超音波処理を用いたプラスミド調製

超音波処理は、プラスミドDNAを断片化するための信頼性の高い技術です。正確に制御可能な振幅、脈動モードおよび温度制御は、非損傷プラスミド断片化のための超音波装置の最も重要な特徴である。さらに、特定の薬剤の使用は、プラスミドの分解から保護するのに役立ちます。ヒールシャー超音波は、単一のバイアルからの制御されたプラスミド断片化のための様々なソリューションを提供し、同時に多数のサンプルだけでなく、マルチウェルプレートの超音波処理。成功した超音波プラスミド断片化についてもっと学びましょう!

超音波処理を用いたプラスミドせん断

DNAサンプルが超音波にさらされると、超音波で生成された振動は、機械的力を介して高分子量のDNA分子を剪断または破壊する液体中に音響キャビテーションを作成します。超音波処理は、クロマチン免疫沈降(ChIP)などのアプリケーションを含むバルクDNA剪断実験に最も広く使用されている方法であり、そのために小さなフラグメントサイズが高分解能を得るために絶対に重要です。(ツェンら、2012年参照)
プラスミドDNA(pDNA)は、そのリング形状によって特徴付けられるDNAの特異的形態であり、細菌およびいくつかの真核生物に見られる。
スーパーコイルドpDNAは、自動シーケンシングやトランスフェクションなどのダウンストリームプロセスで最良の結果を示すため、プラスミドDNAの所望の形態です。超音波処理は、スーパーコイルpDNAを含むpDNAを正常に断片化するのに適している。
Thompson et al. (2008) は、スーパーコイルDNAを断片化することが知られているプラスミド超音波処理が、ベックマンコールターの制御テンプレートまたは酵素的に線形化されたプラスミドと有意に異ならない点まで配列phred20読み取り長を改善する効果的な方法であることを実証した。

プラスミドベクターの使用

プラスミドは、遺伝子のクローン作成、移入、操作のツールとしてよく使用されます。プラスミドがこれらの目的のために実験的に使用される場合、それらはベクターと呼ばれます。DNA断片または遺伝子をプラスミドベクターに挿入して、いわゆる組換えプラスミドを作成することができる。プラスミドベクターは、組換えDNAを宿主細胞に駆動するためのビヒクルとして使用され、分子クローニングの重要な要素です。
“非ウイルスベクターは、様々な複雑な疾患を治療するための遺伝子治療におけるそれらの潜在的な使用について広く研究されている。非ウイルスベクターは、プラスミドDNAを物理的、化学的、および酵素的分解から保護し、DNA分子を標的部位に送達する。例えば、カチオン性リポソーム、キトサンおよび他の正に荷電したナノ粒子は、静電相互作用を介してプラスミドDNAと複合体を形成する。しかし、容易に形成されるカチオン性リポソーム/プラスミドDNA複合体は比較的大きく(すなわち、300〜400nm)、本質的に不均一であり、医薬用途での使用を困難にする。大規模で不均一なプラスミドDNA/リポソーム、プラスミドDNA/エアロゾル、およびプラスミドDNA/ペプチド複合体は、超音波処理を使用して、より小さく均質な粒子に還元することができる。” (Sarker et al., 2019)
プラスミドベクターの使用の顕著な例は、CRISPR–Cas9である。CRISPR-Cas9システムは、通常、標的配列、CRISPRガイド、およびCas9をコードする単一の大きなプラスミドまたは複数の小さなプラスミドとして細胞に送達されます。

ナノ沈殿によるDNA負荷PLGAナノ粒子の超音波調製

Jo et al. (2020)は、モデルCRISPR-Cas9プラスミドを初代骨髄由来マクロファージに送達するためのナノ粒子担体を形成するために、ポリ(乳酸-コグリコール酸)(PLGA)を使用した。PLGAナノ粒子のナノ沈殿のために、正に荷電したアミン末端キャップが、それとDNAの負に荷電した骨格との間の電荷相互作用のためにカプセル化効率および装填を増加させるという目的で、2つの異なる末端基(エステルおよびアミン基)を有するPLGAを使用した。50mLポリプロピレン円錐遠心管中で、100mgのPluronic F127を、ボルテックス混合に続いて超音波浴を用いて30分間の穏やかな超音波処理(カップホーンを参照).オートクレーブ処理された磁気攪拌バーを加え、溶液を600RPMで30分間混合し、他の溶液を作製した。DNAの非特異的吸着を最小限に抑えるために、ガラス製品の代わりにプラスチック製のラボウェアを使用しました。DMFに溶解したPLGA(44.48mg/ml)およびTHFに溶解したTIPSペンタセン(0.667mg/ml)の溶液を別々に作製した。PLGAは、30分間超音波処理される前に、DMF中で30分間湿潤するために静止したままにされた(完全なプロトコルについては、Jo et al., 2020を参照のこと)

