超音波処理によるプラスミド調製

超音波照射はプラスミドDNAを断片化するための信頼性の高い技術である。正確に制御可能な振幅、脈動モード、温度制御は、プラスミドを傷つけない断片化のための超音波装置の最も重要な特徴である。さらに、特定の薬剤を使用することで、プラスミドの分解を防ぐことができます。Hielscher Ultrasonics社は、1バイアルからの制御されたプラスミドフラグメンテーション、多数のサンプルの同時超音波処理、マルチウェルプレートなど、様々なソリューションを提供しています。超音波によるプラスミドフラグメンテーションの成功について、詳しくはこちらをご覧ください！

超音波処理によるプラスミドの剪断

DNAサンプルに超音波を照射すると、超音波によって発生する振動が液体中に音響キャビテーションを形成し、機械的な力によって高分子量のDNA分子をせん断または切断する。ソニケーションは、クロマチン免疫沈降法（ChIP）のような高分解能を得るために小さな断片サイズが絶対的に重要なアプリケーションを含むバルクDNA剪断実験に最も広く使用されている方法である。(参照：Tseng et al.）
プラスミドDNA(pDNA)はDNAの一種で、リング状をしているのが特徴で、バクテリアや一部の真核生物に存在する。
スーパーコイルpDNAは、自動シーケンシングやトランスフェクションなどのダウンストリームプロセスで最良の結果を示すため、プラスミドDNAの望ましい形態である。超音波処理は、スーパーコイルpDNAを含むpDNAをうまく断片化するのに適している。
Thompsonら(2008)は、スーパーコイルDNAを断片化することが知られているプラスミドの超音波処理は、シーケンスPhred20のリード長をBeckman Coulterのコントロールテンプレートや酵素的に直線化したプラスミドと有意差がない程度まで改善する効果的な方法であることを示した。

プラスミドベクターの使用

プラスミドはしばしば、遺伝子のクローニング、導入、操作の道具として使われる。プラスミドがこれらの目的のために実験的に使われる場合、それらはベクターと呼ばれる。DNA断片や遺伝子をプラスミドベクターに挿入して、いわゆる組換えプラスミドを作ることができる。プラスミドベクターは、組換えDNAを宿主細胞に送り込むための乗り物として使用され、分子クローニングの重要な構成要素である。
“非ウイルス性ベクターは、様々な複雑な疾患を治療するための遺伝子治療に使用される可能性があり、広く研究されている。非ウイルス性ベクターはプラスミドDNAを物理的、化学的、酵素的分解から保護し、DNA分子を標的部位に送達する。例えば、カチオン性リポソーム、キトサン、その他の正電荷を持つナノ粒子は、静電相互作用によってプラスミドDNAと複合体を形成する。しかし、容易に形成されるカチオン性リポソーム／プラスミドDNA複合体は、比較的大きく（すなわち、300-400nm）、性質が不均一であるため、医薬用途での使用が困難である。大きく不均質なプラスミドDNA/リポソーム、プラスミドDNA/エアロゾル、プラスミドDNA/ペプチド複合体は、超音波処理により小さく均質な粒子にすることができる。” (Sarker他、2019年)
プラスミド・ベクターの使用例としては、CRISPR-Cas9が挙げられる。CRISPR-Cas9システムは通常、標的配列、CRISPRガイド、Cas9をコードする単一の大きなプラスミド、あるいは複数の小さなプラスミドとして細胞に送達される。

ナノ沈降法によるDNA担持PLGAナノ粒子の超音波調製

Joら（2020）は、CRISPR-Cas9プラスミドを初代骨髄由来マクロファージに送達するためのナノ粒子担体を形成するために、ポリ乳酸-グリコール酸（PLGA）を使用した。PLGAナノ粒子のナノ沈殿には、2つの異なる末端基（エステル基とアミン基）を持つPLGAを使用した。これは、プラスに荷電したアミン末端キャップが、DNAのマイナスに荷電した骨格との間の電荷相互作用により、カプセル化効率と充填量を増加させることを目的としている。50mLのポリプロピレン製コニカル遠心チューブに、100mgのプルロニックF127を20mLのオートクレーブした純水に溶解し、ボルテックスで混合した。カップホーンを見る).オートクレーブ滅菌したマグネチックスターリングバーを加え、他の溶液を作る間、溶液を600RPMで30分間混合した。DNAの非特異的吸着を最小限にするため、ガラス器具の代わりにプラスチック製の実験器具を使用した。PLGAをDMFに溶解した溶液（44.48 mg/ml）とTIPSペンタセンをTHFに溶解した溶液（0.667 mg/ml）を別々に作った。PLGAはDMF中で30分間静置して湿潤させた後、30分間超音波処理した（完全なプロトコールはJoら、2020を参照）。

