超音波処理を用いたプラスミド調製

超音波処理は、プラスミドDNAを断片化するための信頼性の高い技術です。正確に制御可能な振幅、脈動モードおよび温度制御は、非損傷プラスミド断片化のための超音波装置の最も重要な特徴である。さらに、特定の薬剤の使用は、プラスミドの分解から保護するのに役立ちます。ヒールシャー超音波は、単一のバイアルからの制御されたプラスミド断片化のための様々なソリューションを提供し、同時に多数のサンプルだけでなく、マルチウェルプレートの超音波処理。成功した超音波プラスミド断片化についてもっと学びましょう!

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超音波DNAの断片化は、次世代シーケンシング(NGS)で一般的に使用される信頼性の高い効率的な技術です

The UIP400MTP マルチウェルプレートの正確に制御された超音波処理を可能にします。UIP400MTPの用途の1つは、特異的に標的化された長さの断片を得るためのプラスミドDNAの断片化である。

超音波処理を用いたプラスミドせん断

DNAサンプルが超音波にさらされると、超音波で生成された振動は、機械的力を介して高分子量のDNA分子を剪断または破壊する液体中に音響キャビテーションを作成します。超音波処理は、クロマチン免疫沈降(ChIP)などのアプリケーションを含むバルクDNA剪断実験に最も広く使用されている方法であり、そのために小さなフラグメントサイズが高分解能を得るために絶対に重要です。(ツェンら、2012年参照)
プラスミドDNA(pDNA)は、そのリング形状によって特徴付けられるDNAの特異的形態であり、細菌およびいくつかの真核生物に見られる。
スーパーコイルドpDNAは、自動シーケンシングやトランスフェクションなどのダウンストリームプロセスで最良の結果を示すため、プラスミドDNAの所望の形態です。超音波処理は、スーパーコイルpDNAを含むpDNAを正常に断片化するのに適している。
Thompson et al. (2008) は、スーパーコイルDNAを断片化することが知られているプラスミド超音波処理が、ベックマンコールターの制御テンプレートまたは酵素的に線形化されたプラスミドと有意に異ならない点まで配列phred20読み取り長を改善する効果的な方法であることを実証した。

超音波DNA断片化の利点

  • 正確に制御可能
  • 再現可能な結果
  • DNA断片の長さをターゲットに調整可能
  • 温度管理
  • あらゆるサンプルサイズに拡張可能
ビデオは高強度の超音波を使用して任意の標準的なマルチウェルプレートの信頼できるサンプルの準備を可能にする超音波サンプル調製システムUIP400MTPを示しています。UIP400MTPの代表的な用途としては、細胞溶解、DNA、RNA、クロマチンのせん断、タンパク質抽出などがあります。

マルチウェルプレート超音波処理用超音波UIP400MTP

プラスミドベクターの使用

プラスミドは、遺伝子のクローン作成、移入、操作のツールとしてよく使用されます。プラスミドがこれらの目的のために実験的に使用される場合、それらはベクターと呼ばれます。DNA断片または遺伝子をプラスミドベクターに挿入して、いわゆる組換えプラスミドを作成することができる。プラスミドベクターは、組換えDNAを宿主細胞に駆動するためのビヒクルとして使用され、分子クローニングの重要な要素です。
“非ウイルスベクターは、様々な複雑な疾患を治療するための遺伝子治療におけるそれらの潜在的な使用について広く研究されている。非ウイルスベクターは、プラスミドDNAを物理的、化学的、および酵素的分解から保護し、DNA分子を標的部位に送達する。例えば、カチオン性リポソーム、キトサンおよび他の正に荷電したナノ粒子は、静電相互作用を介してプラスミドDNAと複合体を形成する。しかし、容易に形成されるカチオン性リポソーム/プラスミドDNA複合体は比較的大きく(すなわち、300〜400nm)、本質的に不均一であり、医薬用途での使用を困難にする。大規模で不均一なプラスミドDNA/リポソーム、プラスミドDNA/エアロゾル、およびプラスミドDNA/ペプチド複合体は、超音波処理を使用して、より小さく均質な粒子に還元することができる。” (Sarker et al., 2019)
プラスミドベクターの使用の顕著な例は、CRISPR–Cas9である。CRISPR-Cas9システムは、通常、標的配列、CRISPRガイド、およびCas9をコードする単一の大きなプラスミドまたは複数の小さなプラスミドとして細胞に送達されます。

