工業生産における生物工学的に改変された細胞の超音波溶解

E. coliなどの生物工学的に改変された細菌種や、遺伝子改変された哺乳類および植物の細胞種は、分子を発現させるためにバイオテクノロジーで広く使用されています。これらの合成された生体分子を放出させるには、信頼性の高い細胞破砕技術が必要です。高性能な超音波処理は、効率的かつ確実な細胞溶解のための実証済みの方法です – 大きな処理能力へ容易にスケールアップできます。Hielscher Ultrasonicsは、高品質な生体分子を大量に生産するために、効果的な細胞溶解を実現する高性能超音波装置を提供しています。

細胞ファクトリーからの分子の抽出

多様な生体分子を生産するために、さまざまな改変微生物や植物細胞を微生物細胞ファクトリーとして使用できます。その例には、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Pseudomonas putida、Streptomyces、Corynebacterium glutamicum、Lactococcus lacti、シアノバクテリア、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Yarrowia lipolytica、Nicotiana benthamiana、藻類など、数多くの生物が含まれます。これらの細胞ファクトリーは、タンパク質、脂質、生化学物質、ポリマー、バイオ燃料、油脂由来化学品を生産でき、これらは食品や工業用途の原料として使用されます。細胞ファクトリーとして使用される細胞は、密閉型バイオリアクターで培養され、高い効率と特異性、低いエネルギー所要量を達成できます。
生物工学的に改変された細胞の培養物から標的分子を単離するには、細胞を破砕して細胞内物質を放出させる必要があります。超音波細胞破砕装置は、細胞の崩壊と化合物の放出を実現する、信頼性と効率が非常に高い技術として確立されています。

微生物細胞ファクトリーは、さまざまな有用化合物の合成に使用される、代謝工学的に改変された細胞です。超音波細胞破砕は、細胞内部から有用化合物を放出させるための効率的で信頼性の高い方法です。
研究および図：©Villaverde, 2010.

超音波細胞破砕装置の利点

超音波細胞破砕装置は、非熱的で穏やかでありながら非常に効率的な技術として、ラボや産業分野で細胞の溶解と高品質な抽出物の製造に使用されています。例えば、細胞ファクトリーからの分子の単離に利用されています。

微生物細胞ファクトリーを効率的に破砕する高出力超音波

超音波細胞破砕装置の機構と効果：
超音波細胞破砕は、超音波の力を利用します。超音波ホモジナイザー／細胞破砕装置には、約20 kHzの高周波で振動するチタン合金製プローブ（ソノトロードとも呼ばれます）が装備されています。これは、超音波プローブが超音波処理対象の液体に毎秒20,000回の振動を結合させることを意味します。液体に結合された超音波は、高圧／低圧の周期が交互に繰り返されることを特徴とします。低圧周期では液体が膨張し、微小な真空気泡が発生します。これらの非常に小さな気泡は、圧力が交互に変化する周期を数回経る間に成長し、それ以上エネルギーを吸収できなくなります。この時点でキャビテーション気泡は激しく圧壊し、局所的に並外れてエネルギー密度の高い環境を作り出します。この現象は音響キャビテーションと呼ばれ、局所的な非常に高い温度、非常に高い圧力、せん断力を特徴とします。これらのせん断応力は細胞壁を効率的に破壊し、細胞内部と周囲の溶媒との間の物質移動を増大させます。超音波によって発生するせん断力を利用する方法は、純粋に機械的な技術として広く使用されており、細菌の細胞破砕やタンパク質の単離に推奨される手法です。超音波処理は、簡単で迅速な細胞破砕方法として、少量、中量、大量の試料からの単離に最適です。Hielscherのデジタル超音波処理装置には、超音波処理を精密に制御するための分かりやすい設定メニューが備わっています。超音波処理の全データは内蔵SDカードに自動的に保存され、簡単にアクセスできます。超音波細胞破砕工程中の外部冷却やパルスモードでの超音波処理など、高度な放熱オプションにより、理想的な処理温度が維持され、抽出された熱に敏感な化合物の完全性が保たれます。

