固相ペプチド合成 – 超音波処理で効率アップ
固相ペプチド合成（SPPS）はペプチド合成の一般的な方法である。超音波は固相ペプチド合成を強化する信頼性の高いツールであり、高い収率、純度の向上、ラセミ化の防止、反応速度の大幅な加速をもたらします。Hielscher Ultrasonics社は、ペプチド合成、切断、溶解のための様々な超音波ソリューションを提供しています。
超音波を用いた固相ペプチド合成
超音波処理は、有機合成の強化法としてすでに広く応用されており、反応時間の大幅な短縮、収率の向上、副生成物の減少、他の方法では達成できなかった経路の開始、より優れた選択性などの利点でよく知られている。超音波処理をペプチド合成反応に組み合わせると、大きな利点が得られる。研究結果は、超音波アシストペプチド合成が、短い反応時間で、ラセミ化することなく、高純度のペプチドの最適化された収率を達成することを示している。
- 高いペプチド収率
- 合成の大幅な高速化
- より高いペプチド純度
- ラセミ化なし
- 様々なペプチドの並列合成
- あらゆる処理量に対応可能
ペプチド合成を向上させるために、複数の反応容器を均一に超音波処理するための超音波カップホーン。
メリフィールド法による固相ペプチド合成を示す図。超音波処理は、合成反応を促進・強化するだけでなく、合成されたペプチドを樹脂から切断するためにも用いられる。
グラフィック：©Conejos-Sanchez et al.）
| 研究 | 研究対象のペプチド | 反応時間（従来法とUS-SPPSの比較） | 原油の純度（従来法とUS-SPPSの比較） | ラセミ化と副反応 | 主なポイント |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański ら (2019) | メトエンケファリン、UB33-43-OCam、TAT48-60-NH2、B2m58-69-NH2、ACP65-74-NH2、β-エンドルフィン | 600～1920分 → 48～284分 | 24.2～71.3% → 60.6～89.9% | Cys/Hisについては、70°Cでも変化は認められなかった。 | 合成速度が約7～12倍向上。純度が大幅に向上し、特にTATのような凝集しやすい配列において顕著である。 |
| Silva ら (2021) | Pep1（12-mer）、Pep2（9-mer）、Pep3（25-mer） | >3515/365分 → 約250/85分（Pep1/Pep2）；Pep3：347分（米国のみ） | 73～84% → 72～82%（Pep1/Pep2） | 未検証。Pep2において純度のわずかな低下が確認された。 | Pep1の所要時間が14分の1に短縮され、粗収率が大幅に増加した。 |
| Merlino ら (2019) | モデル五ペプチド、最大44量体のペプチド、 “難しいシーケンス” (Aβ 1-42、ACP 65-74) | 60分 → 30分（モデル） | 84% → 93%（モデル）；熱加熱（約45°C）よりも有意に高い | Cys/Hisのエナンチオマーについては有意な増加は見られなかった | 処理が困難な、あるいは凝集しやすい配列に対して極めて効果的であり、高い純度を維持しつつ、試薬の過剰量を削減することができます。 |
超音波による固相ペプチド合成の改善
固相ペプチド合成（SPPS）は、不溶性の多孔性支持体上でアミノ酸誘導体を連続的に反応させてペプチド鎖を組み立てる化学反応である。しかし、従来の固相ペプチド合成は比較的効率が悪く、時間もかかる。そのため、ペプチド合成の超音波増強は、より効率的で迅速なペプチド合成のためのツールとして高く評価されている。
Silvaら（2021）は、比較を行った “古典的な” 超音波 （US）を用いたSPPS：線維芽細胞成長因子受容体3（FGFR3）特異的ペプチドPep1（VSPPLTLGQLLS-NH2）および新規ペプチドPep2（RQMATADEA-NH2）およびPep3 （AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2）の調製に基づく、超音波（US）を併用したSPPS。
