固相ペプチド合成 – 超音波処理で効率を向上
固相ペプチド合成（SPPS）は、ペプチド合成で一般的に用いられる方法です。超音波処理は、固相ペプチド合成を促進する信頼性の高い手段であり、収率の向上、純度の改善、ラセミ化の防止、反応速度の大幅な向上をもたらします。Hielscher Ultrasonicsは、ペプチドの合成、切り出し、溶解に向けたさまざまな超音波ソリューションを提供しています。
超音波による固相ペプチド合成
超音波処理は、有機合成を促進する方法としてすでに広く利用されており、反応時間の大幅な短縮、収率の向上、副生成物の低減、他の方法では実現できない反応経路の開始、選択性の向上といった利点でよく知られています。ペプチド合成反応に超音波処理を組み込む場合にも、大きな利点が得られます。研究結果から、超音波支援ペプチド合成では、短い反応時間でラセミ化を起こさずに、高純度のペプチドを最適化された収率で得られることが示されています。
- 高いペプチド収率
- 合成の大幅な高速化
- ペプチド純度の向上
- ラセミ化なし
- さまざまなペプチドの並列合成
- あらゆる容量にスケールアップ可能
複数の反応容器を均一に超音波処理し、ペプチド合成を改善する超音波CupHorn。
Merrifield固相ペプチド合成を示す図。超音波処理は、合成反応の促進と強化に加え、合成したペプチドを樹脂から切り出すためにも使用されます。
図：©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| 研究 | 研究対象のペプチド | 反応時間（従来法とUS-SPPSの比較） | 粗生成物の純度（従来法とUS-SPPSの比較） | ラセミ化と副反応 | 主な知見 |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | メチオニンエンケファリン、UB33-43-OCam、TAT48-60-NH2、B2m58-69-NH2、ACP65-74-NH2、β-エンドルフィン | 600–1920 min → 48–284 min | 24.2–71.3% → 60.6–89.9% | 70°CでもCys/Hisについては観察されず | ~7–12倍の速さで合成。特にTATなどの凝集しやすい配列で、純度が大幅に向上。 |
| Silva et al. (2021) | Pep1（12量体）、Pep2（9量体）、Pep3（25量体） | >3515/365 min → ~250/85 min（Pep1/Pep2）；Pep3：347 min（USのみ） | 73–84% → 72–82%（Pep1/Pep2） | 未試験。Pep2でわずかな純度低下が認められた | Pep1の所要時間を14分の一に短縮。粗生成物の収率が大幅に向上。 |
| Merlino et al. (2019) | モデルペンタペプチド、最大44量体のペプチド、「合成困難な配列」（Aβ 1-42、ACP 65-74） | 60 min → 30 min（モデル） | 84% → 93%（モデル）；加熱（~45°C）よりも大幅に高い | Cys/Hisのエナンチオマーに有意な増加なし | 合成困難な配列や凝集しやすい配列に非常に有効。高純度を維持しながら、試薬の過剰使用量を低減できる。 |
超音波で改善する固相ペプチド合成
固相ペプチド合成（SPPS）は、不溶性の多孔質担体上でアミノ酸誘導体を逐次反応させることで、ペプチド鎖を構築できる化学反応です。しかし、従来の固相ペプチド合成は、比較的効率が低く、時間のかかるプロセスです。そのため、超音波によるペプチド合成の促進は、ペプチドをより効果的かつ迅速に合成する手段として高く評価されています。
Silva et al. (2021)は、三種類のペプチド、すなわち線維芽細胞増殖因子受容体3（FGFR3）に特異的なペプチドPep1（VSPPLTLGQLLS-NH2）と、新規ペプチドPep2（RQMATADEA-NH2）およびPep3（AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2）の調製に基づいて、「従来の」フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）固相ペプチド合成（SPPS）と、超音波（US）支援SPPSを比較しました。