超音波細胞破砕と抽出の強みを裏付ける研究

Chemat教授ら（2017）は研究の中で、次のようにまとめています。「超音波支援抽出は、食品や天然物に対する従来技術に代わる、環境に配慮した経済的に実行可能な方法です。主な利点は、抽出時間と処理時間、使用するエネルギー量と溶媒量、単位操作数、およびCO₂ 排出量の削減です。」
Gabig-Ciminskaら（2014）は、DNAを放出させるための胞子の溶解に関する研究で、高圧ホモジナイザーと超音波細胞破砕装置を使用しました。研究チームは、両方の細胞破砕方法を比較し、胞子DNAを得るための細胞溶解について、次のように結論付けています。「高圧ホモジナイゼーションで得られた細胞溶解物を使用して分析を行いました。その後、この目的には超音波細胞破砕が際立った利点を持つことが分かりました。この方法はかなり速く、少量のサンプルでも処理できます。」（Gabig-Ciminska et al., 2014）

食品生産のための細胞ファクトリー由来の生体分子

微生物細胞ファクトリーは、細菌、酵母、真菌などの微生物に代謝生物工学的な改変を施し、微生物を利用して内在性および非内在性の代謝産物を高収量で生産する、実行可能で効率的な生産方法です。例えば、大量生産される酵素は、Aspergillus oryzaeなどの微生物、真菌、細菌を使用して製造されます。これらの酵素は、食品・飲料の生産に加え、農業、バイオエネルギー、家庭用ケア製品にも使用されます。
Acetobacter xylinumやGluconacetobacter xylinusなどの一部の細菌は、発酵工程中にセルロースを生産し、その際にナノファイバーがボトムアップ工程で合成されます。バクテリアセルロース（微生物セルロースとも呼ばれます）は、植物セルロースと化学的に同等ですが、高い結晶化度と高純度（リグニン、ヘミセルロース、ペクチン、その他の生物由来成分を含まない）に加え、セルロースナノファイバーが織り成す三次元（3D）網状ネットワークという独特の構造を持ちます。（cf. Zhong, 2020）植物由来セルロースと比較して、バクテリアセルロースは持続可能性がより高く、生産されたセルロースは純粋で、複雑な精製工程を必要としません。超音波処理と、NaOHまたはSDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を使用した溶媒抽出は、細菌細胞からバクテリアセルロースを単離するために非常に効果的です。

医薬品およびワクチン生産のための細胞ファクトリー由来の生体分子

細胞ファクトリー由来の最も代表的な医薬品の一つは、ヒトインスリンです。生物工学によるインスリン生産には、主にE. coliとSaccharomyces cerevisiaeが使用されます。生合成されたナノサイズの分子は高い生体適合性を示すため、フェリチンなどの生物由来ナノ粒子は、数多くのバイオ製造用途で有利です。また、代謝工学的に改変された微生物による生産は、得られる収量の点で著しく効率的であることが多くあります。例えば、アルテミシニン酸、レスベラトロール、リコペンの生産量は十倍–数百倍に増加しており、工業規模の生産がすでに確立されているか、その実現に向けた開発が進められています。（cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017）
例えば、フェリチンやウイルス様粒子など、自己組織化特性を持つタンパク質ベースのナノサイズ生体分子は、ワクチン開発において特に注目されています。これらは病原体のサイズと構造の両方を模倣し、免疫細胞との相互作用を促進するために抗原を表面に結合させることができます。このような分子は、特定の標的分子を生産する、いわゆる細胞ファクトリー（例えば、改変されたE. coli株）で発現されます。