米国が支援したSPPSにより、ペプチドの組み立てにかかる時間が、従来の方法と比較して14倍（Pep1）および4倍（Pep2）短縮された。 “古典的な” 方法。興味深いことに、超音波を併用したSPPSでは、Pep1の純度が（82％）と、 “古典的な” SPPS（73%）。大幅な時間短縮と、得られた粗ペプチドの高い純度を背景に、研究チームは、疎水性アミノ酸やホモオリゴ配列を多数含む大型ペプチド「Pep3」に対して、超音波補助SPPSを適用することにした。 驚くべきことに、この25残基ペプチドの合成は、6時間未満（347分）で、適度な純度（約49％）で達成された。
超音波攪拌を用いた固相ペプチド合成によるペプチド合成の高速化。
(調査と分析：Wołczański他、2019年）。
Merlinoら（2019）も、Fmoc法に基づく固相ペプチド合成に対する超音波の影響について包括的な研究を行い、これにより、さまざまな生物活性ペプチド（最大44残基）の合成が可能となり、試薬や反応時間を大幅に削減できた。 彼らは、超音波処理が主要な副反応を悪化させることはなく、以下の特性を備えたペプチドの合成を改善することを実証した。 “難しいシーケンス”超音波による固相ペプチド合成(US-SPPS)は、現在の高効率ペプチド合成ストラテジーに位置づけられている。
ペプチドの超音波（音波）合成のための高性能システムが利用できるようになったことで、合成速度の大幅な向上と原料生成物の純度の向上が可能になった。(Wołczański et al.）
ラセミ化の検討。室温で古典的な方法を用いて手動で合成したモデルペプチドと、高温で超音波法を用いて合成したモデルペプチドの有意な1H NMRスペクトルの比較。HisとCysのα-プロトンとAcmのメチレン基の化学シフト（左のパネル）、Valのɣ-メチルプロトン（右のパネル）は、70℃の超音波処理ではラセミ化は起こらないことを示している。
(調査と分析：Wołczański他、2019年）。
ペプチドの超音波切断
固相ペプチド合成（SPPS）の後、合成されたペプチドは高分子樹脂から切断されなければならない。このステップは脱保護としても知られている。樹脂からのペプチド切断に一般的な振盪法と超音波処理を比較すると、振盪法では約1時間を要するのに対し、超音波切断では15～20分で達成できる。超音波によるペプチド切断は、ポリスチレン樹脂にベンジルエステル結合で結合した保護アミノ酸やペプチドの切断に応用できる。
ポリスチレン樹脂からのペプチドの超音波切断は、迅速な手順で、ラセミ化することなく、高純度のペプチドを高収率で得ることができる。
(図と写真：©Anuradha and Ravindranath, 1995）
超音波攪拌リアクターによるペプチド合成の改良と加速。写真は 超音波発生装置 UP200St を攪拌ガラス反応器に入れた。
ペプチド合成用高性能超音波発生装置
Hielscher Ultrasonics社は、直接超音波処理と間接超音波処理のための様々な超音波ソリューションを提供しています。パワフルで精密に制御可能な超音波プロセッサーは、反応容器に正確に適切な量の超音波エネルギーを供給します。シリンジ、チューブ、マルチウェルプレート、ガラス製反応容器など、Hielscher Ultrasonicsはお客様のペプチドアプリケーションに最適な超音波処理装置を提供します。
- カスタマイズペプチド
- 大規模ペプチド生産
- ペプチドライブラリー
多くのペプチド合成はシリンジ（例えば、フリットシリンジリアクター）で行われる。Hielscher社の超音波シリンジ攪拌機は、シリンジ壁を通して超音波を液体に結合させ、ペプチド溶液を超音波処理する。超音波シリンジ攪拌機は、ペプチドの超音波支援合成のための最も一般的な超音波ソリューションの一つである。
超音波カップホーンは、最大5つの反応容器を超音波処理するのに適したツールであり、VialTweeterは、最大10本の反応チューブに加え、クランプオンアクセサリーを介してさらに5つの大型容器を保持することができる。
