超音波DNAシャーリング

• DNAとRNAのせん断では、DNA分子が細かく砕かれます。DNA/RNAの断片化は、次世代シーケンシング(NGS)用のライブラリを作成するために必要な重要なサンプル調製ステップの1つです。
• 超音波DNAのせん断はDNAまたはRNAを100の部分に分解するのに音響キャビテーションの力を使用します – 5キロバイトBPの
• 超音波剪断は、正確なDNA断片化および所望のDNA長への適応を可能にする。

超音波処理を使用したDNAせん断

ヒールシャー超音波は、DNA、RNAおよびクロマチンのせん断のための様々な超音波ベースのソリューションを提供しています。プローブタイプの超音波装置(例えば、 UP100H)マイクロチップを使用した直接超音波処理の場合、または使用してください VialTweeeter または超音波カップホーン さまざまなサンプルの間接的なDNA調製に同時に。ヒールシャーは、あなたのニーズを考慮した理想的なデバイスを提供しています:あなたが1または最大10のサンプル、マイクロリットルからリットルのボリュームまでのボリュームを持っているかどうか – ヒールシャー超音波プロセッサは、適切な長さでDNA、RNAおよびクロマチンフラグメントを調製するための要件を満たすために利用可能です。再現性、簡単な操作、正確な制御により、次世代シーケンシングのための信頼性の高いライブラリが可能になります。
酵素的DNA断片化とは対照的に、超音波剪断は、化学物質を添加することなく純粋な機械的剪断力を適用します。プロセスパラメータの正確な設定により、超音波剪断は高分子量DNA断片(プラスミドおよびゲノムDNA)を生成します。
精製された核酸は、フラグメンテーションステップの前または後に増幅できます。
超音波処理パラメータ(電力、パルスサイクル/バースト、時間、温度)は、ソフトウェア設定を介して安全に制御できます。

超音波DNAのせん断のためのプロトコル

クロマチン免疫沈降アッセイ用

簡単に説明すると、細胞を直径60mmの皿(皿あたり400,000個)に播種し、RhoA siRNA(記載されている通り)をトランスフェクションしました。72時間後、ホルムアルデヒド(最終濃度1%)と37°Cで10分間インキュベートし、タンパク質をDNAに架橋しました。架橋反応は、1.25 mol/Lのグリシンを10分の1容量添加することで急冷し、最終濃度は125 mmol/Lでした。細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、1 mmol/L フェニルメチルスルホニルフルオリド、1 Ag/mLアプロチニン、および1 Ag/mL pepstatin Aを含む放射性免疫沈降アッセイバッファー[150 mmol/L NaCl、1% NP40、0.5%デオキシコールレート、0.1% SDS、5 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)]に再懸濁し、氷上に30分間保持しました。次に、細胞ライセートを氷上で超音波処理しました。 ヒールシャーUP200S 超音波超音波ソニケーター(3 x 40秒、振幅40%、サイクル1;Hielscher Ultrasonics GmbH)は、架橋クロマチンを剪断して200〜1,000 bpのDNA断片を生成するまで続けました。全ライセートの10分の1を使用して、さまざまなサンプルに存在するDNAの量を定量し、次のように考えました。 “全インプットDNA”.上清をサケ精子DNA/タンパク質アガロース-50%スラリーとインキュベートして、非特異的バックグラウンドを低減しました。その後、免疫沈降を 4°C で 5 Ag の抗 NF-nB p65 (アップステート) または抗体なし (ネガティブコントロール) で一晩行いました。これらの上清に5 mol/L NaClを添加し、65°Cで一晩加熱してタンパク質-DNA架橋を戻しました。免疫複合体をさらにDNaseおよびRNaseを含まないプロテイナーゼKで処理し、DNAをフェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって精製しました。PCRは、ヒトiNOS遺伝子のプロモーター領域内の配列に対応する特異的プライマーを用いて行った(p1プライマー:5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶;p2プライマー:GCTGGGCTACTGACCCAG-CAGTTCCAG-3¶)。(Doublierら、2008年)

