超音波によるDNAせん断

DNAおよびRNAのせん断では、長いDNA分子を小さな断片に分割します。これは、次世代シーケンシング（NGS）のライブラリー構築に向けたサンプル調製における重要な工程です。超音波によるDNAせん断では、音響キャビテーションの力を利用して、DNAまたはRNAを100 bp–5 kbの断片に分割します。この方法では断片サイズを精密に制御できるため、最適なシーケンシング結果が得られるよう、目的のDNA長に合わせて調整できます。

超音波処理によるDNAせん断

Hielscher Ultrasonicsは、DNA、RNAおよびクロマチンのせん断に向けた、超音波を利用するさまざまなソリューションを提供しています。マイクロチップを使用して直接超音波処理するプローブ型超音波装置（例：UP100H）を選ぶか、VialTweeterまたは超音波CupHornを使用して、複数の異なるサンプルのDNAを同時に間接的に調製できます。Hielscherは、お客様のニーズに応じた理想的な装置を提供します。サンプル数が1個でも最大10個でも、容量がマイクロリットルからリットルまでのいずれであっても – Hielscherの超音波装置は、適切な長さのDNA、RNAおよびクロマチン断片を調製するための要件を満たします。再現性、簡単な操作、精密な制御により、次世代シーケンシング用の信頼性の高いライブラリーを作製できます。
酵素によるDNA断片化とは異なり、超音波によるせん断では、化学物質を一切添加せず、純粋に機械的なせん断力を加えます。プロセスパラメーターを精密に設定することで、超音波によるせん断は高分子量のDNA断片（プラスミドDNAおよびゲノムDNA）を生成します。
精製した核酸は、断片化工程の前または後に増幅できます。
超音波処理のパラメーター（出力、パルスサイクル／バースト、時間、温度）は、ソフトウェアの設定によって安全に制御できます。

超音波によるDNAせん断のプロトコル

クロマチン免疫沈降アッセイ用

概略として、細胞を直径60mmのディッシュに播種し（各ディッシュ400,000個）、RhoA siRNAをトランスフェクションしました（記載の方法による）。72 h後、タンパク質をDNAに架橋するため、ホルムアルデヒド（最終濃度1%）とともに37°Cで10 minインキュベートしました。1.25 mol/Lグリシンを十分の一容量添加して最終濃度を125 mmol/Lとし、架橋反応を停止しました。細胞を氷冷PBSで二回洗浄し、1 mmol/Lフッ化フェニルメチルスルホニル、1 Ag/mLアプロチニンおよび1 Ag/mLペプスタチンAを含む放射免疫沈降アッセイ用バッファー［150 mmol/L NaCl、1% NP40、0.5%デオキシコール酸塩、0.1% SDS、5 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）］に再懸濁して、氷上で30 min保持しました。その後、細胞溶解液を氷上で Hielscher UP200S 超音波装置（3 x 40 s、振幅40%、サイクル1；Hielscher Ultrasonics GmbH）を用いて、架橋したクロマチンがせん断されて200–1,000 bpのDNA断片が得られるまで超音波処理しました。溶解液全体の十分の一を用いて各サンプルに含まれるDNA量を定量し、これを「総インプットDNA」としました。非特異的なバックグラウンドを低減するため、上清をサケ精子DNA／プロテインアガロースの50%スラリーとともにインキュベートしました。次に、5 Agのanti-NF-nB p65抗体（Upstate）を用いるか、抗体を加えずに（陰性対照）、4°Cで一晩免疫沈降を行いました。これらの上清に5 mol/L NaClを添加し、タンパク質–DNA架橋を解除するため、65°Cで一晩加熱しました。免疫複合体をさらにDNaseおよびRNaseを含まないプロテイナーゼKで処理し、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿によってDNAを精製しました。ヒトiNOS遺伝子のプロモーター領域内の配列に対応する特異的プライマーを用いてPCRを行いました（p1プライマー：5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶；p2プライマー：GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶）。（Doublier et al., 2008）

