ハイスループットのタンパク質消化を用いたプロテオミクスのワークフロー

プロテオミクスは、生物学的なプロセスやシステムを理解するために不可欠な分野であり、タンパク質消化はそのワークフローにおける重要な工程です。従来、タンパク質消化は、リシン残基とアルギニン残基の位置でペプチド結合を特異的に加水分解するトリプシンなどのタンパク質分解酵素を用いて、溶液中で行われています。このプロセスでは、質量分析（MS）におけるイオン化やフラグメンテーションに適したペプチドが生成されます。しかし、従来の消化法は完了までに12–24時間を要し、プロテオミクスのワークフローに大きなボトルネックを生じさせています。
超音波処理は有力な代替手段であり、消化時間を数時間からわずか数分へと劇的に短縮します。Hielscher CupHorn、VialTweeter、96ウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTPなどの先進的な複数サンプル用超音波処理装置と組み合わせることで、超音波処理は高速かつハイスループットのプロテオミクスを可能にします。これらの技術はワークフローを効率化し、再現性やデータ品質を損なうことなく、サンプル調製時間を短縮して効率を高めます。

タンパク質消化における超音波エネルギーの役割

超音波処理は、集束超音波を用いてキャビテーションを発生させます。これは、局所的に生じた微小気泡が崩壊し、強いせん断力を発生させる現象です。この現象は物質移動を促進し、酵素と基質の混合を進めるとともに、タンパク質の構造をほどいて、トリプシンなどのタンパク質分解酵素が切断部位に接近できるようにします。
その結果、効率や再現性を損なうことなく、消化時間が大幅に短縮されます。

超音波で促進するタンパク質分解酵素による消化：方法と結果

高速消化プロトコル

超音波支援消化は、タンパク質分解酵素と超音波エネルギーを組み合わせてワークフローを高速化します。例えば、Hielscher UP200St-CupHorn（200 W, 26 kHz）を使用する場合、消化ワークフローは次のように進みます。

1. 還元：炭酸水素アンモニウム緩衝液（12.5 mM）中のタンパク質試料（0.5 mg/mL, 20 µL）をDTT（2 µL, 110 mM）で処理します。振幅50%で5分間、超音波処理を行います。
2. アルキル化：IAA（2 µL, 400 mM）を添加した後、同じ条件で超音波処理を繰り返します。
3. 消化：試料を希釈し、トリプシンを固定化したナノ粒子とともにインキュベートします。最後に超音波処理（5分間）を行い、消化を完了させます。ペプチドを分離し、乾燥させ、MS分析用に保存します。

この超音波法は、総調製時間を12時間から30分未満に短縮します。プロセスが高速化されても、ペプチドの収量と品質は従来の一晩かける方法と同等に維持されます。

超音波によるタンパク質消化の効率

E. coliのプロテオームを用いた比較研究では、次の結果が得られています。

• タンパク質同定： 超音波で消化した試料では5分間で777種類のタンパク質が同定されたのに対し、12時間の消化では817種類が同定されました。両方法で共通して同定されたタンパク質は70%を超えました。
• 再現性： 反復分析では、各方法内の相関値が98%を超え、信頼性が示されました。
• 選択性： 各方法で特定のタンパク質が優先的に消化され、超音波消化では65種類、一晩の消化では54種類のタンパク質が優先されました。このような微妙な違いは、特定の用途における超音波処理独自の可能性を示しています。

E. coli試料に添加した七種類のタンパク質のラベルフリー定量結果。
以下のタンパク質を、
「Theo Ratio」という列に示す二つの異なる濃度で添加しました。Theo Ratioは、この
実験で使用した二つの濃度の理論比です。ウシ血清アルブミン（ALBU）、β-ラクトグロブリン（LACB）、α-S1カゼイン（CASA1）、
α-S2カゼイン（CASA2）、シトクロムc（CYC）、オボアルブミン（OVAL）、炭酸脱水酵素2
（CAH2）。比は、MaxQuant解析で得られたLFQタンパク質強度を用いて
算出しました。各方法で得られた値を比較するため、スチューデントのt検定を適用しました（p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6）。
研究および図：© Martins et al., 2019)

ナノ粒子に固定化したトリプシン

トリプシンを固定化したナノ粒子（例：T-FMNPs）と超音波処理を組み合わせることで、プロテオミクスのワークフローがさらに改善されます。これらのナノ粒子は、酵素と基質の相互作用に利用できる大きな表面積を提供し、効率を高めます。E. coliなどの複雑なプロテオームに適用すると、この組み合わせによって次のことが実現します。

• 速度： 5分以内に消化が完了します。
• 正確性： 従来の方法と同等のタンパク質定量が得られます（p > 0.01, n=3）。
• スケーラビリティ： UIP400MTPなどのマルチウェルプラットフォームに適応させることで、ハイスループット処理が可能になります。