EGFP発現試験

発現研究では、EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) の遺伝子である染色体 ssu を統合した組換え株 L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Germany) を、前述のようにさまざまな培地で培養し、さらに 100 mg l を添加しました^-1 Nourseothricin (Jena Bioscience、ドイツ)。培養中に1 mLのサンプルを採取し、遠心分離(2000 × g、20°C、10分)し、0.9% NaCl溶液で洗浄しました。ペレットをバッファー(20 mM HEPES、5 mM EDTA、2 mM DTT)に再懸濁し、超音波プロセッサによる超音波処理により崩壊させた UP400Sの (エネルギーの適用 ∼ 400 Ws)。細胞破片を遠心分離(6000 × g、4°C、5分)で除去し、12.5%ポリアクラミドゲルを用いたLaemli(1970)の方法に従って還元条件下でドデシルナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分析しました。EGFP発現を撹拌培養中で検討した。(Fritsche et al. 2007)

クロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈降アッセイは、ChIP-ITを用いて行いました。^{ティッカー} エクスプレス(アクティブモチーフ、カールスバッド、カリフォルニア州、米国)製造元の指示に従って、いくつかの変更を加えます。簡単に説明すると、分化したヒト有蓋細胞を室温で10分間、1%ホルムアルデヒドと架橋しました。細胞を氷冷PBSで洗浄し、0.125 Mグリシンを室温で5分間添加して固定反応を停止しました。細胞を氷冷PBSで再度洗浄し、皿から掻き取りました。細胞を遠心分離によりペレット化し、溶解バッファーに再懸濁しました。遠心分離後、ペレット化した核を剪断緩衝液に再懸濁し、氷上で30分間インキュベートし、クロマチンを超音波処理によって剪断した。 UP100Hの (Hielscher Ultrasonics GmbH、Teltow、Germany)25%パワーで、氷上でそれぞれ20秒の5パルスを約200〜600 bpの断片にしました。次に、せん断されたクロマチンを遠心分離し、上清を回収しました。免疫沈降のために、60 μlのクロマチンを1 μgのSp1(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)、NF-κB p65(Abcam, Cambridge, UK)またはNF-κB p50(Abcam)抗体、またはウサギIgG(Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA)とネガティブコントロールとして、4°Cで一晩、穏やかに回転させてインキュベートしました。磁気ビーズに結合した免疫複合体を磁気スタンドを用いて採取し、広範囲に洗浄した後、タンパク質/DNA架橋を逆にしてDNAを溶出し、リアルタイムPCR解析を行いました。(Ristola et al. 2009)

チップアレイ解析のためのEHEC DNA調製

細胞ライセートと抽出DNAの配列
PBSに所望の最終濃度まで懸濁した細菌ペレットを、 超音波破壊器 UP100H (Hielscher GmbH、ドイツ)マイクロチップMS1(直径1mm)を装備。動作周波数は30kHz、実効出力電力は100Wでした。手術中、サンプルを氷水浴で冷却し、混合して遠心分離しました。サンプルはフローサイトメトリー研究に利用され、後の取り扱いではサンプルを熱処理(95°C、5分)しました。粗細胞溶解物は、フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)の混合物で処理されました。この混合物を等量をライセートサンプルに添加し、溶液を15秒間激しくボルテックスし、15,000 x gで室温(RT)約22°Cで2分間遠心分離しました。 ゲノムDNAを含む上部の水相を慎重に分離し、新しい滅菌エッペンドルフチューブに収集しました。
続いて、サンプルを超音波処理してDNAを断片化しました。超音波処理ステップは、上記と同じ条件で実現した。ゲノムDNAに対するフラグメンテーションの影響を評価するために、アガロースゲル電気泳動を使用してサンプルを分析しました。
(…)試料を予め2.5分間超音波処理し、熱処理および遠心分離後に抽出工程に供した。放出されたDNAをフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール混合物で2回抽出し、その後、0〜15分間2回目の超音波処理を行った。アガロースゲル電気泳動を用いて、抽出後の超音波断片化に供したDNAのサイズ分布を決定した(右上の図)。高度に断片化されたDNAは、2.5分以上超音波処理されたサンプルから除去された高分子量バンドではなく、DNA塗抹標本の存在から明らかでした。より長い超音波処理は、断片の長さを徐々に約150〜600bpに減少させ、15分間の超音波処理は、主に塗抹標本の上部によって見られるように、これらの断片をさらに劣化させた。したがって、平均DNA断片サイズは、超音波処理時間および5分間の処理により、チップアレイアッセイに最も適したDNA断片のサイズを得ることができた。最後に、最初の2分間の超音波処理、DNA抽出(2×)、およびその後の5分間の超音波処理を含むDNA分析物調製手順が確立されました。(Basselet et al. 2008)