フェリチンを放出させるためのE. coli BL21の超音波溶解プロトコル

フェリチンは、鉄の貯蔵を主な機能とするタンパク質です。フェリチンは、ワクチンにおける自己組織化ナノ粒子として有望な能力を示しており、ワクチン送達担体（例えば、SARS-Cov-2スパイクタンパク質の送達）として使用されます。Sunら（2016）の科学研究は、低NaCl濃度（≤50 mmol/L）で、組換えフェリチンをEscherichia coliから可溶性の形態で放出させることができることを示しています。E. coli BL21でフェリチンを発現させ、フェリチンを放出させるために、以下のプロトコルが適用され、成功しました。組換えpET-28a/ferritinプラスミドをE coli BL21 (DE3)株に導入して形質転換しました。フェリチンを発現するE coli BL21 (DE3)細胞を、0.5%カナマイシンを含むLB増殖培地中で37°Cで培養し、OD600が0.6の時点で0.4%イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを用いて37°Cで3時間、発現を誘導しました。その後、最終培養物を4°Cで10分間、8000gで遠心分離して回収し、ペレットを採取しました。次に、ペレットをLB培地（1% NaCl、1% Typone、0.5%酵母エキス）／溶解バッファー（20 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、pH 7.6）および異なる濃度のNaCl溶液（0、50、100、170、300 mmol/L）に、それぞれ再懸濁しました。細菌細胞の溶解には、パルスモードの超音波処理を適用しました。例えば、 超音波処理装置UP400St を使用して、振幅100%、5秒間ON、10秒間OFFのデューティサイクルで40サイクル処理し）、その後、4°Cで15分間、10 000gで遠心分離しました。上清と沈殿物を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分析しました。ドデシル硫酸ナトリウムで染色されたすべてのゲルを、高解像度スキャナーでスキャンしました。ゲル画像はMagic Chemi 1Dソフトウェアを使用して分析しました。最適な鮮明度を得るため、パラメーターを調整してタンパク質バンドを検出しました。バンドのデータは、技術的な三反復から得られました。（cf. Sun et al., 2016）

細胞ファクトリーの工業的溶解のための超音波細胞破砕装置

超音波による溶解と抽出は、細胞ファクトリーから代謝産物を放出させる、信頼性が高く使いやすい方法であり、標的分子の効果的な生産を支援します。超音波細胞破砕装置は、ラボ用から工業用サイズまで提供されており、プロセスを完全に線形にスケールアップできます。
Hielscher Ultrasonicsは、高性能超音波細胞破砕装置に関する専門性を備えたパートナーであり、卓上規模や工業規模の環境に超音波システムを導入する分野で長年の経験を持っています。
高度なハードウェアとソフトウェアに関して、Hielscher Ultrasonicsの細胞破砕システムは、最適なプロセス制御、簡単な操作、使いやすさに対するすべての要件を満たしています。Hielscher超音波処理装置の顧客とユーザーは、Hielscherの超音波細胞破砕装置と抽出装置が、デジタルタッチディスプレイとブラウザーによる遠隔操作を通じて、精密なプロセス監視と制御を可能にするという利点を高く評価しています。重要な超音波処理データ（例えば、正味エネルギー、総エネルギー、振幅、処理時間、温度、圧力）はすべて、内蔵SDカードにCSVファイルとして自動保存されます。これにより、再現性と反復性のある結果を得やすくなり、プロセスの標準化と適正製造規範（cGMP）への適合が促進されます。
もちろん、Hielscherの超音波プロセッサーは全負荷での24/7運転に対応するよう設計されているため、工業生産環境で確実に運転できます。高い堅牢性と少ないメンテナンスにより、超音波装置の停止時間は非常に短くなります。CIP（定置洗浄）およびSIP（定置滅菌）機能により、手間のかかる洗浄作業が最小限に抑えられます。特に、すべての接液部が滑らかな金属表面であり、隠れた開口部やノズルがないことが、その効果に寄与しています。

以下の表は、当社の超音波処理装置のおおよその処理能力の目安を示しています。