超音波処理によるプラスミド調製

超音波処理は、プラスミドDNAを断片化するための信頼性の高い技術です。損傷を与えずにプラスミドを断片化するための超音波処理装置において、精密に制御できる振幅、パルスモード、および温度制御は最も重要な機能です。さらに、特定の薬剤を使用することで、プラスミドの分解を防ぐことができます。Hielscher Ultrasonicsは、単一のバイアルから、多数のサンプルの同時超音波処理、マルチウェルプレートの処理まで、制御されたプラスミド断片化のためのさまざまなソリューションを提供しています。超音波によるプラスミド断片化を成功させる方法について、詳しくご覧ください。

超音波処理によるプラスミドのせん断

DNAサンプルに超音波を照射すると、超音波によって生じる振動が液体中に音響キャビテーションを発生させ、その機械的な力によって高分子量のDNA分子がせん断または切断されます。超音波処理は、バルクDNAのせん断実験で最も広く使用されている方法です。これには、高い分解能を得るために小さな断片サイズが不可欠なクロマチン免疫沈降（ChIP）などの用途も含まれます。（参照：Tseng et al., 2012）
プラスミドDNA（pDNA）は、環状構造を特徴とする特定の形態のDNAであり、細菌や一部の真核生物に存在します。
スーパーコイル状pDNAは、自動シーケンシングやトランスフェクションなどの後続工程で最良の結果を示すため、望ましいプラスミドDNAの形態です。超音波処理は、スーパーコイル状pDNAを含むpDNAを良好に断片化するのに適しています。
Thompson et al. (2008)は、スーパーコイル状DNAを断片化することが知られているプラスミドの超音波処理が、シーケンスのphred20リード長を、Beckman Coulterの対照テンプレートや酵素で直鎖化したプラスミドと有意差がない水準まで改善する有効な方法であることを示しました。

プラスミドベクターの使用

プラスミドは、遺伝子のクローニング、導入、操作のためのツールとしてよく使用されます。これらの目的で実験的に使用されるプラスミドは、ベクターと呼ばれます。DNA断片や遺伝子をプラスミドベクターに挿入すると、いわゆる組換えプラスミドが作製されます。プラスミドベクターは、組換えDNAを宿主細胞に導入するための運搬体として使用され、分子クローニングの主要な構成要素です。
「非ウイルス性ベクターは、さまざまな複雑な疾患を治療する遺伝子治療への利用可能性について、広く研究されています。非ウイルス性ベクターは、プラスミドDNAを物理的、化学的、酵素的な分解から保護し、DNA分子を標的部位に送達します。例えば、カチオン性リポソーム、キトサン、およびその他の正に帯電したナノ粒子は、静電相互作用によってプラスミドDNAと複合体を形成します。しかし、容易に形成されるカチオン性リポソーム／プラスミドDNA複合体は比較的大きく（すなわち300–400 nm）、性質が不均一なため、医薬用途での使用が困難です。大きく不均一なプラスミドDNA／リポソーム、プラスミドDNA／エアロゾル、およびプラスミドDNA／ペプチドの複合体は、超音波処理によって、より小さく均一な粒子にすることができます。」（Sarker et al., 2019）
プラスミドベクターの使用における代表的な例はCRISPR–Cas9です。CRISPR–Cas9システムは通常、標的配列、CRISPRガイド、およびCas9をコードする単一の大きなプラスミド、または複数の小さなプラスミドとして細胞に送達されます。

ナノ沈殿法によるDNA含有PLGAナノ粒子の超音波調製

Jo et al. (2020)は、モデルCRISPR–Cas9プラスミドを初代骨髄由来マクロファージに送達するためのナノ粒子キャリアを形成する目的で、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）を使用しました。PLGAナノ粒子のナノ沈殿には、二種類の異なる末端基（エステル基およびアミン基）を持つPLGAを使用しました。これは、正に帯電したアミン末端基と、負に帯電したDNA骨格との電荷相互作用によって、封入効率および担持量を高めることを目的としています。50 mLのポリプロピレン製コニカル遠心管内で、100 mgのPluronic F127を20 mLのオートクレーブ滅菌済み脱イオン水にボルテックス混合で溶解し、その後、超音波浴を使用して30 minの穏やかな超音波処理を行いました（CupHornを参照）。オートクレーブ滅菌済みの磁気撹拌子を加え、他の溶液を調製する間、溶液を600 RPMで30 min混合しました。DNAの非特異的吸着を最小限に抑えるため、全工程でガラス製器具の代わりにプラスチック製実験器具を使用しました。PLGAをDMFに溶解した溶液（44.48 mg/ ml）と、TIPSペンタセンをTHFに溶解した溶液（0.667 mg/ml）を別々に調製しました。PLGAは、DMF中で濡れるよう30 min静置した後、30 min超音波処理しました。（完全なプロトコルについてはJo et al., 2020を参照）