メリフィールド型やカミシュ型などの固相反応器、およびその他のポリプロピレン製やホウケイ酸ガラス製の容器や反応器については、ヒールシャー社は、カスタマイズされたクランプオン式取り付けまたはフランジを備えた、間接および直接超音波処理用のソニケーターを提供しています。
もちろん、溶液相合成などに用いられる大型の撹拌式ガラス反応器には、あらゆるサイズの超音波プローブ（ソノトロードや超音波ホーンとも呼ばれる）を容易に取り付けることができます。
- 各種超音波発生装置
- 直接・間接超音波処理
- 正確な強度制御
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- 連続またはパルス超音波
- スマート機能、プログラマブル・デバイス
- どのボリュームでも利用可能
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マルチウェル／マイクロタイタープレートを用いた固相ペプチド合成には、UIP400MTPが最適な装置です。超音波キャビテーションが多数のサンプルウェルに間接的に均一に伝達されるため、優れた物質移動と合成反応が実現します。以下の動画をご覧いただき、その マイクロプレート用超音波処理装置「UIP400MTP」の稼働風景！
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Hielscher Ultrasonics社は、ラボスケール、パイロットスケール、工業スケールの混合アプリケーション、分散、乳化、抽出用の高性能超音波ホモジナイザーを製造しています。
超音波ペプチド合成について知っておくべき事実
ペプチドとは何ですか？
ペプチドは、複数のアミノ酸がアミド結合、いわゆるペプチド結合を介して結合した化合物である。複雑な構造で結合すると – 通常50個以上のアミノ酸からなり、これらの大きなペプチド構造をタンパク質と呼ぶ。ペプチドは生命維持に不可欠な構成要素であり、体内で数多くの機能を果たしている。
ペプチド合成はどのように行われるのでしょうか？
有機化学、分子生物学、生命科学において、ペプチド合成はペプチドを製造するプロセスである。ペプチドは、あるアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のアミノ基との縮合反応によって化学的に合成される。通常、様々なアミノ酸側鎖との望ましくない副反応を避けるために、保護基（保護基ともいう）戦略が用いられる。
化学的（in-vitro）ペプチド合成は、多くの場合、入力アミノ酸のカルボキシル基（C末端）を成長するペプチド鎖のN末端に結合させることから始まる。このC末端からN末端への合成とは逆に、生体内の長いペプチドの天然タンパク質生合成は逆の方向で行われる。つまり生合成では、入力アミノ酸のN末端がタンパク質鎖のC末端に連結される（N-to-C）。
ペプチド合成の研究開発プロトコルのほとんどは固相法に基づいているが、溶液相合成法はペプチドの大規模工業生産に見られる。
ペプチド合成における現在の最先端技術とはどのようなものか？
SUS-SPPS（持続可能な超音波補助SPPS） この方法により、1サイクルあたりの工程をわずか2ステップ（カップリング・キャッピング・脱保護の統合工程＋1回の洗浄）に短縮できることが実証されており、溶媒の消費量と所要時間を大幅に削減できる。（参照：Mottola et al., 2025）
超音波補助TAPS これは、全合成（例：リポバクチン）においてその有効性が実証されている新たな組み合わせであり、API製造に向けてCDMO各社によって検討が進められている。
超音波を併用したTAGGINGペプチド合成のメリットをご覧ください！
連続処理 さらなる機能強化の一環として検討が進められている – シリル化タグを利用した連続ワンポット合成プラットフォームが報告されている。
この分野はグリーンケミストリーの原則へと移行しつつあり、超音波とTAPSはいずれも、溶媒使用量の削減、試薬投入量の低減、および持続可能性の向上に寄与しています。
文献・参考文献
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
