超音波DNAシャーリング

超音波DNAシャーリング

ヒールシャー超音波は、DNA、RNAおよびクロマチン断片化のための様々な超音波ベースのソリューションを提供しています。マイクロチップを用いた直接超音波処理のためのプローブ型ultrasonicators（例えばUP100H）との間で選択するか、VialTweeeter又は同時に種々のサンプルの間接的なDNAの調製のための超音波cuphornを使用します。ヒールシャーは、あなたのニーズを考慮し、理想的なデバイスを提供しています：あなたは1を持っているか、リットルのボリュームへのマイクロリットルから最大10個のサンプル、ボリュームの天気を – ヒールシャー超音波プロセッサ右の長さで、DNA、RNAおよびクロマチンフラグメントを調製するためにあなたの要件を満たすことが可能です。再現性、簡単な操作と正確なコントロールは、次世代シーケンシングのための信頼性の高いライブラリーを可能にします。
酵素DNA断片化とは対照的に、超音波剪断は、任意の化学物質を添加することなく、純粋な機械的せん断力を加えます。プロセスパラメータの正確な設定によって、超音波剪断は、高分子量DNA断片（プラスミドおよびゲノムDNA）を生成します。
精製された核酸は、前または断片化工程の後に増幅することができます。
超音波処理パラメータ（電力、パルス周期/バースト、時間及び温度）は、ソフトウェア設定を介して安全に制御することができます。

超音波DNAシャーリングのためのプロトコル

クロマチン免疫沈降アッセイのために

簡潔に述べると、細胞を直径60mmの皿（皿あたり400,000個）に播種し、RhoA siRNAでトランスフェクトした（記載の通り）。 72時間後、それらをホルムアルデヒド（最終濃度1％）と共に37℃で10分間インキュベートし、タンパク質をDNAに架橋させた。架橋反応を1/10容量の1.25mol / Lグリシンを添加することによりクエンチし、最終濃度125mmol / Lを得た。細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、放射免疫沈降アッセイ緩​​衝液[150mmol / L NaCl、1％NP40,0.05％デオキシコール酸塩、0.1％SDS、5mmol / L EDTA、50mmol / L Tris-HCl（pH8.0 ）] 1mmol / Lフェニルメチルスルホニルフルオライド、1μg/ mLアプロチニンおよび1μg/ mLペプスタチンAを含み、氷上で30分間維持した。次いで、細胞溶解物を氷上で ヒールシャーUP200S 超音波処理（3×40秒、振幅40％、サイクル1;ヒールシャー超音波社）架橋されたクロマチンまでは200から1,000塩基対の間でDNA断片を得るために剪断しました。全溶解物の10分の1は、異なるサンプル中に存在するDNAの量を定量するために使用されるとみなしました “全入力DNA”。上清を、非特異的バックグラウンドを低減するためにサケ精子DNA /プロテインアガロース50％スラリーとインキュベートしました。免疫沈降を抗NF-NBのP65（Upstate社）または抗体なし（陰性対照）の5 Agを4℃で一晩行いました。これらの上清は、5モル/ LのNaClを補充し、タンパク質-DNA相互リンクを元に戻すために65℃で一晩加熱しました。免疫複合体はさらにDNase-およびRNaseを含まないプロテイナーゼKで処理し、DNAをフェノール/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により精製しました。 PCRは、ヒトiNOS遺伝子のプロモーター領域内の配列に対応する特異的プライマーを用いて行った（P1プライマー：5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; P2プライマー：GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶）。 （Doublierら、2008）

EGFP-発現研究

前述したように発現研究、組換え株のL. tarentolaeのP10 ::＃12 F9Begfp1.4dBsat（イエナバイオサイエンス、ドイツ）EGFP（強化緑色蛍光タンパク質）の遺伝子を持つために、染色体は、様々なメディアで栽培された、統合SSUとさらに100mgのLを補充^-1 ヌーセオスリシン（イエナバイオサイエンス、ドイツ）。培養中、1mLの試料を、採取、遠心分離（2000×gで、20°C、10分）、0.9％NaCl溶液で洗浄しました。ペレットを緩衝液（20mMのHEPES、5mMのEDTA、2mMのDTT）に再懸濁し、超音波処理を用いて超音波処理によって崩壊しました UP400S （エネルギーの応用〜400 WS）。 12.5％polyacralamideゲルとのLaemmliの方法（1970）に従って還元条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE） - 細胞の破片を遠心分離（6000×gで、4℃、5分）によって除去し、ドデシル硫酸ナトリウムによって分析しました。 EGFP発現は、撹拌培養で調べました。 （Fritscheら、2007）

クロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈降アッセイは、チップ-ITを使用して行きました^Tm いくつかの変更を加えて、製造業者の指示に従って（アクティブモチーフ、カールスバッド、CA、USA）を発現します。手短に言えば、人間の足細胞を室温で10分間1％ホルムアルデヒドで架橋された分化しました。細胞を氷冷PBSで洗浄し、固定反応を室温で5分間、0.125 Mグリシンを添加することによって停止させました。細胞を氷冷PBSで再度洗浄し、皿から掻き取りました。細胞を遠心分離によりペレット化し、溶解緩衝液中に再懸濁しました。遠心分離後、ペレット核を、剪断緩衝液に再懸濁し、氷上で30分間インキュベートし、クロマチンは、例えば、超音波処理により剪断しました UP100H （Hielscher Ultrasonics GmbH、Teltow、Germany）を用いて、氷上でそれぞれ20秒の25％パワー5パルスで、約200〜600bpの断片に切断した。剪断したクロマチンを次に遠心分離し、上清を回収した。免疫沈降のために、60μlのクロマチンを1μgのSp1（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA、USA）、NF-κBp65（Abcam、Cambridge、UK）またはNF-κBp50（Abcam）抗体またはウサギIgG（Zymed Laboratories、South San Francisco、CA、USA）をネガティブコントロールとして、穏やかに回転させながら4℃で一晩インキュベートした。磁気ビーズに結合した免疫複合体を磁気スタンドを用いて収集し、広範囲に洗浄し、タンパク質/ DNA架橋を逆転させ、リアルタイムPCR分析のためにDNA溶出した。 （Ristolaら、2009年）