超音波処理中のプラスミドDNA保護

プラスミドやスーパーコイルドプラスミドを含むDNAは、分解に非常に敏感である。利用可能なフラグメンテーション法はすべて、ある種の欠点があることが知られている。超音波DNAフラグメンテーションは、制御された超音波処理と保護手段の組み合わせにより、DNA鎖のせん断および熱による損傷を減らすことができるため、好ましい方法の一つである。
超音波DNA剪断時の低振幅設定、脈動モード、温度制御に加えて、ある種の薬剤の使用は、DNAの分解に対して有意な保護効果を示した。例えば、様々なポリマー、ペプチド、脂質が超音波処理中にプラスミドDNAを保護する。

プラスミドDNAおよびプラスミドDNA/ILナノ複合体の超音波せん断ストレスに対する安定性を、アガロースゲル電気泳動アッセイを用いて調べた。プラスミド DNA とプラスミド DNA/IL ナノ複合体は、それぞれ異なる時間、超音波せん断応力に曝された。プラスミドDNAは、0分、10分、20分、30分、40分超音波せん断応力にさらされた。しかし、プラスミドDNA/ILナノ複合体は、0, 10, 20, 30, 40, 60, 90, 120分間超音波せん断応力に曝された。
(研究・写真：©Sarker et al, 2019）

Sarkerら（2019）は、プラスミドDNA／イオン液体（pDNA/IL）ナノ構造体に超音波せん断応力を0、10、20、30、40、60、90、120分間与え、市販のカチオン性遺伝子導入剤リポフェクタミンと複合化させたところ、蛍光陽性細胞の割合はそれぞれ80％、98％、97％、85％、78％、65％、65％、50％であったことを示した（下表参照）。蛍光陽性細胞の割合は、ナノ構造体を10分、20分と超音波せん断応力にかけると増加し、その後は徐々に減少した。

COS7細胞へのプラスミドDNA導入におけるイオン液体[Bmim][PF6]の影響。プラスミドDNA/IL（イオン液体）ナノ複合体は、COS7細胞に導入する前に、最大120分間超音波せん断応力を与え、LAと複合化させた。データは、10の異なる顕微鏡視野でカウントしたGFP陽性HeLa細胞の平均数（％）を示し、実験は3つの異なる日に複数回行った。(研究および図表：©Sarker et al.）

超音波ライセート調製

超音波細胞溶解プロトコル
細胞分離法（例えば、免疫磁気細胞分離、蛍光活性化細胞選別（FACS）、密度勾配遠心分離、免疫密度細胞分離）で調製した細胞の濃縮サンプルから始める。
細胞サンプルは、実験目的とプローブ型超音波発生装置に適した量の溶解バッファーを示さなければならない。
低張緩衝液は超音波による細胞溶解を促進するので好ましい。添加物と塩濃度を適切に使用することが重要である。
超音波溶解装置を選択します：バイアルを間接的に超音波処理する場合は、VialTweeterまたはCupHornをお勧めします。マルチウェルプレートにはUIP400MTPが最適です。また、プローブタイプの超音波処理には、マイクロチップ付きのUP100HやUP200Htなどの超音波ホモジナイザーが最適です。
プローブ型超音波処理のプロトコル： 超音波プローブをマイクロチューブのサンプル量に入れ、約10秒間超音波処理を行う。DNAサンプルによっては、超音波処理をさらに1～2回繰り返すこともあります。必要な超音波エネルギー入力（Ws/mL）は、サンプルの粘度とDNAの種類によって異なります。氷浴による冷却と超音波発生装置の脈動モードは、サンプルの熱劣化を防ぐのに役立つ。
超音波溶解後、サンプルを遠心分離し、ペレット残骸（未溶解細胞、核、未溶解オルガネラを含む）を分離する。
サンプルをすぐに処理しない場合は、適切な温度で保存して生存性を保つことができる。

超音波によるDNA断片化

Hielscher Ultrasonics社は、DNA、RNA、クロマチン断片化のための様々な超音波ベースのプラットフォームを提供しています。これらの様々なプラットフォームには、超音波プローブ（ソノトロード）、複数のチューブやマルチウェルプレート（96ウェルプレート、マイクロタイタープレートなど）を同時にサンプル調製するための間接超音波処理ソリューション、ソノリアクター、超音波カップホーンなどがあります。DNAシアリング用のプラットフォームはすべて、周波数チューニングされた高性能超音波プロセッサーを搭載しており、精密に制御可能で、再現性の高い結果をもたらします。

あらゆるサンプル数とサイズに対応する超音波プロセッサー

Hielscher社のマルチサンプル超音波破砕装置VialTweeter（10本までの試験管用）およびUIP400MTP（マイクロプレート/マルチウェルプレート用）を使用すると、目的のDNA断片サイズ分布と収量を得ながら、強力で正確に制御可能な超音波処理によりサンプル処理時間を短縮することが容易になります。超音波DNAフラグメンテーションは、プラスミド調製ステップを効率的で信頼性の高いスケーラブルなものにします。一定の超音波パラメーターを適用することで、1サンプルから多数のサンプルまで、プロトコルをリニアにスケールアップすることができる。
1本から5本のフィンガーを備えたプローブ超音波装置は、より少ないサンプル数の試料作製に最適です。Hielscher社のラボ用超音波破砕機は、DNA関連のアプリケーションに理想的な超音波破砕機を選択できるよう、さまざまな出力レベルが用意されています。