ナノ沈殿によるDNA負荷PLGAナノ粒子の超音波調製

Jo et al. (2020)は、モデルCRISPR-Cas9プラスミドを初代骨髄由来マクロファージに送達するためのナノ粒子担体を形成するために、ポリ(乳酸-コグリコール酸)(PLGA)を使用した。PLGAナノ粒子のナノ沈殿のために、正に荷電したアミン末端キャップが、それとDNAの負に荷電した骨格との間の電荷相互作用のためにカプセル化効率および装填を増加させるという目的で、2つの異なる末端基(エステルおよびアミン基)を有するPLGAを使用した。50mLポリプロピレン円錐遠心管中で、100mgのPluronic F127を、ボルテックス混合に続いて超音波浴を用いて30分間の穏やかな超音波処理(カップホーンを参照).オートクレーブ処理された磁気攪拌バーを加え、溶液を600RPMで30分間混合し、他の溶液を作製した。DNAの非特異的吸着を最小限に抑えるために、ガラス製品の代わりにプラスチック製のラボウェアを使用しました。DMFに溶解したPLGA(44.48mg/ml)およびTHFに溶解したTIPSペンタセン(0.667mg/ml)の溶液を別々に作製した。PLGAは、30分間超音波処理される前に、DMF中で30分間湿潤するために静止したままにされた(完全なプロトコルについては、Jo et al., 2020を参照のこと)

関連アプリケーション:

  • DNAの抽出
  • DNAのカプセル化
  • ナノ粒子被覆DNAの分散
  • プラスミドDNAの細胞内への送達
UP200Stサンプルの間接超音波処理のためのTD_CupHorn

サンプルの間接超音波処理のためのUP200St CupHorn、例えばDNA抽出および断片化のため。

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超音波処理中のプラスミドDNA保護

プラスミドやスーパーコイルプラスミドを含むDNAは高感度に分解される。利用可能なすべてのフラグメンテーション方法は、特定の欠点について知られています。超音波DNA断片化は、保護手段と組み合わせて制御された超音波処理がDNA鎖のせん断および熱誘発損傷を低減することを可能にするので、好ましい方法の1つである。
超音波DNAせん断中の低振幅設定、脈動モードおよび温度制御に加えて、特定の薬剤の使用は、DNA分解に対して有意な保護効果を示した。例えば、様々なポリマー、ペプチド、および脂質は、超音波処理中にプラスミドDNAを保護する。

イオン液体は、超音波処理中の損傷からプラスミドDNAを保護することができます。

超音波剪断応力に対するプラスミドDNA、およびプラスミドDNA/ILナノ複合体の安定性を、アガロースゲル電気泳動アッセイを用いて調べた。プラスミドDNAおよびプラスミドDNA/ILナノ複合体の両方を、異なる時点について超音波剪断応力にかけた。プラスミドDNAを超音波剪断応力に0、10、20、30、および40分間曝露した。しかしながら、プラスミドDNA/ILナノ複合体は、超音波剪断応力に0、10、20、30、40、60、90、および120分間曝露された。
(研究と写真:©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019)は、プラスミドDNA/イオン液体(pDNA/IL)ナノ構造体を0、10、20、30、40、60、90、および120分間超音波剪断ストレスにかけ、市販のカチオン性遺伝子送達物質リポフェクタミンと複合体化した場合、蛍光陽性細胞の割合は80%、98%、97%、85%、78%、65%であったことを実証した。 それぞれ65%と50%です(下図参照)。蛍光陽性細胞の割合は、ナノ構造体が超音波剪断応力を10、および20分間受けたときに増加し、その後ゆっくりと減少した。

