超音波DNAシャーリング

DNAおよびRNAのせん断では、長いDNA分子が断片化される。これは、次世代シーケンシング（NGS）ライブラリー構築のためのサンプル調製において極めて重要なステップである。超音波DNAシャーリングでは、音響キャビテーション力を利用してDNAやRNAを100 bpから5 kbの断片に分断します。この方法により、断片のサイズを正確に制御することができ、最適なシーケンス結果を得るために必要なDNAの長さにカスタマイズすることが容易になります。

超音波によるDNAの剪断

Hielscher Ultrasonics社は、DNA、RNA、クロマチンシェアリング用の様々な超音波ベースのソリューションを提供しています。マイクロチップを使用して直接超音波処理を行うプローブタイプの超音波装置（UP100Hなど）、または様々なサンプルを同時に間接的にDNA調製するためのVialTweeeterまたは超音波カップホーンをお選びください。Hielscher社は、お客様のニーズを考慮した理想的な装置を提供します：1検体から最大10検体まで、マイクロリットルからリットル容量まで – Hielscher社のソニケーターは、DNA、RNA、クロマチン断片を適切な長さで調製するためのご要望にお応えします。再現性、簡単な操作、正確な制御により、次世代シーケンシング用の信頼性の高いライブラリーが得られます。
酵素的DNA断片化とは対照的に、超音波剪断法は化学薬品を一切加えることなく、純粋な機械的剪断力を加える。プロセスパラメーターを正確に設定することにより、超音波せん断は高分子量のDNA断片（プラスミドおよびゲノムDNA）を生成する。
精製した核酸は、断片化工程の前または後に増幅することができる。
ソニケーション・パラメーター（パワー、パルス・サイクル／バースト、時間、温度）は、ソフトウェア設定により安全に制御できます。

超音波DNA剪断のプロトコール

クロマチン免疫沈降アッセイ用

72時間後、タンパク質をDNAに架橋させるため、37℃で10分間ホルムアルデヒド（最終濃度1%）とインキュベートした。架橋反応は1.25mol/Lのグリシンを10分の1量加えることでクエンチされ、最終濃度は125mmol/Lとなった。細胞を氷冷したPBSで2回洗浄し、1mmol/Lフェニルメチルスルホニルフルオリド、1Ag/mLアプロチニン、1Ag/mLペプスタチンAを含む放射免疫沈降アッセイバッファー［150mmol/L NaCl、1% NP40、0.5%デオキシコレート、0.1% SDS、5mmol/L EDTA、50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）］に再懸濁し、氷上で30分間静置した。その後、細胞溶解液を氷上で超音波処理した。 ヒルシャーUP200S 超音波ソニケーター（3 x 40秒、振幅40%、サイクル1；Hielscher Ultrasonics GmbH）で、架橋したクロマチンが剪断され、200～1,000 bpのDNA断片が得られるまで行った。全ライセートの10分の1を、異なるサンプルに存在するDNA量を定量するために使用し、以下のように考えた。 “総インプットDNA”.上清をサケ精子DNA/タンパク質アガロース-50%スラリーとインキュベートし、非特異的バックグラウンドを減少させた。その後、5Agの抗NF-nB p65（Upstate）または抗体なし（ネガティブコントロール）を用いて、4℃で一晩免疫沈降を行った。これらの上清に5mol/L NaClを加え、65℃で一晩加熱してタンパク質-DNA架橋を戻した。免疫複合体はさらに、DNaseとRNaseを含まないプロテイナーゼKで処理し、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿によってDNAを精製した。ヒトiNOS遺伝子のプロモーター領域内の配列に対応する特異的プライマーを用いてPCRを行った（p1プライマー：5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶；p2プライマー：GCTGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶）。(Doublier et al., 2008)

EGFP発現研究

発現研究のために、染色体ssuが組み込まれたEGFP（増強型緑色蛍光タンパク質）の遺伝子を有する組換え株L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12（Jena Bioscience、ドイツ）を、前述のように種々の培地で培養し、さらに100 mg l^-1 Nourseothricin（Jena Bioscience、ドイツ）。培養中、1mlのサンプルを採取し、遠心分離（2000×g、20℃、10分）し、0.9%NaCl溶液で洗浄した。ペレットをバッファー（20 mM HEPES、5 mM EDTA、2 mM DTT）に懸濁し、超音波プロセッサーで超音波処理することにより崩壊させた。 UP400S (エネルギー印加〜400Ws）。細胞残屑は遠心分離（6000×g、4℃、5分）により除去し、12.5％ポリアクリルアミドゲルを用い、Laemmli（1970）の方法に従い、還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により分析した。EGFP発現は攪拌培養で調べた。(Fritsche et al. 2007)

クロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈降アッセイは、ChIP-IT^TM Express（Active Motif, Carlsbad, CA, USA）を使用した。簡単に説明すると、分化したヒトポドサイトを1％ホルムアルデヒドで室温で10分間架橋した。細胞を氷冷PBSで洗浄し、0.125Mグリシンを室温で5分間加えて固定反応を停止させた。細胞を氷冷PBSで再度洗浄し、ディッシュから掻き出した。細胞を遠心分離でペレット化し、溶解バッファーに再懸濁した。遠心後、ペレット化した核を剪断バッファーに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートした後、超音波処理（例）によりクロマチンを剪断した。 UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Germany)を用いて、氷上で25%の出力で20秒ずつ5回パルスし、約200-600 bpの断片にした。その後、剪断したクロマチンを遠心分離し、上清を回収した。免疫沈降のために、60μlのクロマチンを、1μgのSp1（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA）、NF-κB p65（Abcam, Cambridge, UK）またはNF-κB p50（Abcam, Cambridge, UK）抗体、あるいは陰性対照としてウサギIgG（Zymed Laboratories）と、穏やかに回転させながら4℃で一晩インキュベートした。磁気ビーズに結合した免疫複合体を磁気スタンドで回収し、広範囲に洗浄した後、タンパク質/DNA架橋を反転させ、リアルタイムPCR解析のためにDNAを溶出した（Ristola et al.(Ristola et al. 2009)