EGFP発現研究

発現研究では、EGFP（改良型緑色蛍光タンパク質）遺伝子が染色体のssuに組み込まれた組換え株L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12（Jena Bioscience、ドイツ）を、既述のさまざまな培地で培養し、さらに100 mg l^-1 のヌールセオスリシン（Jena Bioscience、ドイツ）を添加しました。培養中に1 mlのサンプルを採取し、遠心分離（2000 × g、20°C、10 min）して、0.9% NaCl溶液で洗浄しました。ペレットをバッファー（20 mM HEPES、5 mM EDTA、2 mM DTT）に再懸濁し、超音波プロセッサー UP400S による超音波処理で破砕しました（エネルギー投入量 ∼ 400 Ws）。細胞残渣を遠心分離（6000 × g、4°C、5 min）で除去し、Laemmli（1970）の方法に従って、12.5%ポリアクリルアミドゲルを用い、還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム – ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分析しました。攪拌培養でEGFP発現を調べました。（Fritsche et al. 2007）

クロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈降アッセイには、ChIP-IT^TM Express（Active Motif、Carlsbad、CA、米国）を使用し、メーカーの指示に一部変更を加えて実施しました。概略として、分化したヒト足細胞を1%ホルムアルデヒドで室温にて10 min架橋しました。細胞を氷冷PBSで洗浄し、0.125 Mグリシンを添加して室温で5 min処理し、固定反応を停止しました。細胞を再び氷冷PBSで洗浄し、ディッシュから掻き取りました。細胞を遠心分離してペレット化し、溶解バッファーに再懸濁しました。遠心分離後、ペレット化した核をせん断用バッファーに再懸濁し、氷上で30 minインキュベートした後、例えば UP100H （Hielscher Ultrasonics GmbH、Teltow、ドイツ）を用い、氷上で出力25%、各20 secのパルスを5回加える超音波処理によって、クロマチンを約200–600 bpの断片にせん断しました。せん断したクロマチンを遠心分離し、上清を回収しました。免疫沈降では、60 μlのクロマチンを1 μgのSp1抗体（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、米国）、NF-κB p65抗体（Abcam、Cambridge、英国）またはNF-κB p50抗体（Abcam）とともに、あるいは陰性対照としてウサギIgG（Zymed Laboratories）とともに、穏やかに回転させながら4°Cで一晩インキュベートしました。磁気ビーズに結合した免疫複合体を磁気スタンドで回収し、十分に洗浄しました。その後、タンパク質／DNA架橋を解除し、リアルタイムPCR分析用にDNAを溶出しました。（Ristola et al. 2009）

チップアレイ分析用のEHEC DNA調製

細胞溶解液および抽出DNAの調製
目的の最終濃度となるようPBSに懸濁した細菌ペレットを、 超音波破砕装置UP100H （Hielscher GmbH、ドイツ）にマイクロチップMS1（直径1mm）を装着して処理しました。動作周波数は30 kHz、有効出力は100 Wでした。処理中、サンプルを氷水浴で冷却し、混合して遠心分離しました。サンプルはフローサイトメトリー研究に使用し、その後の取り扱いに向けて熱処理（95°C、5 min）を行いました。粗細胞溶解液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）の混合液で処理しました。この混合液を溶解液サンプルに等量添加し、溶液を15 s激しくボルテックス混合した後、約22°Cの室温（RT）で15,000 x g、2 min遠心分離しました。ゲノムDNAを含む上層の水相を慎重に分離し、新しい滅菌済みEppendorfチューブに回収しました。
その後、DNAを断片化するため、サンプルを超音波処理しました。超音波処理工程は、上記と同じ条件で実施しました。ゲノムDNAへの断片化の影響を評価するため、サンプルをアガロースゲル電気泳動で分析しました。
（…）事前に2.5 min超音波処理したサンプルに、熱処理と遠心分離の後、抽出工程を実施しました。放出されたDNAをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合液で二回抽出し、その後0–15 minの二度目の超音波処理を行いました。抽出後の超音波断片化を行ったDNAのサイズ分布を、アガロースゲル電気泳動で測定しました（右上の図）。2.5 min以上超音波処理したサンプルでは高分子量バンドが消失し、代わりにDNAスメアが見られたことから、DNAが高度に断片化していることが明らかでした。超音波処理を長くすると、断片長は徐々に約150–600 bpまで短くなり、15 minの超音波処理ではこれらの断片がさらに分解されました。これは主にスメア上部から確認できます。このように、DNA断片の平均サイズは超音波処理時間とともに徐々に小さくなり、5 minの処理によって、チップアレイアッセイに最も適したサイズのDNA断片が得られました。最終的に、最初の2 minの超音波処理、DNA抽出（2×）、続く5 minの超音波処理からなるDNA分析試料の調製手順を確立しました。（Basselet et al. 2008）