クロマチン免疫沈降(ChIP)

HEK293細胞を上記のように培養し、室温で2 mMジスクシンイミジル-グルタル酸で45分間固定しました。続いて、細胞をPBSで2回洗浄した。クロマチンを1%(v/v)ホルムアルデヒドを用いて室温で10分間架橋し、氷冷PBSで2回洗浄しました。架橋反応は、最終濃度0.125 Mのグリシンと室温で5分間インキュベートすることにより停止しました。トリプシンとインキュベートした後、細胞を細胞培養皿から掻き取り、PBSで2回洗浄した。細胞ペレットを溶解バッファー(5 mM Pipes、pH 8.0、85 mM KCl、0.5%(v/v)Nonidet P-40)に再懸濁し、氷上で10分間インキュベートした後、Dounceホモジナイザーでホモジナイザー化しました。その後、核を遠心分離(3500 x g、5分、4°C)でペレット化し、核緩衝液(50 mM Tris-HCl、pH 8.1、10 mM EDTA、および1%(w / v)SDS)に再懸濁しました。核は、3つの20-sパルスによる超音波処理によって破壊されました。 UP50H ソニケーター (Hielscher Ultraschall Technologie)サイクル0.5および振幅30%の設定で、200〜1000 bpのバルクサイズのゲノムDNA断片を生成します。ChIPについては、免疫沈降バッファー(16.7 mM Tris-HCl、pH 8.1、167 mM NaCl、1.2 mM EDTA、1.1%(v/v)Triton X-100、および0.01%(w/v)SDS)で50gのDNAを4倍に希釈しました。(Weiske et al. 2006)

クロマチン免疫沈降法(ChIP)によるヒストン修飾解析

簡単に言うと、6 x 10⁶ 細胞をPBSで2回洗浄し、0.5%ホルムアルデヒドの存在下で室温で15分間培養プレート上で架橋しました。架橋反応は、0.125 Mグリシンを添加して停止しました。その後のステップはすべて48°Cで実施しました。 すべてのバッファーは事前に冷却され、プロテアーゼ阻害剤(Complete Mini、Roche)が含まれていました。細胞をPBSで2回洗浄した後、掻き取りました。回収したペレットを1mlの溶解緩衝液(1%SDS、5mM EDTA、50mM Tris pH 8)に溶解し、冷エタノール浴中で100%振幅で10サイクル超音波処理した。 UP50H ソニケーター (ヒールシャー、テルトウ、ドイツ)。クロマチンの断片化を1%アガロースゲルで可視化しました。得られたフラグメントは200〜500pbの範囲でした。可溶性クロマチンは、超音波処理したサンプルを14,000gで48°C、10分間遠心分離することにより得られました。 可溶性画分を希釈バッファー(1% Triton X-100、2 mM EDTA、20 mM Tris pH 8、150 mM NaCl)で1/10に希釈し、分注して使用まで80°Cで保存しました。(ロドリゲスら、2008)