チップアレイ分析用のEHEC DNA調製

細胞溶解液と抽出DNAの配列
所望の最終濃度になるようにPBSに懸濁した細菌ペレットを、以下の方法で処理した。 超音波破壊装置 UP100H (Hielscher GmbH、ドイツ）にマイクロチップMS1（直径1mm）を取り付けた。動作周波数は30kHz、有効出力は100Wであった。動作中、サンプルは氷水浴で冷却され、混合され、遠心分離された。サンプルはフローサイトメトリー研究に利用され、後の処理ではサンプルは熱処理（95℃、5分間）にかけられた。粗細胞溶解液は、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）の混合液で処理した。この混合液の等容量をライセートサンプルに加え、溶液を15秒間激しくボルテックスし、室温（RT）22℃付近で15,000 x gで2分間遠心した。ゲノムDNAを含む上部の水相を注意深く分離し、新しい滅菌エッペンドルフチューブに集めた。
その後、サンプルを超音波処理してDNAを断片化した。超音波処理ステップは、上述と同じ条件で行った。ゲノムDNAの断片化効果を評価するため、アガロースゲル電気泳動を用いてサンプルを分析した。
(…分間超音波処理したサンプルは、熱処理と遠心分離の後、抽出工程に供した。放出されたDNAは、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合溶媒で2回抽出し、その後0～15分間2回目の超音波処理を行った。アガロースゲル電気泳動を用いて、抽出後の超音波断片化を受けたDNAのサイズ分布を測定した（右上の図）。2.5分以上超音波処理したサンプルでは、高分子量のバンドが消失するのではなく、DNAのスメアが存在することから、高分解能で断片化したDNAが明らかになった。超音波処理を長くすると、断片の長さは徐々に短くなり、約150～600 bpになった。15分間超音波処理を行うと、スメアの上部に見られるように、これらの断片はさらに分解された。このように、平均DNA断片サイズは超音波処理の時間と共に徐々に減少し、5分間の処理により、チップアレイアッセイに最も適したサイズのDNA断片を得ることができた。最終的に、最初の2分間の超音波処理、DNA抽出（2×）、その後の5分間の超音波処理からなるDNA分析物調製手順が確立された。(Basselet et al. 2008)

クロマチン免疫沈降(ChIP)

HEK293細胞を上記のように培養し、2mMジスクシンイミジルグルタル酸で室温で45分間固定した。その後、細胞をPBSで2回洗浄した。クロマチンを1% (v/v) ホルムアルデヒドを用いて室温で10分間架橋し、氷冷PBSで2回洗浄した。最終濃度0.125 Mのグリシンと室温で5分間インキュベートすることにより、架橋反応を停止させた。トリプシンとのインキュベーション後、細胞を細胞培養ディッシュから掻き取り、PBSで2回洗浄した。細胞ペレットを溶解バッファー（5 mM Pipes, pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% (v/v) Nonidet P-40）に懸濁し、氷上で10分間インキュベートした後、Dounceホモジナイザーでホモジナイズした。その後、核を遠心分離（3500 x g、5分、4℃）でペレット化し、核バッファー（50 mM Tris-HCl、pH 8.1、10 mM EDTA、1%(w/v)SDS）に再懸濁した。で20秒パルスを3回超音波処理し、核を破砕した。 UP50H ソニケーター (Hielscher Ultraschall Technologie)を用いてサイクル0.5、振幅30%に設定し、200～1000 bpのゲノムDNA断片を得た。ChIPでは、50gのDNAを免疫沈降バッファー（16.7 mM Tris-HCl、pH 8.1、167 mM NaCl、1.2 mM EDTA、1.1%(v/v) Triton X-100、0.01%(w/v) SDS）で4倍に希釈した（Weiske et al. 2006）。

クロマチン免疫沈降法（ChIP）によるヒストン修飾解析

簡単に言うと、6×10⁶ 細胞をPBSで2回洗浄し、0.5％ホルムアルデヒド存在下、室温で15分間培養プレート上で架橋した。架橋反応は0.125Mグリシンを加えることで停止させた。その後の全ての工程は48℃で行った。全ての緩衝液はあらかじめ冷やされ、プロテアーゼ阻害剤（Complete Mini, Roche）を含んでいた。細胞をPBSで2回洗浄した後、掻き出した。回収したペレットを1mlの溶解バッファー（1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8）に溶解し、冷エタノールバス中、100%の振幅で10サイクル、超音波処理した。 UP50H ソニケーター (Hielscher、Teltow、ドイツ）。クロマチン断片化は1％アガロースゲルで可視化した。得られた断片は200-500pbの範囲であった。可溶性クロマチンは、超音波処理したサンプルを14,000g、48℃で10分間遠心分離して得た。可溶性画分を希釈バッファー（1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl）で1/10に希釈し、使用するまで80℃で保存した。(Rodriguez et al. 2008)