クロマチン免疫沈降（ChIP）

HEK293細胞を上述の方法で培養し、2 mMグルタル酸ジスクシンイミジルで室温にて45 min固定しました。その後、細胞をPBSで二回洗浄しました。1%（v/v）ホルムアルデヒドを用いて室温で10 minクロマチンを架橋し、氷冷PBSで二回洗浄しました。最終濃度0.125 Mのグリシンとともに室温で5 minインキュベートし、架橋反応を停止しました。トリプシンとともにインキュベートした後、細胞を細胞培養ディッシュから掻き取り、PBSで二回洗浄しました。細胞ペレットを溶解バッファー（5 mM Pipes、pH 8.0、85 mM KCl、0.5%（v/v）Nonidet P-40）に再懸濁し、氷上で10 minインキュベートして、Dounceホモジナイザーでホモジナイズしました。その後、遠心分離（3500 x g、5 min、4 °C）で核をペレット化し、核用バッファー（50 mM Tris-HCl、pH 8.1、10 mM EDTA、1%（w/v）SDS）に再懸濁しました。核の破砕には、20 sのパルスを三回加える超音波処理を行うために、 UP50H超音波装置 （Hielscher Ultraschall Technologie）をサイクル0.5、振幅30%の設定で使用し、主なサイズが200 – 1000 bpのゲノムDNA断片を得ました。ChIPでは、50gのDNAを免疫沈降バッファー（16.7 mM Tris-HCl、pH 8.1、167 mM NaCl、1.2 mM EDTA、1.1%（v/v）Triton X-100、0.01%（w/v）SDS）で4倍に希釈しました。（Weiske et al. 2006）

クロマチン免疫沈降（ChIP）によるヒストン修飾分析

概略として、6 x 10⁶ 個の細胞をPBSで二回洗浄し、0.5%ホルムアルデヒド存在下で、培養プレート上にて室温で15 min架橋しました。0.125 Mグリシンを添加して架橋反応を停止しました。その後のすべての工程は48°Cで実施しました。すべてのバッファーは事前に冷却し、プロテアーゼ阻害剤（Complete Mini、Roche）を含めました。細胞をPBSで二回洗浄した後、掻き取りました。回収したペレットを1 mlの溶解バッファー（1% SDS、5 mM EDTA、50 mM Tris pH 8）に溶解し、冷却したエタノール浴中で振幅100%、10サイクルの超音波処理を行うため、 UP50H超音波装置 （Hielscher、Teltow、ドイツ）を用いました。クロマチンの断片化を1%アガロースゲルで可視化しました。得られた断片のサイズ範囲は200–500pbでした。超音波処理したサンプルを48°Cで14,000g、10 min遠心分離して、可溶性クロマチンを得ました。可溶性画分を希釈バッファー（1% Triton X-100、2 mM EDTA、20 mM Tris pH 8、150 mM NaCl）で1/10に希釈し、分注して使用時まで80°Cで保存しました。（Rodriguez et al. 2008）