工業生産におけるバイオエンジニアリング細胞の超音波溶解

大腸菌のようなバイオエンジニアリングされた細菌種や、遺伝子組み換えされた哺乳類細胞や植物細胞は、バイオテクノロジーにおいて分子を発現させるために広く使用されている。これらの合成されたバイオ分子を放出するためには、信頼性の高い細胞破砕技術が必要である。高性能超音波洗浄は、効率的で信頼性の高い細胞溶解法として実証されている。 – 大きな処理量に容易に拡張可能Hielscher Ultrasonicsは、高品質の生体分子を大量に生産するために、効率的な細胞溶解のための高性能超音波装置を提供します。

細胞工場からの分子抽出

大腸菌、枯草菌、シュードモナス・プティダ、ストレプトマイセス、コリネバクテリウム・グルタミカム、ラクトコッカス・ラクチ、シアノバクテリア、サッカロマイセス・セレビシエ、ピキア・パストリス、ヤロウィア・リポリティカ、ニコチアナ・ベントハミアナ、藻類などである。これらの細胞工場は、タンパク質、脂質、生化学物質、ポリマー、バイオ燃料、オレオケミカルを生産することができ、これらは食品や工業用途の原料として使用される。細胞工場として使用される細胞は、密閉式バイオリアクターで培養され、高効率、特異性、低エネルギー所要を達成することができる。
バイオエンジニアリングされた細胞培養物から標的分子を単離するためには、細胞を破壊して細胞内物質を放出させなければならない。超音波細胞破砕機は、細胞破砕と化合物放出のための信頼性が高く効率的な技術として確立されている。

微生物細胞工場は、様々な価値ある化合物の合成に使用される代謝的に操作された細胞である。超音波による細胞破砕は、細胞内部から貴重な化合物を放出する効率的で信頼性の高い方法である。
study and graphic: ©Villaverde, 2010.

超音波細胞破砕機の利点

非熱的で温和でありながら非常に効率的な技術である超音波破砕機は、細胞を溶解し、細胞工場から分子を単離するために使用されるなど、高品質の抽出物を製造するために研究室や産業界で使用されている。

パワー超音波による微生物細胞工場の効率的破壊

超音波による細胞破壊のメカニズムと効果：
超音波細胞破砕は、超音波の力を利用した。超音波ホモジナイザー／細胞破砕機は、約20kHzの高周波で振動するチタン合金製のプローブ（別名ソノトロード）を備えている。つまり、超音波プローブは1秒間に20,000回の振動を超音波処理された液体に結合する。液体に結合される超音波は、高圧と低圧を交互に繰り返すのが特徴である。低圧サイクルの間、液体は膨張し、微小な真空泡が発生する。これらの非常に小さな気泡は、それ以上のエネルギーを吸収できなくなるまで、数回の圧力サイクルを交互に繰り返しながら成長します。この時点で、キャビテーション気泡は激しく破裂し、局所的に異常なエネルギー密度の環境を作り出します。この現象は音響キャビテーションとして知られ、局所的に非常に高い温度、非常に高い圧力、せん断力を特徴とする。これらのせん断応力は細胞壁を効率的に破壊し、細胞内部と周囲の溶媒との間の物質移動を増加させる。純粋に機械的な手法として、超音波で発生させたせん断力は広く使われており、バクテリアの細胞破砕やタンパク質の単離に推奨されている。シンプルで迅速な細胞破砕法として、超音波破砕は小、中、大容量の分離に理想的です。Hielscherのデジタル超音波装置は、正確な超音波処理コントロールのための明確な設定メニューを備えています。すべての超音波処理データは内蔵のSDカードに自動的に保存され、簡単にアクセスできます。超音波分解プロセス中の外部冷却、パルスモードでの超音波処理などの高度な放熱オプションにより、理想的なプロセス温度を維持し、抽出された熱に敏感な化合物の無傷性を保証します。

超音波による細胞破砕・抽出の強みを強調する研究結果

Chemat教授ら（2017）はその研究の中で、「超音波アシスト抽出は、食品や天然物に対する従来の技術に代わる、環境に優しく経済的に実行可能な代替技術である」と述べている。主な利点は、抽出と処理時間の短縮、使用するエネルギーと溶媒の量の減少、単位操作、CO₂ 排出量を削減する。
Gabig-Ciminskaら（2014年）は、DNAを放出させるための胞子の溶解に、高圧ホモジナイザーと超音波細胞破砕機を用いた。両者の細胞破砕法を比較した研究チームは、胞子DNAのための細胞溶解について、「高圧ホモジナイザーによる細胞溶解物を用いて解析が行われた。その後、この目的には超音波細胞破砕法が優れていることに気づきました。超音波による細胞破砕は高速で、少量のサンプルでも処理できる」（Gabig-Ciminska）。(Gabig-Ciminska et al., 2014)

食品製造のための細胞工場からの生体分子

微生物細胞工場は、細菌、酵母、真菌などの微生物微生物の代謝バイオエンジニアリングによって、ネイティブおよびノンネイティブの代謝産物を高収率で生産するための、微生物生物を用いた実行可能で効率的な生産方法論である。バルク酵素は、例えば麹菌、真菌、バクテリアなどの微生物を用いて生産される。これらのバルク酵素は、食品や飲料の製造、農業、バイオエネルギー、家庭でのケアに使用される。
アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）やグルコナセトバクター・キシリヌス（Gluconacetobacter xylinus）のような特定のバクテリアは、発酵過程でセルロースを生産し、ナノファイバーはボトムアッププロセスで合成される。バクテリアセルロース（微生物セルロースとも呼ばれる）は、化学的には植物セルロースと同等であるが、結晶化度が高く、純度が高い（リグニン、ヘミセルロース、ペクチン、その他の生物由来成分を含まない）だけでなく、セルロースナノファイバーが三次元（3D）網目状に織り込まれたユニークな構造を持つ。(植物由来のセルロースと比較して、バクテリアセルロースはより持続可能であり、生産されるセルロースは複雑な精製工程を必要としない純粋なものである。バクテリア細胞からバクテリアセルロースを分離するには、超音波処理とNaOHやSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いた溶媒抽出が非常に効果的である。