チップアレイ分析のためのEHEC DNA調製

細胞溶解物および抽出したDNAの配列
所望の最終濃度になるようにPBSに懸濁し、細菌ペレットを用いて処理しました 超音波破砕UP100H （Hielscher GmbH、Germany）にマイクロチップMS1（直径1mm）を装着した。動作周波数は30kHzであり、有効出力電力は100Wであった。動作中、試料を氷水浴中で冷却し、混合し、遠心分離した。サンプルはフローサイトメトリー研究のために利用され、後の処理のためにサンプルは熱処理（95℃、5分）に付された。粗細胞溶解物をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）の混合物で処理した。この混合物の等量を溶解物サンプルに添加し、溶液を15秒間激しくボルテックスし、室温（RT）約22℃で15,000×gで2分間遠心分離した。ゲノムDNAを含む上部の水相を注意深く分離し、新しい滅菌エッペンドルフチューブに集めた。
続いて、サンプルを超音波処理してDNAを断片化した。超音波処理工程は、上記と同じ条件で実現された。ゲノムDNAに対する断片化効果を評価するために、アガロースゲル電気泳動を用いて試料を分析した。
（…）2.5分間前に超音波処理された試料を、熱処理および遠心分離後に抽出工程に付した。放出されたDNAをフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合物で2回抽出し、その後0〜15分間2回目の超音波処理を行った。アガロースゲル電気泳動を使用して、抽出後の超音波破砕を受けたDNAのサイズ分布を決定した（図の右上）。高度に断片化されたDNAは、2.5分以上超音波処理された試料から排除された高分子量バンドよりもむしろDNAスミアの存在から明らかであった。より長い音波処理は、約150〜600bpまで徐々に断片長を減少させ、15分間の超音波処理は、これらの断片をさらに分解した。これは、ほとんどがスメアの上部によって見られる。従って、平均DNAフラグメントサイズは、超音波処理時間と共に徐々に低下し、5分間の処理により、チップアレイアッセイに最も適したDNAフラグメントのサイズが得られた。最後に、最初の2分間の超音波処理、DNA抽出（2×）、およびその後の5分間の超音波処理を含むDNA分析物調製手順を確立した。 （Basselet et al。2008）

クロマチン免疫沈降（チップ）

HEK293細胞を上記のように培養し、室温で45分間2mMジスクシンイミジル - グルタレートで固定した。その後、細胞をPBSで2回洗浄した。クロマチンを1％（v / v）ホルムアルデヒドを用いて室温で10分間架橋させ、氷冷PBSで2回洗浄した。室温で5分間、0.125Mの最終濃度のグリシンとのインキュベーションによって、架橋反応を停止させた。トリプシンとインキュベートした後、細胞を細胞培養皿から掻き取り、PBSで2回洗浄した。細胞ペレットを溶解緩衝液（5mM Pipes、pH8.0,85mM KCl、および0.5％（v / v）Nonidet P-40）に再懸濁し、氷上で10分間インキュベートし、Dounceホモジナイザーでホモジナイズした。その後、遠心分離（3500×g、5分、4℃）により核をペレット化し、核緩衝液（50mM Tris-HCl、pH8.1,10mM EDTA、および1％（w / v）SDS）中に再懸濁した。核を3回の20秒間のパルスで超音波処理することにより破壊した UP50H超音波処理 サイクル0.5の設定で（ヒールシャーUltraschallテク）と200のバルクサイズを有するゲノムDNA断片を得、30％の振幅 - 1000bpの。チップに対して、DNAの50グラムを、免疫沈降緩衝液中で4倍に希釈した（16.7 mMトリス塩酸、pHが8.1、167 mMの塩化ナトリウム、1.2mMのEDTA、1.1％（v / v）のトリトンX-100、および0.01％（W / v）のSDS）。 （Weiskeら。2006）

クロマチン免疫沈降によるヒストン修飾の解析（チップ）

簡単に言えば、6×10⁶ 細胞を0.5％ホルムアルデヒドの存在下で室温で15分間PBSで2回洗浄し、培養プレート上に架橋しました。架橋反応は、0.125 Mグリシンを添加することによって停止させました。後続のすべてのステップは48℃で行いました。すべてのバッファは、あらかじめ冷却したおよびプロテアーゼ阻害剤（コンプリートミニ、Roche）を含んでいました。細胞をPBSで2回洗浄し、その後、掻き取りました。収集されたペレットを1mlの溶解緩衝液（1％SDS、5mMのEDTA、50mMトリスpHを8）に溶解し、使用して、100％の振幅で10サイクルの冷エタノール浴中で超音波処理しました。 UP50H超音波処理 （ヒールシャー、テルトウ、ドイツ）。クロマチン断片を1％アガロースゲルで可視化しました。得られた断片は200-500pb範囲でした。可溶性クロマチンは48℃で10分間14000グラムで超音波処理したサンプルを遠心分離することによって得ました。可溶性画分を希釈緩衝液で1/10に希釈した（1％トリトンX-100、2mMのEDTA、20mMトリスpH8の、150mMのNaCl）を等分し、使用するまで-80℃で保存しました。 （ロドリゲスら、2008）