超音波処理中のプラスミドDNAの保護

プラスミドやスーパーコイル状プラスミドを含むDNAは、分解に対して非常に敏感です。利用可能な断片化方法には、いずれも一定の欠点があることが知られています。制御された超音波処理と保護対策を組み合わせることで、せん断および熱によるDNA鎖の損傷を軽減できるため、超音波によるDNA断片化は、好まれる方法の一つです。
超音波によるDNAせん断時の低振幅設定、パルスモード、および温度制御に加えて、特定の薬剤の使用は、DNAの分解に対して有意な保護効果を示しました。例えば、さまざまなポリマー、ペプチド、および脂質が、超音波処理中のプラスミドDNAを保護します。

超音波せん断応力に対するプラスミドDNAおよびプラスミドDNA/ILナノ複合体の安定性を、アガロースゲル電気泳動アッセイで調べました。プラスミドDNAとプラスミドDNA/ILナノ複合体の両方に、異なる時間にわたって超音波せん断応力を加えました。プラスミドDNAには、0, 10, 20, 30, 40分間の超音波せん断応力を加えました。一方、プラスミドDNA/ILナノ複合体には、0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, 120分間の超音波せん断応力を加えました。
（研究および画像：©Sarker et al., 2019）

Sarker et al. (2019)は、プラスミドDNA／イオン液体（pDNA/IL）ナノ構造体に0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, 120 minの超音波せん断応力を加え、市販のカチオン性遺伝子送達剤リポフェクタミンと複合体を形成させた場合、蛍光陽性細胞の割合がそれぞれ80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, 50%であったことを示しました（下のグラフを参照）。ナノ構造体に10 minおよび20 minの超音波せん断応力を加えたとき、蛍光陽性細胞の割合は増加し、その後は緩やかに低下しました。

イオン液体 [Bmim][PF6] がプラスミドDNAのCOS7細胞への送達に及ぼす影響。プラスミドDNA/IL（イオン液体）ナノ複合体に最大120分間の超音波せん断応力を加え、COS7細胞へ送達する前にLAと複合体を形成させました。データは、10の異なる顕微鏡視野で計数したGFP陽性HeLa細胞の平均数（%）を示しています。実験は、異なる三日間に複数回実施しました。（研究およびグラフ：©Sarker et al., 2019）

超音波による細胞溶解液の調製

超音波による細胞溶解プロトコル
細胞分離法（例えば、免疫磁気細胞分離、蛍光活性化セルソーティング（FACS）、密度勾配遠心分離、免疫密度細胞分離）によって調製した、細胞を濃縮したサンプルから開始します。
細胞サンプルには、実験目的およびプローブ型超音波処理装置に適した量の溶解バッファーが含まれていなければなりません。
低張バッファーは、超音波による細胞溶解を促進するため、推奨されます。添加剤と塩濃度を適切に設定することが重要です。
超音波細胞溶解装置を選択してください：バイアルの間接的な超音波処理には、VialTweeterまたはCupHornを推奨します。マルチウェルプレートには、UIP400MTPが理想的な超音波処理装置です。また、従来のプローブ型超音波処理には、マイクロチップを装着したUP100HまたはUP200Htなどの超音波ホモジナイザーが最も適しています。
プローブ型超音波処理のプロトコル： マイクロ遠心管内のサンプルに超音波処理装置のプローブを挿入し、約10秒間超音波処理します。DNAサンプルによっては、超音波処理をさらに一回または二回繰り返す場合があります。必要な超音波エネルギー投入量（Ws/mL）は、サンプルの粘度とDNAの種類によって異なります。氷浴による冷却と超音波処理装置のパルスモードは、サンプルの熱による分解を防ぐのに役立ちます。
超音波による細胞溶解の後、サンプルを遠心分離し、ペレット状の残渣（未溶解の細胞、核、および未溶解の細胞小器官を含む）を分離します。
サンプルを直ちに次の工程で処理しない場合は、その生存性を維持するために適切な温度で保存できます。

DNA断片化用超音波処理装置

Hielscher Ultrasonicsは、DNA、RNA、およびクロマチンの断片化のために、超音波を利用したさまざまなプラットフォームを提供しています。これらの異なるプラットフォームには、超音波プローブ（ソノトロード）、複数のチューブやマルチウェルプレート（例えば、96ウェルプレート、マイクロタイタープレート）のサンプルを同時に調製するための間接超音波処理ソリューション、超音波リアクター、および超音波CupHornが含まれます。DNAせん断用のすべてのプラットフォームは、周波数を調整した高性能超音波プロセッサーによって駆動され、精密に制御でき、再現性のある結果をもたらします。

あらゆるサンプル数とサイズに対応する超音波プロセッサー

Hielscherの複数サンプル用超音波処理装置VialTweeter（最大10本の試験管用）とUIP400MTP（マイクロプレート／マルチウェルプレート用）を使用すると、強力かつ精密に制御できる超音波処理により、目的のDNA断片のサイズ分布と収量を得ながら、サンプル処理時間を容易に短縮できます。超音波によるDNA断片化は、プラスミド調製工程を効率的で信頼性が高く、スケール変更可能なものにします。一定の超音波パラメーターを適用することで、プロトコルを単一のサンプルから多数のサンプルへ線形にスケールアップできます。
一–五本のフィンガーを備えたプローブ型超音波処理装置は、少数のサンプルの調製に理想的です。Hielscherの実験室用超音波処理装置には、さまざまな出力レベルの製品があり、DNA関連の用途に理想的な超音波破砕装置を選択できます。