手順を段階ごとに説明した詳細なプロトコルは、こちらをご覧ください！
（参照：Martins et al., 2019）

Hielscherの超音波処理装置による高速かつハイスループットのタンパク質分解酵素による消化

プロテオミクスに最適な超音波処理装置のモデル

Hielscher Ultrasonicsは、複数サンプルを同時に調製し、ハイスループットのワークフローを促進するさまざまな超音波処理装置のモデルを提供しています。バイアル、試験管、マルチウェルプレート（例：6、24、96ウェルプレート）、ペトリ皿のいずれを使用する場合でも、実験に最適な超音波処理装置をご提供します。

マルチウェルプレート用超音波処理装置UIP400MTP

最高の処理能力を実現するため、UIP400MTPは96ウェルプレートを超音波処理する機能を備えています。あらゆる標準マイクロプレートに対応するUIP400MTPは、高価な専用使い捨て消耗品を必要とせず、研究に最適なマルチウェルプレートを自由に選択できます。プレート全体に均一なエネルギーを供給することで、わずか1時間で最大200の複雑なプロテオームの還元、アルキル化、消化を迅速に行えます。この水準の自動化と効率は、ハイスループットのプロテオミクスや臨床用途にとって極めて重要です。 マルチウェルプレート用超音波処理装置の詳細をご覧ください！

VialTweeter

VialTweeterは、最大10本のバイアルまたは試験管を同時に超音波処理する必要がある研究室向けに設計されています。非侵襲的な方式により、交差汚染のリスクを排除しながら、再現性のあるタンパク質消化を確保します。この装置は、限られた試料量や多様な試料の種類を扱う研究者に最適です。
複数チューブ用超音波処理装置VialTweeterの詳細をご覧ください！

Hielscher UP200St-CupHorn

CupHorn超音波処理装置は、密閉容器内の複数の試料を同時に処理するために設計された強力な装置です。均一な超音波エネルギー分布と精密な温度制御を確保します。最大五つの試料を同時に処理できる能力と、還元、アルキル化、消化を含むワークフローへの適合性を併せ持つCupHornは、MSに基づくプロテオミクスにとって信頼性の高いツールです。
CupHorn SonoReactorの詳細をご覧ください！

ナノ粒子に固定化したトリプシンを用いる超音波支援のタンパク質分解酵素による消化の段階別プロトコル

Martins et al. (2019)によるこのプロトコルは、超音波エネルギーとナノ粒子に固定化したトリプシン（T-FMNPs）を用いて、タンパク質を迅速に消化するために最適化されています。以下の手順により、質量分析（MS）用途に適した効率的な還元、アルキル化、タンパク質分解が確実に行われます。
プロトコルの手順

1. ジスルフィド結合の還元
   • AmBic緩衝液中の20 µLのタンパク質試料（0.5 mg/mL）に、2 µLのDTT溶液（110 mM）を添加します。
   • 試料チューブを超音波リアクターUP200St-CupHornに入れます。
   • 振幅50%（200 W, 26 kHz）で試料を2.5分間、超音波処理します。
   • 冷却のために短時間休止した後、同じ条件でさらに2.5分間、超音波処理します。
2. 還元されたシステイン残基のアルキル化
   • 還元されたタンパク質試料に、2 µLのIAA溶液（400 mM）を添加します。
   • アルキル化を促進するため、振幅50%で2.5分間、超音波処理します。
   • 冷却のために休止した後、さらに2.5分間、超音波処理します。

   注：IAAの分解を防ぐため、アルキル化した試料の光への曝露を最小限に抑えてください。

3. 試料の希釈
   • 4%のアセトニトリル（v/v）を含む25 mMのAmBic緩衝液を用いて、アルキル化したタンパク質試料を最終体積100 µLに希釈します。
   • 穏やかなピペッティングで十分に混合します。
4. ナノ粒子に固定化したトリプシンによるタンパク質消化
   • 希釈したタンパク質試料に、20 µLのT-FMNP溶液（3 mg/mL）を添加します。
   • 超音波リアクター内で混合液を振幅50%で2.5分間、超音波処理します。
   • 冷却のために休止した後、同じ条件でさらに2.5分間、超音波処理します。
5. トリプシンを固定化したナノ粒子の分離
   • 磁石を用いて、消化で得られたペプチドを含む上清からT-FMNPsを分離します。
   • 上清を新しい微量遠心チューブに移します。
6. MS分析用のペプチド調製
   • ペプチドを含む上清を真空遠心機で乾燥させます。
   • 質量分析による追加分析を行うまで、乾燥したペプチドを-20°Cで保存します。