ハイスループットタンパク質消化によるプロテオミクスワークフロー

プロテオミクスは生物学的プロセスやシステムを理解するために不可欠な分野であり、タンパク質消化はそのワークフローにおいて重要なステップを形成している。従来、タンパク質の消化は、リジンとアルギニン残基のペプチド結合を特異的に加水分解するトリプシンのようなタンパク質分解酵素を用いて溶液中で行われてきた。このプロセスは、質量分析（MS）アプリケーションでのイオン化とフラグメンテーションに適したペプチドを生成する。しかし、従来の消化法では、完了までに12～24時間を要し、プロテオミクスワークフローにおいて大きなボトルネックとなっていた。
超音波処理は、分解時間を数時間から数分に劇的に短縮する強力な代替手段を提供します。Hielscher CupHorn、VialTweeter、96ウェルプレートソニケーターUIP400MTPなどの先進的なマルチサンプルソニケーターと組み合わせることで、超音波処理による高速ハイスループットのプロテオミクスが可能になります。これらの技術はワークフローを合理化し、再現性やデータの質を損なうことなく、サンプル前処理時間を短縮し、効率を高めます。

タンパク質消化における超音波エネルギーの役割

超音波処理では、集束した超音波を利用してキャビテーションを発生させ、局在化したマイクロバブルを崩壊させて強いせん断力を発生させる。この現象により、物質移動が促進され、酵素と基質との混合が促進され、タンパク質の構造が解きほぐされ、トリプシンのようなタンパク質分解酵素の切断部位が露出される。
その結果は？効率や再現性を損なうことなく、分解時間を大幅に短縮した。

超音波によるタンパク質分解：方法と結果

加速消化プロトコル

超音波アシスト分解は、タンパク質分解酵素と超音波エネルギーを組み合わせ、ワークフローを迅速化する。例えば、Hielscher UP200St-CupHorn（200W、26kHz）を用いると、消化ワークフローは以下のように進む：

1. 還元：タンパク質サンプル（0.5 mg/mL、20 µL）を炭酸水素アンモニウム緩衝液（12.5 mM）中、DTT（2 µL、110 mM）で処理する。50%の振幅で5分間超音波処理を行う。
2. アルキル化：IAA（2μL、400mM）を添加した後、同じ条件で超音波処理を繰り返す。
3. 消化：サンプルを希釈し、固定化トリプシンナノ粒子とインキュベートする。最後の超音波処理（5分）で消化が完了する。ペプチドは分離、乾燥され、MS分析用に保存される。

この超音波法は、総調製時間を12時間から30分以下に短縮する。加速されたプロセスにもかかわらず、ペプチドの収量と品質は従来のオーバーナイト法と変わらない。

超音波によるタンパク質消化の効率性

大腸菌プロテオームを用いた比較研究：

• タンパク質の同定： 超音波消化したサンプルでは、5分で777個のタンパク質が同定されたが、12時間では817個であった。共有タンパク質の同定率は70％を超えた。
• 再現性： 反復分析では、各手法において98％以上の相関値が示され、信頼性が実証された。
• 選択性： ある種のタンパク質は、各方法で優先的に消化され、超音波消化では65のタンパク質が、オーバーナイト消化では54のタンパク質が好まれた。このような微妙な違いは、特定の用途における超音波処理のユニークな可能性を強調するものである。

大腸菌にスパイクした7種類のタンパク質のラベルフリー定量結果
サンプル。以下のタンパク質は、カラムに記載されているように、2つの異なるレベルで添加された。
テオ比」と名付けられた。セオ・レシオとは、このテストで使用される2つのレベルの理論的な比率のことである。
実験ウシ血清アルブミン（ALBU）、β-ラクトグロブリン（LACB）、α-S1カゼイン（CASA1）、
α-S2カゼイン（CASA2）、シトクロムc（CYC）、オバルブミン（OVAL）、炭酸脱水酵素2
(CAH2）。比はMaxQuantから得られたLFQタンパク質強度を用いて計算した。
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
研究とグラフィック：© Martins et al, 2019)

ナノ粒子固定化トリプシン

固定化トリプシンナノ粒子（例えばT-FMNP）を超音波処理と統合することで、プロテオミクスワークフローがさらに向上する。これらのナノ粒子は、酵素-基質相互作用のための高い表面積を提供し、効率を高める。大腸菌のような複雑なプロテオームに適用すると、この組み合わせ法は達成される：

• スピードだ： 5分以内に完全に消化される。
• 正確さ： Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• スケーラビリティ： UIP400MTPのようなマルチウェルプラットフォームへの適応は、ハイスループット処理を可能にする。