US支援SPPSでは、「従来法」と比較して、ペプチド鎖の構築にかかる時間がPep1で14分の一、Pep2で4分の一に短縮されました。興味深いことに、超音波支援SPPSでは、「従来の」SPPS（73%）よりも高い純度（82%）でPep1が得られました。大幅な時間短縮と高い粗ペプチド純度が得られたことから、研究チームは、疎水性アミノ酸を多数含み、ホモオリゴマー配列を有する大型ペプチドPep3にUS支援SPPSを適用しました。注目すべきことに、この25量体ペプチドは、6時間未満（347 min）で、中程度の純度（約49%）で合成されました。
超音波撹拌を用いた固相ペプチド合成による、ペプチド合成の高速化。
（研究と分析：Wołczański et al., 2019）
Merlino et al. (2019)も、Fmocを用いた固相ペプチド合成に対する超音波の効果を包括的に研究し、材料と反応時間を著しく削減しながら、さまざまな生物活性ペプチド（最大44量体）を合成しました。この研究では、超音波処理が主要な副反応を悪化させず、「合成困難な配列」を持つペプチドの合成を改善することが示され、超音波促進固相ペプチド合成（US-SPPS）は、現在の高効率なペプチド合成戦略の一つとして位置づけられました。
ペプチドの超音波合成に利用できる高性能システムにより、合成速度の大幅な向上と粗生成物の純度向上が可能になります。（参照：Wołczański et al., 2019）
ラセミ化の検討。室温で従来法を用いて手動合成したモデルペプチドと、高温で超音波法を用いて合成したモデルペプチドの、主要な1H NMRスペクトルの比較。HisおよびCysのαプロトンとAcmのメチレン基（左のパネル）、Valのɣ-メチルプロトン（右のパネル）の化学シフトは、70°Cでの超音波処理がラセミ化を引き起こさないことを示しています。
（研究と分析：Wołczański et al., 2019）
超音波によるペプチドの切り出し
固相ペプチド合成（SPPS）の後、合成したペプチドを高分子樹脂から切り出す必要があります。この工程は脱保護とも呼ばれます。樹脂からペプチドを切り出すための一般的な振とうと超音波処理を比較すると、振とう法には約1時間かかるのに対し、超音波による切り出しは15–20 minで完了できます。超音波によるペプチドの切り出しは、ベンジルエステル結合を介してポリスチレン樹脂に結合した、保護されたアミノ酸やペプチドの切り出しに適用できます。
ポリスチレン樹脂からの超音波によるペプチドの切り出しでは、迅速な操作で、ラセミ化を起こさずに高純度のペプチドを高収率で得られます。
（研究と図：©Anuradha and Ravindranath, 1995）
ペプチド合成の改善と高速化に向けた、超音波撹拌式反応器。写真では、 超音波装置UP200St が撹拌式ガラス反応器内に設置されています。
ペプチド合成用の高性能超音波装置
Hielscher Ultrasonicsは、直接および間接超音波処理に向けたさまざまな超音波ソリューションを提供しています。強力で精密に制御できる超音波プロセッサーが、反応容器に適切な量の超音波エネルギーを正確に供給します。合成容器としてシリンジ、チューブ、マルチウェルプレート、ガラス反応器のいずれを使用する場合でも、Hielscher Ultrasonicsは、お客様のペプチド用途に最適な超音波装置を提供します。
- カスタマイズされたペプチド
- ペプチドの大規模生産
- ペプチドライブラリー
多くのペプチド合成は、シリンジ（例えば、フリット付きシリンジ反応器）内で行われます。Hielscherの超音波シリンジ撹拌装置は、シリンジ壁を通して液体中に超音波を結合させ、ペプチド溶液を超音波処理します。この超音波シリンジ撹拌装置は、超音波支援ペプチド合成で最も人気のある超音波ソリューションの一つです。
超音波CupHornは、最大5個の反応容器を超音波処理するのに適した装置です。一方、VialTweeterは、最大十本の反応チューブに加え、クランプ式アクセサリーを介して、さらに五個のより大きな容器を保持できます。