医薬品およびワクチン製造のための細胞工場からの生体分子

細胞工場由来の最も著名な医薬品のひとつに、ヒト・インスリンがある。バイオエンジニアリングによるインスリンの生産には、主に大腸菌とサッカロマイセス・セレビシエが使用される。生物学的に合成されたナノサイズの分子は高い生体適合性を持つため、フェリチンのような生物学的ナノ粒子は多くの生物製造用途に有利である。さらに、代謝的に操作された微生物での生産は、得られる収率が著しく効率的であることが多い。例えば、アルテミシン酸、レスベラトロール、リコピンの生産量は10倍から数百倍に増加し、すでに工業的規模の生産が確立されているか、開発中である。(Liuら；Microb. Cell Fact. 2017参照）。
例えば、フェリチンやウイルス様粒子のような自己組織化特性を持つタンパク質ベースのナノサイズ生体分子は、病原体のサイズと構造の両方を模倣し、免疫細胞との相互作用を促進するために抗原を表面に結合させることが可能であるため、ワクチン開発にとって特に興味深い。このような分子は、特定の標的分子を産生する、いわゆる細胞工場（例えば、操作された大腸菌株）で発現される。

フェリチン放出のための大腸菌BL21の超音波溶解とプロトコール

フェリチンはタンパク質の一種で、主な機能は鉄の貯蔵である。フェリチンは、ワクチンの自己組織化ナノ粒子として有望な能力を示し、ワクチンデリバリービークルとして使用されている（例えば、SARS-Cov-2スパイクタンパク質）。Sunら（2016）の科学的研究は、組換えフェリチンが低NaCl濃度（≦50mmol/L）で大腸菌から可溶性形態として放出できることを示している。大腸菌BL21でフェリチンを発現させ、フェリチンを放出させるために、以下のプロトコルを適用することに成功した。組換えpET-28a/フェリチンプラスミドを大腸菌BL21（DE3）株に形質転換した。フェリチン大腸菌BL21（DE3）細胞を、0.5％カナマイシンを添加したLB増殖培地で37℃で培養し、0.4％イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドでOD600が0.6になるように37℃で3時間誘導した。最終培養液を8000g、10分間、4℃で遠心分離し、ペレットを回収した。次に、このペレットをLB培地（1% NaCl、1% Typone、0.5%酵母エキス）/溶解バッファー（20 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、pH 7.6）およびそれぞれ異なる濃度のNaCl溶液（0、50、100、170、300 mmol/L）に再懸濁した。細菌細胞の溶解には、パルスモードで超音波処理を行った。 超音波発生装置 UP400St を100％の振幅で、5秒ON、10秒OFFのデューティサイクルで40サイクル）、10,000gで15分間、4℃で遠心した。上清と沈殿物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分析した。ドデシル硫酸ナトリウムで染色したゲルはすべて高解像度スキャナーでスキャンした。ゲル画像はMagic Chemi 1Dソフトウェアを用いて解析した。最適な鮮明度を得るため、パラメーターを調整してタンパク質バンドを検出した。バンドのデータはテクニカルトリプリケートから作成した。(参照：Sun et al.）

産業用超音波細胞破砕装置

超音波による溶解と抽出は、細胞工場から代謝産物を放出するための信頼性が高く快適な方法であり、それによって標的分子の効率的な生産を支援する。超音波細胞破砕機はラボ用から工業用まであり、プロセスは完全に直線的にスケールアップできる。
Hielscher Ultrasonics社は、高性能超音波ディスラプターの有能なパートナーであり、ベンチトップおよび産業環境における超音波システムのインプラント分野で長年の経験を持っています。
洗練されたハードウェアとソフトウェアに関して言えば、Hielscher Ultrasonicsの細胞破砕システムは、最適なプロセス制御、簡単な操作、使いやすさのためのすべての要件を満たしています。Hielscher社製超音波破砕機のお客様やユーザーは、Hielscher社製超音波細胞破砕機と抽出機が、正確なプロセスモニタリングと制御を可能にするという利点を高く評価しています。 – デジタルタッチディスプレイとブラウザーによるリモートコントロール。すべての重要な超音波処理データ（正味エネルギー、総エネルギー、振幅、時間、温度、圧力など）は、内蔵のSDカードにCSVファイルとして自動的に保存されます。これにより、再現性と反復性のある結果を得ることができ、プロセスの標準化や適正製造基準（cGMP）の遵守が容易になります。
もちろん、Hielscher社の超音波処理装置は、24時間365日のフル稼働を前提に設計されているため、工業生産現場でも確実に稼働させることができます。高い堅牢性と低メンテナンス性により、超音波処理装置のダウンタイムは極めて低くなっています。CIP（定置洗浄）およびSIP（定置殺菌）機能により、特にウェットパーツがすべて滑らかな金属表面（隠れたオリフィスやノズルがない）であるため、手間のかかる洗浄を最小限に抑えることができます。

下の表は、超音波処理装置の処理能力の目安です：