ステップ・バイ・ステップの詳細なプロトコルはこちらをクリック！
(参照：Martins et al.）

Hielscher社製ソニケーターによる高速ハイスループットでのタンパク質分解

プロテオミクスに最適なソニケーターモデル

Hielscher Ultrasonicsは、ハイスループットなワークフローを促進する、複数サンプルの同時前処理用の様々なソニケーターモデルを提供しています。バイアル、試験管、マルチウェルプレート（例：6、24、96ウェルプレート）、ペトリ皿のいずれでも使用できます。 – お客様の実験に最適なソニケータを提供します。

UIP400MTP マルチウェルプレートソニケーター

究極のスループットを実現するUIP400MTPは、96ウェルプレートを超音波処理する機能を備えています。あらゆる標準的なマイクロプレートに対応するUIP400MTPは、高価な専用ディスポーザブルを必要とせず、研究に最適なマルチウェルプレートを自由に選択できます。プレート全体に均一なエネルギーを供給することで、わずか1時間で最大200種類の複雑なプロテオームを迅速に還元、アルキル化、消化することができます。このレベルの自動化と効率は、ハイスループットのプロテオミクスと臨床応用に不可欠です。 マルチウェルプレートソニケーターについて詳しくはこちら！

バイアルツイーター

VialTweeterは、最大10本のバイアルまたは試験管を同時に超音波処理する必要がある研究室向けに設計されています。非侵襲的なアプローチにより、クロスコンタミネーションのリスクを排除すると同時に、再現性の高いタンパク質分解を実現します。この装置は、限られたサンプル量や多様な種類のサンプルを扱う研究者に最適です。
VialTweeterマルチ・チューブ・ソニケーターの詳細はこちら！

Hielscher UP200St-カップホーン

CupHornソニケーターは、密閉容器内の複数のサンプルを同時に処理するために設計された強力な装置です。均一な超音波エネルギー分布と正確な温度制御を保証します。最大5サンプルを同時に処理できる能力と、還元、アルキル化、消化ワークフローとの互換性により、CupHornはMSベースのプロテオミクスにおいて信頼性の高いツールとなっています。
CupHorn SonoReactorの詳細はこちら！

ナノ粒子固定化トリプシンを用いた超音波アシストタンパク質分解プロトコール

Martinsら（2019）によるこのプロトコールは、超音波エネルギーとナノ粒子固定化トリプシン（T-FMNP）を用いた迅速なタンパク質消化に最適化されている。概説されたステップにより、質量分析（MS）アプリケーションに適した効率的な還元、アルキル化、タンパク質分解が保証される。
プロトコルの手順

1. ジスルフィド結合の還元
   • AmBicバッファー中の20 µLのタンパク質サンプル（0.5 mg/mL）に2 µLのDTT溶液（110 mM）を加える。
   • サンプルチューブをソノリアクターUP200St-CupHornにセットします。
   • 試料を50％の振幅で2.5分間超音波処理する（200 W、26 kHz）。
   • 冷却のために短時間休止し、同じ条件でさらに2.5分間超音波処理を行う。
2. 還元システイン残基のアルキル化
   • 2μLのIAA溶液（400mM）を還元タンパク質サンプルに加える。
   • アルキル化を促進するため、50％の振幅で2.5分間ソニケートする。
   • 冷却のために一時停止し、さらに2.5分間超音波処理を行う。

   注意：IAAの分解を防ぐため、アルキル化サンプルの光への暴露は最小限に抑える。

3. サンプル希釈
   • 4%アセトニトリル(v/v)を含む25 mM AmBicバッファーで、アルキル化タンパク質サンプルを最終容量100 µLに希釈する。
   • 穏やかにピペッティングして十分に混ぜる。
4. ナノ粒子固定化トリプシンを用いたタンパク質分解消化
   • 希釈したタンパク質サンプルにT-FMNP溶液（3 mg/mL）を20 µL加える。
   • ソノリアクター内の混合物を50％の振幅で2.5分間超音波処理する。
   • 冷却のために一時停止し、同じ条件でさらに2.5分間超音波処理を行う。
5. トリプシンナノ粒子の分離
   • 磁石を使って、消化ペプチドを含む上清からT-FMNPを分離する。
   • 上清を新しい微量遠心チューブに移す。
6. MS分析用ペプチドの調製
   • ペプチドを含む上清を真空遠心機で乾燥させる。
   • 乾燥ペプチドは、質量分析でさらに分析するまで-20℃で保存する。