SDSで再抽出した。合わせた溶出液（200μl）を65℃で一晩インキュベートして架橋を逆転させ、50μg/mlのRNaseAで65℃で15分間、500μg/mlのProteinase Kで65℃で3時間処理した。サンプルをフェノール-クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。DNAは25μlの水に懸濁した。免疫沈降させたDNAを用いた分子解析を最大化するため、候補遺伝子は、最適化された二重PCRプロトコールにより、1回の反応で融解温度が類似した2つの異なるプライマーセットを用いてペアで増幅された。
(カサーレ他2019)
 

生体試料用高性能超音波細胞破砕装置

Hielscher Ultrasonics社は、細胞破砕、溶解、タンパク質抽出、DNA、RNA、クロマチン断片化、その他の分析前サンプル前処理工程用の高性能超音波発生装置に関して、長年の経験を持つパートナーです。超音波ホモジナイザーとサンプル前処理ユニットの包括的なポートフォリオを提供するHielscherは、お客様の生物学的アプリケーションと要件に最適な超音波装置をご用意しています。
のようなマイクロチップを備えた古典的なプローブタイプの超音波発生器。 UP200St (200W;左写真参照)または超音波サンプル前処理ユニット バイアルツイーター または UP200ST_TD_カップホーン は、研究室や分析室で愛用されているモデルです。従来型の超音波プローブは、溶解、抽出、破砕するサンプル数が少ない場合に最適です。サンプル前処理ユニットVialTweeterとUP200St_TD_CupHornは、それぞれ最大10本または5本のバイアルを同時に超音波処理できます。
サンプル数が多い場合（96ウェルプレート、マイクロタイタープレートなど）には UIP400MTP は理想的な超音波処理セットアップです。UIP400MTPは、水を満たした大きめのカップホーンのような機能を持ち、マイクロウェルプレートを保持するのに十分なスペースがあります。400ワットの強力な超音波プロセッサーを搭載したUIP400MTPは、細胞を破砕し、サンプルを溶解し、ペレットを可溶化し、タンパク質を抽出し、DNAをせん断するために、マルチウェルプレートに非常に均一で強力な超音波処理を行います。

スマートソフトウェアによる正確な制御

200ワット以上のすべてのHielscher超音波処理装置は、デジタルカラータッチスクリーンとインテリジェントソフトウェアを装備しています。スマートデータプロトコール機能により、超音波発生装置の起動と同時に、すべての超音波プロセスパラメータが内蔵SDカードにCSVファイルとして自動的に保存されます。これにより、研究やプロトコールがより便利になります。超音波処理試験や試料調製後、各回の超音波処理パラメーターを確認し、比較することができます。
直感的なメニューにより、超音波処理の前に多くのパラメータをプリセットすることができます：例えば、サンプルの温度を制御し、熱劣化を防ぐために、サンプル温度の上限を設定することができます。超音波ユニットに付属のプラグイン式温度センサーが、超音波処理装置に実際の超音波処理温度をフィードバックします。上限温度に達すると、超音波装置は設定した∆Tの下限に達するまで一時停止し、再び自動的に超音波処理を開始します。
特定のエネルギー入力による超音波処理が必要な場合は、超音波処理の最終エネルギーをプリセットすることができます。もちろん、超音波パルスとサイクルモードも個別に設定できます。
最も成功した超音波処理パラメーターを再利用するために、様々な超音波処理モード（例：超音波処理時間、強度、サイクルモードなど）をプリセットモードとして保存することができます。
操作の利便性を高めるため、すべてのデジタル超音波ユニットは、一般的なブラウザ（InternetExplorer、Safari、Chromeなど）のブラウザリモコンで操作できます。LAN接続は簡単なプラグアンドプレイのセットアップで、追加ソフトウェアのインストールは不要です。
Hielscher社は、生物学的サンプルの超音波処理を成功させるためには、精度と再現性が必要であることを知っています。そのため、私たちは、効率的で信頼性が高く、再現性のある便利なサンプル前処理を可能にするあらゆる機能を備えたスマートな装置として超音波発生装置を設計しました。

下の表は、超音波マイクロチップや古典的な超音波ホモジナイザーから、多数のサンプルの便利で信頼性の高い前処理のためのMultiSample超音波発生装置まで、当社の超音波システムのおおよその処理能力を示しています：