ヒト乳オリゴ糖の生合成生産

発酵または酵素反応によるヒトミルクオリゴ糖（HMOs）の生合成は、複雑で、消費的で、しばしば低収量のプロセスである。超音波処理は、基質と細胞工場間の物質移動を増加させ、細胞の成長と代謝を刺激する。それにより、超音波処理は発酵および生物化学的プロセスを強化し、HMOsの生産を加速し、より効率的にする。

ヒトミルクオリゴ糖

ヒトミルクオリゴ糖（HMO）は、ヒトミルクグリカンとしても知られ、オリゴ糖グループの一部である糖分子である。HMOの顕著な例としては、2'-フコシラクトース（2′-FL）、ラクト-N-ネオテトラオース（LNnT）、3'-ガラクトシルラクトース（3′-GL）、そしてジフコシラクトース（DFL）である。
ヒト母乳は150以上の異なるHMO構造から構成されているが、現在商業レベルで生産され、乳児用調製粉乳の栄養添加物として使用されているのは2′-フコシラクトース（2′-FL）とラクト-N-ネオテトラオース（LNnT）のみである。
ヒトミルクオリゴ糖（HMOs）は、乳児栄養におけるその重要性で知られている。ヒトミルクオリゴ糖はユニークなタイプの栄養素であり、乳児の腸内でプレバイオティクス、付着防止抗菌剤、免疫調節剤として作用し、脳の発達に大きく寄与します。HMOはヒトの母乳にのみ見出され、他の哺乳類のミルク（例えば、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ラクダなど）にはこのような特殊な形のオリゴ糖はありません。
ヒト乳オリゴ糖は、ヒト乳中に3番目に多く含まれる固形成分であり、水に溶けた状態か、乳化または懸濁した状態で存在する。ラクトースと脂肪酸はヒト乳中に最も豊富に存在する固体である。HMOは0.35-0.88オンス（9.9-24.9g）/Lの濃度で存在する。約200種類の構造的に異なるヒト乳オリゴ糖が知られている。全女性の80％において支配的なオリゴ糖は2′-フコシラクトースは、ヒトの母乳中に約2.5g/Lの濃度で存在する。
HMOは消化されないので、カロリー的には栄養に寄与しない。難消化性炭水化物であるため、プレバイオティクスとして機能し、望ましい腸内細菌叢、特にビフィズス菌によって選択的に発酵される。

ヒト乳汁オリゴ糖の生合成

細胞工場および酵素／化学酵素システムは、HMOs の合成に使用される現在の技術である。工業的規模での HMO 生産のためには、微生物細胞工場の発酵、生物化学的合成および異なる酵素反応が HMO バイオ生産の実現可能な方法である。経済的な理由から、微生物細胞工場を介した生物合成は、現在、HMOsの工業生産レベルで使用されている唯一の技術である。

微生物細胞工場を用いたHMOsの発酵

大腸菌、Saccharomyces cerevisiae および Lactococcus lactis は、HMOs のような生物学的分子の生物学的生産に用いられる一般的な細胞工場である。発酵は、基質を標的生物学的分子に変換するために微生物を用いる生化学的プロセスである。微生物細胞工場は基質として単糖を使用し、これを HMOs に変換する。単糖（例えば乳糖）は豊富で安価な基質であるため、生物合成プロセスはコスト効率に優れている。
増殖と生物変換速度は、主に微生物への栄養素（基質）の物質移動に影響される。物質移動速度は、発酵中の生成物合成に影響を与える主な要因である。超音波処理は物質移動を促進することがよく知られている。
発酵中、バイオリアクター内の条件は、標的生体分子（例えば、HMOs のようなオリゴ糖；インスリン；組換え蛋白質）を生産するために、細胞が可能な限り迅速に増殖できるように、常にモニターされ、調節されなければならない。理論的には、細胞培養が増殖し始めるとすぐに生成物の形成が始まる。しかし、特に人工微生物のような遺伝子組換え細胞では、通常、基質に化学物質を添加することにより、標的生体分子の発現をアップレギュレートすることにより、後に誘導される。超音波バイオリアクター（ソノ・バイオリアクター）は精密に制御でき、微生物に特異的な刺激を与えることができる。その結果、生合成が促進され、収量が向上する。
超音波溶解および抽出：複雑な HMO の発酵は、低い発酵力価および細胞内に残存する生成物により制限される可能性がある。超音波溶解および抽出は、精製および下流工程の前に細胞内物質を放出するために使用される。