プラスミドDNAの超音波断片化

COS7細胞へのプラスミドDNAの送達に対するイオン液体[Bmim][PF6]の影響。プラスミドDNA/IL(イオン液体)ナノ複合体を最大120分間超音波剪断応力にかけ、COS7細胞に送達する前にLAと複合体化した。データは、10の異なる顕微鏡視野でカウントされたGFP陽性HeLa細胞の平均数(%)を示し、実験は3つの異なる日に複数回行った。(研究と図表:©Sarker et al., 2019)

プラスミドDNAは、超音波断片化の前に薬剤を添加して保護することができる。

プラスミドDNAは、超音波断片化の前に薬剤を添加して保護することができます:裸のpDNA(A)および1.5mMのCaCl2および20%(v/v)t-ブタノール(B)で配合されたpDNAの超音波処理誘発分解
サンプルは、各レーンの上部に示されているように、最大120秒間20Wプローブで超音波処理されました。レーンHは、ハイパーラダーI™️マーカーに対応する。OCおよびSCプラスミドバンドが示される。
(研究と写真:©Wu et al., 2009)

超音波溶解液調製

超音波細胞溶解プロトコル
超音波分析器UP200HtマイクロチップS26d2生物学的サンプルの超音波のリシス細胞分離法(例えば、免疫磁気細胞分離、蛍光活性化細胞選別(FACS)、密度勾配遠心分離、免疫密度細胞単離)を介して調製した細胞の濃縮試料から始める。
細胞サンプルは、実験目標およびプローブ型超音波装置に適した溶解緩衝液の体積を示さなければならない。
彼らは超音波細胞溶解を増強するように低張性緩衝液が好ましいです。添加剤と塩濃度が適切な方法で使用されることが重要です。
あなたの超音波溶解装置を選択してください:バイアルの間接超音波処理のために、バイアルツイーターまたはカップホーンが推奨されます。マルチウェルプレートの場合、UIP400MTPは理想的な超音波装置です。古典的なプローブ型超音波処理と、マイクロチップを備えたUP100HまたはUP200Htのような超音波ホモジナイザーが最も適している。
プローブ型超音波処理のためのプロトコル: 超音波装置プローブを微量遠心管内のサンプル体積に入れ、約10秒間超音波処理する。DNAサンプルに応じて、超音波処理は、1回または2回以上繰り返すことができます。必要な超音波エネルギー入力(Ws / mL)は、サンプル粘度とDNAタイプによって異なります。超音波装置の氷浴および脈動モードを介して冷却することは、サンプルが熱的に劣化するのを防ぐのに役立ちます。
超音波溶解後、サンプルを遠心分離してペレット破片(未溶解の細胞、核、および未溶解の細胞小器官を含む)を分離する。
試料が直ちにさらに処理されない場合、その生存率を維持するために適切な温度で保存することができる。

DNA断片化のための超音波装置

ヒールシャー超音波は、DNA、RNA、クロマチンの断片化のための様々な超音波ベースのプラットフォームを提供しています。これらの異なるプラットフォームには、超音波プローブ(ソノトロード)、複数のチューブまたはマルチウェルプレート(例えば、96-ウェルプレート、マイクロタイタープレート)、ソノリアクター、および超音波カップホーンの同時サンプル調製のための間接超音波処理ソリューションが含まれます。DNAせん断のためのすべてのプラットホームは精密に制御可能で、再生可能な結果を提供する周波数調整された高性能の超音波プロセッサによって動力を与えられる。

任意のサンプル数とサイズのための超音波プロセッサ

ヒールシャーのマルチサンプル超音波装置VialTweeter(最大10本の試験管用)とUIP400MTP(マイクロプレート/マルチウェルプレート用)を使用すると、所望のDNA断片サイズ分布と収率を得ながら、強烈で正確に制御可能な超音波処理により、サンプル処理時間を短縮することが容易に可能になります。超音波DNA断片化は、プラスミド調製ステップを効率的で信頼性が高く、スケーラブルにします。プロトコルは、一定の超音波パラメータを適用することによって、1つのサンプルから多数のサンプルに直線的にスケーリングすることができます。
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

The VialTweeter is a MultiSample Ultrasonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