超音波処理中のプラスミドDNA保護

プラスミドやスーパーコイルプラスミドを含むDNAは高感度に分解される。利用可能なすべてのフラグメンテーション方法は、特定の欠点について知られています。超音波DNA断片化は、保護手段と組み合わせて制御された超音波処理がDNA鎖のせん断および熱誘発損傷を低減することを可能にするので、好ましい方法の1つである。
超音波DNAせん断中の低振幅設定、脈動モードおよび温度制御に加えて、特定の薬剤の使用は、DNA分解に対して有意な保護効果を示した。例えば、様々なポリマー、ペプチド、および脂質は、超音波処理中にプラスミドDNAを保護する。

超音波剪断応力に対するプラスミドDNA、およびプラスミドDNA/ILナノ複合体の安定性を、アガロースゲル電気泳動アッセイを用いて調べた。プラスミドDNAおよびプラスミドDNA/ILナノ複合体の両方を、異なる時点について超音波剪断応力にかけた。プラスミドDNAを超音波剪断応力に0、10、20、30、および40分間曝露した。しかしながら、プラスミドDNA/ILナノ複合体は、超音波剪断応力に0、10、20、30、40、60、90、および120分間曝露された。
(研究と写真:©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019)は、プラスミドDNA/イオン液体(pDNA/IL)ナノ構造体を0、10、20、30、40、60、90、および120分間超音波剪断ストレスにかけ、市販のカチオン性遺伝子送達物質リポフェクタミンと複合体化した場合、蛍光陽性細胞の割合は80%、98%、97%、85%、78%、65%であったことを実証した。 それぞれ65%と50%です(下図参照)。蛍光陽性細胞の割合は、ナノ構造体が超音波剪断応力を10、および20分間受けたときに増加し、その後ゆっくりと減少した。

COS7細胞へのプラスミドDNAの送達に対するイオン液体[Bmim][PF6]の影響。プラスミドDNA/IL(イオン液体)ナノ複合体を最大120分間超音波剪断応力にかけ、COS7細胞に送達する前にLAと複合体化した。データは、10の異なる顕微鏡視野でカウントされたGFP陽性HeLa細胞の平均数(%)を示し、実験は3つの異なる日に複数回行った。(研究と図表:©Sarker et al., 2019)

超音波溶解液調製

超音波細胞溶解プロトコル
細胞分離法(例えば、免疫磁気細胞分離、蛍光活性化細胞選別(FACS)、密度勾配遠心分離、免疫密度細胞単離)を介して調製した細胞の濃縮試料から始める。
細胞サンプルは、実験目標およびプローブ型超音波装置に適した溶解緩衝液の体積を示さなければならない。
彼らは超音波細胞溶解を増強するように低張性緩衝液が好ましいです。添加剤と塩濃度が適切な方法で使用されることが重要です。
あなたの超音波溶解装置を選択してください:バイアルの間接超音波処理のために、バイアルツイーターまたはカップホーンが推奨されます。マルチウェルプレートの場合、UIP400MTPは理想的な超音波装置です。古典的なプローブ型超音波処理と、マイクロチップを備えたUP100HまたはUP200Htのような超音波ホモジナイザーが最も適している。
プローブ型超音波処理のためのプロトコル: 超音波装置プローブを微量遠心管内のサンプル体積に入れ、約10秒間超音波処理する。DNAサンプルに応じて、超音波処理は、1回または2回以上繰り返すことができます。必要な超音波エネルギー入力(Ws / mL)は、サンプル粘度とDNAタイプによって異なります。超音波装置の氷浴および脈動モードを介して冷却することは、サンプルが熱的に劣化するのを防ぐのに役立ちます。
超音波溶解後、サンプルを遠心分離してペレット破片(未溶解の細胞、核、および未溶解の細胞小器官を含む)を分離する。
試料が直ちにさらに処理されない場合、その生存率を維持するために適切な温度で保存することができる。

DNA断片化のための超音波装置

ヒールシャー超音波は、DNA、RNA、クロマチンの断片化のための様々な超音波ベースのプラットフォームを提供しています。これらの異なるプラットフォームには、超音波プローブ(ソノトロード)、複数のチューブまたはマルチウェルプレート(例えば、96-ウェルプレート、マイクロタイタープレート)、ソノリアクター、および超音波カップホーンの同時サンプル調製のための間接超音波処理ソリューションが含まれます。DNAせん断のためのすべてのプラットホームは精密に制御可能で、再生可能な結果を提供する周波数調整された高性能の超音波プロセッサによって動力を与えられる。

任意のサンプル数とサイズのための超音波プロセッサ

ヒールシャーのマルチサンプル超音波装置VialTweeter(最大10本の試験管用)とUIP400MTP(マイクロプレート/マルチウェルプレート用)を使用すると、所望のDNA断片サイズ分布と収率を得ながら、強烈で正確に制御可能な超音波処理により、サンプル処理時間を短縮することが容易に可能になります。超音波DNA断片化は、プラスミド調製ステップを効率的で信頼性が高く、スケーラブルにします。プロトコルは、一定の超音波パラメータを適用することによって、1つのサンプルから多数のサンプルに直線的にスケーリングすることができます。
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.