超音波による発酵促進

大腸菌、人工大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）などの微生物の増殖速度は、制御された低周波超音波処理を適用することにより、物質移動速度と細胞壁透過性を高めることで加速させることができる。温和な非加熱処理技術として、超音波処理は純粋に機械的な力を発酵ブロスに加える。
音響キャビテーション：超音波処理の原理は、音響キャビテーションに基づいている。超音波プローブ（ソノトロード）は、低周波超音波を媒体に結合します。超音波は液体中を伝わり、高圧（圧縮）/低圧（希釈）サイクルを交互に発生させます。液体を圧縮と伸張を交互に繰り返すことで、微小な真空の気泡が発生する。この小さな真空の気泡は、それ以上エネルギーを吸収できない大きさになるまで、数サイクルをかけて成長する。この最大成長の時点で、真空バブルは激しく崩壊し、キャビテーション現象として知られる局所的な極限状態を発生させる。キャビテーションの「ホットスポット」では、高い圧力・温度差と、最大280m/秒の液体ジェットを伴う激しいせん断力が観察される。これらのキャビテーション効果により、徹底した物質移動とソノポレーション（細胞壁と細胞膜の穿孔）が達成される。基質の栄養分が生きた全細胞に浮遊し、細胞工場に最適な栄養が供給され、成長と変換速度が加速される。超音波バイオリアクターは、ワンポット生合成プロセスでバイオマスを処理するための、シンプルでありながら非常に効果的な戦略である。
正確に制御されたマイルドな超音波処理は、発酵プロセスを強化するためによく知られている。
ソニケーションは、「基質取り込みの促進、細胞多孔性の増大による生産または増殖の促進、細胞成分の放出の潜在的促進を介して、生細胞を含む多くのバイオプロセスの生産性」を向上させる。(Naveena et al.）
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Naveenaら(2015)は、超音波インテンシフィケーションは、バイオプロセスにおいて、他の強化処理オプションと比較して運用コストが低いこと、操作が簡単であること、必要な電力が控えめであることなど、いくつかの利点があることを明らかにした。

高性能超音波発酵リアクター

発酵プロセスには、細胞工場として機能するバクテリアや酵母などの生きた微生物が関与しています。超音波処理は、物質移動を促進し、微生物の増殖と変換率を高めるために適用されるが、細胞工場の破壊を避けるためには、超音波強度を正確に制御することが極めて重要である。
Hielscher Ultrasonics社は、優れた発酵収率を確保するために精密に制御・監視できる高性能超音波発生装置の設計・製造・販売を行うスペシャリストである。

プロセス制御は、高い収率と優れた品質にとって不可欠であるばかりでなく、結果の反復と再現を可能にする。特に細胞工場の刺激に関しては、超音波処理パラメーターを細胞ごとに適合させることが、高い収率を達成し、細胞の劣化を防ぐために不可欠です。そのため、Hielscher社製超音波処理装置のすべてのデジタルモデルには、超音波処理パラメーターを調整、モニター、修正できるインテリジェントなソフトウェアが搭載されています。振幅、温度、圧力、超音波処理時間、デューティ・サイクルおよびエネルギー入力などの超音波処理パラメーターは、発酵による HMO 生産を促進するために不可欠である。
Hielscher社製超音波処理装置のスマートなソフトウェアは、すべての重要なプロセスパラメーターを内蔵のSDカードに自動的に記録します。超音波処理プロセスの自動データ記録は、GMP（Good Manufacturing Practice）に要求されるプロセスの標準化と再現性/反復性の基礎となります。

発酵用超音波レクター

Hielscher社は、様々なサイズ、長さ、形状の超音波プローブを提供しており、バッチ処理だけでなく、連続フロースルー処理にも使用できます。超音波リアクターはソノ・バイオリアクターとしても知られ、少量のラボサンプルからパイロット生産、完全商業生産レベルまで、超音波バイオプロセスをカバーするあらゆる容量に対応可能です。
反応容器内の超音波ソノトロードの位置が、培地内のキャビテーションとマイクロストリーミングの分布に影響することはよく知られている。ソノトロードと超音波リアクターは、細胞ブロスの処理量に応じて選択する必要がある。超音波処理はバッチ式でも連続式でも可能であるが、生産量が多い場合は連続フロー式装置の使用を推奨する。超音波フローセルを通過する全ての細胞培地は、全く同じ条件で超音波処理されるため、最も効果的な処理が保証されます。Hielscher Ultrasonics社の幅広い超音波プローブとフローセルリアクターにより、理想的な超音波バイオプロセス設備を構築することができます。

Hielscher Ultrasonics – ラボからパイロット、そして生産へ

Hielscher Ultrasonics社は、サンプル前処理用のコンパクトなハンドヘルド超音波ホモジナイザーから、ベンチトップおよびパイロットシステム、さらにはトラック1台分の処理量を簡単に処理できるパワフルな工業用超音波ユニットまで、あらゆる超音波装置を提供しています。多用途で柔軟な設置・取付オプションにより、Hielscherの超音波装置は、あらゆる種類のバッチリアクタ、フィードバッチ、連続フロースルーのセットアップに簡単に組み込むことができます。
様々なアクセサリーとカスタマイズされた部品により、超音波セットアップをお客様のプロセス要件に理想的に適合させることができます。
Hielscher社製超音波プロセッサは、24時間365日のフル負荷運転や過酷な条件下での高負荷運転に対応するよう設計されており、信頼性が高く、メンテナンスも少なくて済みます。
下の表は、超音波処理装置の処理能力の目安です：