超音波マルチサンプル調製ユニットバイアルツイーター 最大10バイアルの同時超音波処理を可能にします。クランプオンデバイスVialPressを使用すると、最大4つの追加のチューブを前面に押し込み、激しい超音波処理を行うことができます。

精密なプロセス制御

ヒールシャー超音波処理器は、ブラウザコントロールを介してリモート制御することができます。超音波処理パラメータを監視し、プロセス要件に正確に調整することができます。徹底的な超音波処理設定は、徹底的な超音波処理がDNA、RNAおよびクロマチンを破壊することができるので重要であるが、不十分な超音波剪断は、あまりにも長いDNAおよびクロマチン断片をもたらす。ヒールシャーのデジタル超音波処理器は、簡単に正確な超音波処理パラメータに設定することができます。特定の超音波処理の設定は、同じ手順の高速繰り返しのためのプログラム設定として保存することができます。
すべての超音波処理は自動的にプロトコルされ、組み込みのSDカードにCSVファイルとして保存されます。これにより、実行された試験の正確な文書化が可能になり、簡単に超音波処理を実行する修正が可能になります。
ブラウザのリモコンを介して、すべてのデジタル超音波処理器は、任意の標準的なブラウザを介して操作し、監視することができます。LAN接続は非常に簡単なプラグアンドプレイセットアップであるため、追加のソフトウェアのインストールは必要ありません。

超音波DNA調製中の最高の使いやすさ

すべてのヒールシャー超音波装置は、常に非常にユーザーフレンドリーで操作しやすい同時に、高性能超音波を提供するように設計されています。すべての設定は、色付きのタッチディスプレイやブラウザのリモコンを介して簡単にアクセスできる明確なメニューでよく構成されています。プログラム可能な設定と自動データ記録を備えたスマートソフトウェアは、信頼性が高く、再現可能な結果を得るための最適な超音波処理設定を保証します。清潔で使いやすいメニューインターフェイスは、ヒールシャー超音波装置をユーザーフレンドリーで効率的なデバイスに変えます。
以下の表は、細胞溶解とDNA断片化のための私たちの研究室の超音波装置のおおよその処理能力の指標を提供します:

バッチ容量 流量 推奨デバイス
マルチウェルプレート 該当なし UIP400MTP
バイアル、小型ビーカー 該当なし 超音波cuphorn
最大10本のバイアル 該当なし VialTweeter
500mLの1〜 200mL /分で10 UP100H
2000mlの10〜 20 400mLの/分 Uf200ःトンUP400St

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DNA抽出と断片化のための超音波ホモジナイザー、アプリケーションプロトコルと価格に関する追加情報を要求するには、以下のフォームを使用してください。私たちはあなたとあなたのプロセスを議論し、あなたの要件を満たす超音波システムを提供してうれしいです!









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文献 / 参考文献

知る価値のある事実

プラスミドとは何ですか?
プラスミドは、染色体DNAから物理的に分離され、独立して複製する小さな円形DNA分子である。プラスミドは、多くの場合、生物の生存に寄与し、抗生物質耐性などの特定の利点を与える遺伝子と関連している。プラスミドは、細菌において小さな円形の二本鎖DNA分子として最も一般的に見出される。しかし、プラスミドは古細菌や真核生物に存在することがあります。プラスミドは、分子生物学、遺伝学、生化学、生命科学において重要なツールです。遺伝子工学におけるベクターとして知られているプラスミドは、特定の遺伝子を複製または発現するために使用されます。ベクトルのターゲットを絞った変更は、ベクトル設計と呼ばれます。

細胞研究におけるGFP解析
緑色蛍光タンパク質(GFP)は、生理学的プロセスのモニタリング、タンパク質の局在の視覚化、およびインビボでのトランスジェニック発現の検出のための汎用性の高い生物学的マーカーです。GFPは488nmのレーザーラインで励起することができ、510nmで最適に検出されます。


高性能超音波!ヒールシャーの製品範囲は、完全工業用超音波システムにベンチトップユニット上のコンパクトラボ超音波装置から完全なスペクトルをカバーしています。

ヒールシャー超音波は、から高性能超音波ホモジナイザーを製造しています ラボ産業サイズ。