MerrifieldまたはKamysz固相反応器などの他の種類の反応器や、その他のポリプロピレン製またはホウケイ酸ガラス製の容器および反応器に対して、Hielscherは、カスタマイズされたクランプ式取り付け部またはフランジを備えた、間接および直接超音波処理用の超音波装置を提供しています。
もちろん、例えば液相合成に用いる大型の撹拌式ガラス反応器にも、あらゆるサイズの超音波プローブ（ソノトロードまたは超音波ホーンとも呼ばれます）を簡単に取り付けられます。
- さまざまな種類の超音波装置
- 直接および間接超音波処理
- 精密な強度制御
- 精密な温度制御
- 連続またはパルス超音波
- スマート機能、プログラム可能な装置
- あらゆる容量に対応
- 線形のスケールアップが可能
マルチウェルプレートやマイクロタイタープレートでの固相ペプチド合成には、UIP400MTPが最適な装置です。超音波キャビテーションが多数のサンプルウェルに間接的かつ均一に結合され、優れた物質移動と合成反応を実現します。下の動画で、 マイクロプレート用超音波装置UIP400MTPの動作をご覧ください！
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Hielscher Ultrasonicsは、実験室、パイロット、産業規模での混合、分散、乳化、抽出用途に向けた高性能超音波ホモジナイザーを製造しています。
超音波ペプチド合成について知っておきたいこと
ペプチドとは？
ペプチドは、複数のアミノ酸がアミド結合、いわゆるペプチド結合を介してつながった化合物です。複雑な構造に結合すると – 通常は50個以上のアミノ酸から構成されます – これらの大型ペプチド構造はタンパク質と呼ばれます。ペプチドは生命に不可欠な構成要素であり、体内で多くの機能を果たします。
ペプチド合成はどのように行われるのか？
有機化学、分子生物学、生命科学において、ペプチド合成とはペプチドを生成するプロセスです。ペプチドは、あるアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のアミノ基との縮合反応によって化学的に合成されます。さまざまなアミノ酸側鎖との望ましくない副反応を避けるために、通常は保護基を用いる戦略が採用されます。
化学的な（in-vitro）ペプチド合成は、多くの場合、新たに加えるアミノ酸のカルボキシル基（C末端）を、伸長中のペプチド鎖のN末端に結合させることから始まります。このC-to-N合成とは逆に、生体内における長いペプチドの天然のタンパク質生合成は、反対方向に進みます。つまり、生合成では、新たに加えるアミノ酸のN末端が、タンパク質鎖のC末端に結合します（N-to-C）。
ペプチド合成の研究開発プロトコルの大半は固相法に基づいていますが、ペプチドの大規模な工業生産では液相合成法が用いられています。
ペプチド合成の現在の最先端技術とは？
SUS-SPPS（持続可能な超音波支援SPPS） では、各サイクルの工程をわずか二段階（カップリング／キャッピング／脱保護の組み合わせ＋一回の洗浄）に削減でき、溶媒消費量と時間を大幅に削減できることが示されています。（参照：Mottola et al., 2025）
超音波支援TAPS は新たな組み合わせであり、全合成（例えばlipobactin）で成功が実証されており、API製造に向けてCDMOによる検討が進められています。
超音波支援TAGGINGペプチド合成の利点をご覧ください！
連続処理 は、さらなる改善策として検討されています – シリル化タグ支援による連続ワンポット合成プラットフォームが報告されています。
この分野はグリーンケミストリーの原則に向かって進んでおり、超音波とTAPSはいずれも、溶媒使用量の削減、試薬投入量の低減、持続可能性の向上に貢献しています。
文献／参考文献
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonicsは、高性能の超音波ホモジナイザーを、 実験室用サイズ から 産業用サイズまで製造しています。